酵母双杂交自激活现象
组蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用检测
人CDK2-AP1(DOC-1)酵母双杂交诱饵质粒自激活作用鉴定
Ｃ Ａ Ｏ Ｌ ｉ － ｘ ｕ ｅ Ｊ ｌ Ｎ Ｗ ｅ ｉ ， Ｚ Ｈ Ｅ ＮＧＪ ｕ ｎ ， Ｌ Ｉ Ｊ ｉ ａ ｎ — Ｄ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆＯ ｒ ａ ｌ ａ ｎ ｄ Ｍａ ｘ ｉ ｌ ｌ ｏ ｆ ａ ｃ ｉ ａ ｌ Ｓ ｕ ｒ ｇ ｅ ｒ ｙ ， Ｓ ｗｍ ａ ｔ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ， Ｆ ｏ ｕ ｒ ｔ ｈ
ｈ ｙ ｂ ｉ ｒ ｄ ｓ ｖ ｓ ｔ ｅ ｍ ａ ｎ ｄ ｔ ｏ ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｔ ｈ ｅ ｐ ｏｔ ｒ ｅ ｉ ｎ ｔ ｈ ａ ｔ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ａ ｃ ｔ ｓ ｗ ｉ ｔ ｈ ｐ １ ２ Ｄ ０ ｃ 。 ‘ ｃ ０ Ｋ ２ ‘ Ａ Ｐ １Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｔ ｈ ｅ ｂ ａ ｉ ｔ ｐ ｌ ａ ｓ ｍｉ ｄ ｐ ＢＤ． Ｄ ＯＣ． １ ｗ ａ ｓ
倪 前伟 孙 沫逸 戴 建武 韩津 曹立 雪 金 伟 郑军 李建虎
【 摘要 】 目的 验证诱饵质粒 ｐ Ｂ Ｄ — Ｄ Ｏ Ｃ 一 １ 在酵母双杂 交系统 的 自 激 活性及毒性 作用 ， 为应用 酵母双杂交 系
统（ ｙ ｅ ａ ｓ ｔ ｔ ｗ ｏ — ｈ ｙ ｂ ｉ ｒ ｄ ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ） 筛选与 ｐ １ ２ 。 ｃ Ｄ Ａ Ｐ 相互作用 的蛋 白建立实验基 础。方法 将诱饵质粒 ｐ Ｂ Ｄ — Ｄ Ｏ Ｃ 一 １ 转化到酵母细胞 ＭＡ Ｖ ２ ０ ３中， 检测诱饵蛋 白有无毒性和 自激 活作用 。同时利用 对照质粒组筛选 组氨酸 （ Ｈ ｉ ｓ ） 本 底 表达抑 制剂 ３ Ａ Ｔ（ ３ 一 氨 基． １ ， ２ ， ４ 一 三唑） 的合适 工 作浓 度 。结 果 诱 饵 质粒 ｐ Ｂ Ｄ ・ Ｄ Ｏ Ｃ — ｌ成 功转 化 到 酵母 细 胞 ＭＡ Ｖ ２ ０ ３中， 对宿 主酵母细胞无毒性 ， 对报告基 因无 自激 活作用 。确定 了组氨酸 （ Ｈｉ ｓ ） 本底 表达抑制 剂 ３ Ａ Ｔ（ ３ ・ 氨 基． １ ， ２ ， ４ ． 三唑 ） 的合适工作浓度。结论 诱饵 质粒 ｐ Ｂ Ｄ — Ｄ Ｏ Ｃ 一 １ 可 以用于酵母 双杂交实验 ， 为进一步运用酵。
酵母双杂（共转）
酵母双杂（共转）酵母双杂交的原理及实验步骤吴健2015.12.25一酵母双杂交的原理在酵母细胞中，有半乳糖存在的情况下，GAL4 可以激活半乳糖代谢酶GAL1的转录。
GAL4 蛋白包含两个结构域，单独的N 端的结构域(BD)可以特异地结合DNA 但是不能够激活转录；单独的C 端包含一个激活区域（AD）但是如果不能结合到17-mer 上游激活序列USA G 也不能激活转录。
将来自大肠杆菌的LecA DNA 结合域BD 和酵母的GAL4 转录激活域AD 重组后，在酵母中实现了下游基因的转录激活。
说明转录因子的BD 和AD 功能域可相互独立地发挥各自的作用，并且在重组后仍然具有基因转录的活性(Brent and Ptashne, 1985)。
酵母双杂交系统就是在这一分子基础上开发出来的，GAL4 的BD 和AD，分别与能够互作的蛋白X 和Y 融合表达。
由于XY 蛋白的结合，实现了GAL4 的BD 和AD 重组，GAL4 就重新获得了转录活性，转录因子就可以驱动报告基因表达(Fields and Song, 1989)。
除了将两个杂合载体BD-X 或AD-Y 转化入同一酵母细胞外，利用两个不同性别的酵母杂交（mating）也是实现BD 和AD 蛋白重组和蛋白互作检测的有效方法(Bendixen et al., 1994)。
Fig1. 酵母双杂原理图Fig2. 常用两种酵母菌的基因型Fig3. 常用两种酵母菌的报告基因Fig4. 常用AD和BD载体图Fig5. 酵母双杂流程图二酵母双杂交的基本步骤1 酵母感受态的制备配制培养酵母YPAD 培养基，以及筛选和转化酵母的SD 培养基，灭菌备用。
1) 用灭菌的接种环从保存的菌种中挑取一小块，在YPAD 培养基上划线分离单菌落，在30℃培养箱中倒置培养 3 d 活化菌种；2) 用灭菌的接种环挑取一个2-3 mm，生长时间小于一个月的单克隆到3 ml 的YPAD 培养基中，剧烈震荡1 min，打散所有的细胞块，30℃震荡培养8 h；3) 接种5 μl 的培养物到含有50 ml YPAD 的250 ml 的烧瓶中，30℃，250 r/min 震荡培养20 h，直到OD 600 =0.3；4) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用100 ml 的YPAD 重悬细胞块，30℃230-250 r/min 震荡培养3-5 h，直到OD 600 =0.4-0.5；5) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用60 ml 的灭菌的dd H2O 重悬细胞块；6) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用3 ml 的1.1×TE/LiAc 溶液重悬细胞块；7) 将上清分装到2 个无菌的1.5 ml 的离心管，室温13200 g 离心15 sec；8) 去除上清，用600 μl 1.1×TE/LiAc 溶液悬浮细胞块，感受态制备完成。
蛋白的酵母双杂交实验原理及其应用
ds cDNA
在酵母体内利用同源重组 形成完整的质粒3、从cDNA筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白
方法1：将转化诱饵表达）进行mating，然后将mating产物涂SD/-Trp-Leu平 板。随后挑取直径在2-3mm的菌落划线接种在SD/-Ade-His-Trp-Leu/X-
GAL 1 UAS
Promoter
reporter gene
图1 转录因子活化示意图
目前使用的酵母双杂交系统有LexA系统和Gal4系统两种： 1、LexA系统。BD由一个完整的原核蛋白LexA构成，AD由一个88个aa的酸 性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录；
2、Gal4系统。BD和AD分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域（1-147aa与
HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已之间的联系，建 立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢
途径等有重要意义。 Dyer等通过酵母双杂交技术，绘制出了人与致病性
细菌蛋白间相互作用的基因组蛋白网络连锁图，为深入研究人与致病菌间 的相互作用关系奠定了基础（见图4）。
、SD/-His-Trp/x-α-Gal、SD/-Trp-Leu/x-α-Gal平板上划线，观察
菌落的生长情况和颜色变化。 （2）毒性的检测
挑取一个直径2-3mm的克隆于5mL SD/-Trp液体培养基中培养过夜，
检测其OD600nm。若OD600nm≧0.8，表明没有毒性；若OD600nm＜0.8，表 明诱饵蛋白对酵母细胞有毒性。 只有当诱饵表达载体对报告基因无自激活作用，同时诱饵蛋白对宿 主细胞无毒性作用时才能用于酵母双杂交实验。否则只能重新构建诱饵 表达载体。
Synphilin-1，并证明了Synphilin-1 与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的
酵母双杂实验操作手册和注意事项
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。
很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。
这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。
基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。
后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。
酵母杂交实验常见问题——单杂知识及自激活检测篇
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DLX4基因酵母双杂交系统的构建及自激活检测
DLX4基因酵母双杂交系统的构建及自激活检测乔勤勤;孙云燕;陈玲玲;陆萌;丰有吉【摘要】目的构建DLX4酵母双杂交系统并鉴定其自激活作用.方法构建人胎盘酵母双杂交cDNA文库,并行PCR鉴定;构建3条DLX4诱饵质粒,包括pDEST32-DLX4(4-1C)、pDEST32-DLX4(4-1N)和pDEST32-DLX4(4-2);将DLX4诱饵质粒转入酵母MaV203菌株,并检测其在酵母细胞中有无自激活作用.结果 PCR证实成功构建了人胎盘酵母双杂交文库;3条DLX4诱饵质粒中,pDEST32-DLX4(4-2)和pDEST32-DLX4(4-1C)没有自激活作用,可用于文库筛选.结论成功构建了酵母双杂交文库和DLX4诱饵质粒,可用于筛选与DLX4相互作用的蛋白.【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2010(030)012【总页数】4页(P1509-1512)【关键词】DLX4;酵母双杂交;克隆【作者】乔勤勤;孙云燕;陈玲玲;陆萌;丰有吉【作者单位】上海交通大学附属第一人民医院妇产科,上海,200080;上海交通大学附属第一人民医院妇产科,上海,200080;上海交通大学附属第一人民医院妇产科,上海,200080;上海交通大学附属第一人民医院妇产科,上海,200080;上海交通大学附属第一人民医院妇产科,上海,200080【正文语种】中文【中图分类】R711.71DLX4属于同源异型盒转录因子家族，该家族典型的特征是包含由60个氨基酸组成的同源异型结构域(homeodomain)，此结构域能特异性地与DNA元件结合，激活或抑制下游基因的表达，从而实现其转录调控。
我们前期研究[1]显示，DLX4在子前期胎盘组织中的表达明显低于正常妊娠对照组，而且在缺氧培养的滋养细胞株中，其表达也显著降低。
DLX4在子前期中发生作用的信号通路目前尚不清楚，因而需要寻找与之相互作用的蛋白，为其功能的研究提供线索。
酵母双杂交技术1
发展背景
酵母双杂交系统是由Fields等在1989年提出的一种在活细 胞中鉴定蛋白质相互作用的遗传系统。
酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始
过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录因子都是由 两个可以分开的、功能上相互独立的结构域组成的。
酵母双杂交系统是一种在酵母细胞内分析 蛋白质相互作用的技术。 它可用于： 检验蛋白质间的相互作用； 分析蛋白质相互作用的结构域； 发现新的作用蛋白质。
酵母双杂交技术的原理
基于对真核生物基因调控转录起始过程的认识。 基因转录不仅需要有特定的DNA顺式序列结构，而且也需 要有反式转录激活因子的参与。 转录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构 成,其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, DB)和转录激活 结构域(activation domain, AD), 它们都是能激活基因转录，但不同转录激活因子 的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。
酵母双杂交操作主要流程
1. 2. 3. 4. 5. 6. 分别构建BD和AD融合蛋白载体 分别将重组载体转化酵母菌细胞 对酵母转化子进行自激活检测 将重组载体共转化酵母菌细胞 检测报告基因表达产物 分析酵母双杂交实验结果
酵母双杂交技术的优点：
1. 是一种细胞内蛋白质相互作用研究技术，比体外的蛋白 质相互作用技术更接近生物体内的真实情况。
如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两 个蛋白分别与DB和AD形成的融合蛋白。 与DB 融合的蛋白称为“诱饵”(bait)， 与AD融合的蛋白称为“猎物”(prey)。 如果这两个蛋白能发生相互作用, 这两个融合蛋白上的 DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活报告 基因(reporter gene)的转录与表达。通过检测报告基因的 表达产物, 可判别“诱饵”和“猎物”这两个蛋白质之间是 否存在相互作用。
橡胶树14-3-3蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测
１ Ｃ ｌ ｇ ｆＡｇｏｏ ，Ｈａｎｎ Ｕ ｉ ｒｉ，Ｈａｋ ｕ ５ ０ ２ ｏｌ ｅ ｏ ｒｎｍｙ ｅ ｉａ ｎｖ ｓｔ ｅ ｙ ｉｏ ７ ２ ８ ２Ｋ ｙ ｌ ｏａ ｒ ｏ ｒ ｉ ｌＣｏ ｉ ｅｈ ｏ ｇ， ｎ ｔ Ａ ｒ ｕ ｕｅ Ｉ ｔｕ ｒ ｉ ｌ ｉ ｃ ｎ ｅ ｅ ｂ ｒ ｏ Ｔｏ ｃ ｒ Ｂｏ ｃｎ ｌ ｙ Ｍｉ ｓ ｙ ｏ ｇｉ ｌ ｒ ｎ ｉ ｔ ｏ Ｔ ｐｃ ｏ ｉ ｃ ａ ｔｙｆ ｐａ ｐ ｔ ｏ ｉｒ ｆ ｃ ｔ ， ｓ ｔ ｅｆ ｏ ａ Ｂ ｓ ｅ ａｄ Ｂｏｅｈ ｏｏｙ ｈｎ ｓ ａ ｅ ｒ ｉａ Ａ ｒ ｕ ｕａ Ｓｉｎｅ，Ｈａ ｏ ７１ １ ｎ ｉ ｃ ｎｌｇ，Ｃ ｉｅｅＡｃｄ ｍｙｏ Ｔｏ ｃｌ ｇｉ ｈ ｒ ｃ ｃｓ ｉ ｕ ５ １ ０ ｔ ｆ ｐ ｃ ｌ ｅ ｋ
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热 带 作 物学 报 ２ １ ，３ （ ） ４ — ４ ０ １ ２ ２ ：２ ０ ２ ４
Ｃ ｉ ｅｅ Ｊ ｕ ａ ｆＴ ｏ ｉａ ｏ ｈ ｎ ｓ ｏ ｍ ｌｏ ｒｐｅ ｌＣｒ
橡胶树 １ — — ４ ３ ３蛋 白基 因的酵 母双 杂交诱饵载体 的 构 建及 自激活和 毒性检测
杨 子平 一，李 辉 亮 ｚ ，郭 冬 ，彭 世 清
酵母双杂实验步骤
2.1.1 酵母双杂交2.1.1.1 Gateway入门克隆设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TTG-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TTG-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。
其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。
通过PCR扩增获得带有attB位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。
获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下：将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。
进行BP反应时，需注意以下几项：(1) 对于BP反应来说，最高效的是采用线性的attB-PCR产物和超螺旋的attP入门载体；(2) 为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的；(3) 提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物最好不要超过250ng。
酵母双杂交自激活
蛋白质相互作用在细胞生物学和疾病中的作用。
此外，酵母双杂交系统还可以用于筛选新的药物靶点或鉴定新
03
的治疗策略。
酵母双杂交系统的优缺点
优点
酵母双杂交系统具有高灵敏度和特异性，能够检测到低亲和力的相互作用。此外 ，它还具有高通量和高可重复性的特点，可以同时检测多个蛋白质之间的相互作 用。
缺点
然而，酵母双杂交系统也存在一些局限性。例如，它可能受到酵母细胞内其他因 素的影响，导致假阳性结果。此外，由于酵母细胞与人类细胞存在差异，因此某 些在酵母细胞中检测到的相互作用可能无法在人类细胞中重现。
蛋白质的相互作用可以通过多种方式进 在酵母双杂交实验中，了解蛋白质之间 行，例如通过蛋白质的直接接触或通过 的相互作用有助于预测自激活的可能性， 与它们相关的其他分子之间的相互作用。 并采取措施避免或减少这种现象的发生。
基因表达水平的影响
基因表达水平对酵母双杂交自激活也有重要影响。当一个基因的表达水平过高时， 它可能会产生过多的蛋白质，导致自激活。
2
该系统基于两种基本的酵母转录因子，即GAL4 和STE12，它们可以分别与DNA结合并激活转录。
3
当一个转录因子与另一个转录因子结合时，它们 可以形成一个杂合二聚体，从而激活转录。
酵母双杂交系统的应用
01
酵母双杂交系统被广泛应用于研究蛋白质之间的相互作用，特 别是在信号转导和转录调控领域。
02
它可以帮助科学家确定蛋白质相互作用的结构基础，以及研究
酵母双杂交自激活
目录
• 酵母双杂交系统简介 • 酵母双杂交自激活的发现与确认 • 酵母双杂交自激活的影响因素
目录
• 酵母双杂交自激活的调控策略 • 酵母双杂交自激活的实际应用 • 未来展望与研究方向
蛋白相互作用酵母双杂交
Protein-protein Interaction
• 蛋白质之间相互作用以及通过 相互作用而形成的蛋白复合物 是细胞各种根本功能的主要完 成者。
• 几乎所有的重要生命活动，包 括DNA的复制与转录、蛋白质 的合成与分泌、信号转导和代 谢等等，都离不开蛋白质之间 的相互作用。
Slide 3
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测序正确的质粒转化酵母
Transformation of Competent Yeast Cells:
我们采用的是PEG/ LiAc法转化酵母。 PEG是一种高分子聚合物, 在酵母
1. 参加质粒DNA
100- 转化中起到在高浓度醋酸锂环境中
500ng
保护细胞膜,减少醋酸锂对细胞膜构 造的过度损伤,同时促进质粒与细胞
Co-Immunoprecipitation co-localization
(Co-IP)
FRET (Fluorescence
Pull-Down Assays Far Western
Resonance Energy Transfer)
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噬菌体展示技术的原理
基因型
(GST-Fusion)
G(SGTST)
MAVS
GST
GST
MAV S
RIGI
RIGI
GST
Wash SDS-PAGE
GST沉降示意图
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Cross-linking
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报告内容： 蛋白相互作用与研究方法 酵母双杂交原理和方法 酵母双杂交的开展 已有实验的进展 存在问题与下一步方案
x ul
Purified PCR Fragment(10-200ng) x ul 15min。
酵母双杂交
100 = %二倍体
16、用灭菌的牙签或者黄枪头将长在 DDO/X/A 的蓝色菌落挑至更加严格的 QDO/X/A 平板上。 17、所有的 QDO/X/A 阳性相互作用必须做进一步的分析，以确定重复数并验证真正的 分析以消除重复克隆 1、 用 Matchmaker Inse； 分析； 4、 为了尽快验证克隆，回收纯化 PCR 产物并用 T7 引物进的转化可以包含一种以上的相 DDO/X 平板mid Isolation Kit 提取长于 QDO/X 上的酵母质粒。 如果诱饵质粒是用 pGBKT7（带卡纳抗性基因）克隆的，可以用带有 10C．除去假阳性，识别真阳性 1、材料 足够的 Y2HGold 细胞 SD/-Leu/-Trp/X-a-Gal 平板=DDO/X SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA=QDO/X/A 2、共转一下质粒： pGBKT7/Bait + Prey Empty pGBKT7 + Prey 3、取稀释 10 倍，100 倍的混合液 100ul 涂板： DDO/X QDO/X/A 4、30℃培养 3-5 天后的预期结果： a．真阳性 样品 Bait + candidate prey Empty pGBKT7 + candidate prey 平板 DDO/X QDO/X/A DDO/X QDO/X/A 明显的 2mm 菌落 yes yes yes no 颜色 蓝 蓝 白 N/A
诱饵蛋白的自激活检测
1、材料 克隆好的 pGBKT7-bait 足够的 Y2HGold 细胞 SD/-Trp/X-a-Gal 平板 SD/-Trp/X-a-Gal/AbA 平板 2、转化 100ng pGBKT7-bait 至 Y2HGold 细胞。 3、涂板，100ul （稀释 10 倍和 100 倍） SD/-Trp = SDO SD/-Trp/X-a-Gal = SDO/X SD/-Trp/X-a-Gal/AbA = SDO/X/A 4、培养 3-5 天后预期的结果： 样品 诱饵蛋白自激活检测 诱饵蛋白自激活检测 诱饵蛋白自激活检测 阳性对照（之前） SDO SDO/X SDO/X/A DDO/X/A 选择性平板 明显的 2mm 菌落 Yes Yes No Yes 白 白或者很浅淡的蓝 N/A 蓝 颜色
AcMNPV e18基因酵母双杂交诱饵载体构建和转录自激活检测
AcMNPV e18基因酵母双杂交诱饵载体构建和转录自激活检测摘要：用PCR方法扩增苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）被膜蛋白ODV-E18基因，克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7构建诱饵质粒pGBKT7-e18。
将诱饵质粒分别转化酵母菌株Y187和AH109感受态细胞，被转化细胞在涂有X-gal的SD/-Trp营养缺陷型固体培养基上形成白色菌落；在SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade固体培养基上均不形成菌落，表明诱饵基因表达产物BD-E18在这两种细胞中都不能激活报告基因转录。
pGBKT7-e18转化的Y187细胞在SD/-Trp营养缺陷型液体培养基中的生长速度与空载体转化细胞相同，显示BD-E18对酵母细胞无细胞毒性。
结果表明，AcMNPV ODV-E18可能不直接参与对宿主细胞或病毒基因表达的调节，其编码基因可以作为诱饵基因通过筛查病毒宿主cDNA文库识别与其相互作用的蛋白质。
关键词：苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）；ODV-E18；酵母双杂交；自激活；细胞毒性苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）是α-属杆状病毒的代表种，感染30多种鳞翅目昆虫，是目前研究得最多的杆状病毒种[1]。
AcMNPV在其复制周期中产生两种结构和功能不同的病毒体：包含体源病毒体（ODV）和芽殖病毒体（BV）。
ODV和BV分别执行病毒在宿主种群个体间的传递和受感染虫体内的系统感染功能[2]。
这两种病毒体包含序列相同的基因组，但蛋白质组成存在差异。
目前已经鉴定出40多种AcMNPV ODV结构蛋白和相似数目的BV结构蛋白。
《酵母双杂交自激活》课件
利用酵母双杂交自激活技术揭示疾病 发生和发展过程中蛋白质相互作用机 制，为疾病诊断和治疗提供新思路。
利用酵母双杂交自激活技术检测生物 安全威胁和生物防御，为公共卫生安 全提供有力保障。
药物发现与筛选
通过酵母双杂交自激活技术筛选潜在 的药物靶点，发现新的药物候选分子 ，加速药物研发进程。
未来研究的方向与挑战
酵母双杂交自激活的实例分
03
析
实验材料与试剂
01 酵母菌株
用于表达不同蛋白的酵母 菌株。
03 重组蛋白
用于构建融合蛋白的蛋白
。
02 培养基
用于培养酵母菌株的培养
基。
04 抗体
用于检测融合蛋白的表达
和相互作用。
实验步骤与操作
构建融合蛋白
将目的蛋白与诱饵蛋白或检测蛋 白融合，构建成融合蛋白。
转化酵母细胞
实验流程
准备实验材料
选择适当的酵母菌株、质粒载体、酶、DNA 片段等。
构建融合蛋白
将目的蛋白与转录激活域或DNA结合域融合， 构建成融合蛋白表达载体。
转化酵母细胞
将融合蛋白表达载体转化入酵母细胞中。
筛选阳性克隆
通过抗生素筛选、PCR鉴定等方法筛选出成功转化 的阳性克隆。
检测报告基因表达
通过β-半乳糖苷酶活性检测、荧光素酶活性检测 等方法检测报告基因的表达水平。
THANKS
感谢观看
结果判断
根据实验结果，判断融合 蛋白之间是否存在相互作 用。
讨论
对实验结果进行深入讨论 ，分析可能的影响因素和 实验误差，提出改进措施 和未来研究方向。
酵母双杂交自激活的未来发
04
展与展望
酵母双杂交自激活技术的改进与创新
朊蛋白(prp23—231)酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测
体 ｐｏ 中 ， Ｓｓ 构建成为 ｐｏ — ｒ ３ ２ １为下一步利用酵 Ｓｓ ｐｐ — ３ ， ２ 母双杂交筛选 与 ｐｐ 在相互作用 的蛋 白质奠定 了基 ｒ存 础， 以便于进一步研究 ｐｐ的生理学功能 ， ｒ 以及 ｐｐ发生 ｒ
复存在了 ， 以传统的酵母双杂交系统不能筛选到与 ｐ 所 ｒ ｐ 存在相互作用 的这类 蛋 白质。本试验采用 的 Ｃｔ ｒ ｙ Ｔａ ｏ ｐ
酵母双杂交系统中所有的蛋 白间相互作用都发生在细胞 质中， 所以这个系统可 以称作是酵母细胞质双杂交系统，
氨基酸序列相同； 目前研究认为在某种诱 因存 在的条件
ｓｓ ｈ ｅ ｏ ｉ ｎ ａｔｖ ｃ ｏ Ｓ ｓ—ｐ ｐ ３－２ １ｏ ｅ ｓ ｏ ｂ ｅ—ｈ ｂ ｄ ｓ ｓｅ ｗ ｓ ｏ ｔ ｎ ｄ Ｔ ｅ ｐｐ ３～２ １ ｄ ｍａｎ ｏ ｕ ｅ ｉ ．ｔ ｅ ｒ ｃ ｍｂ ｎ ｔｂ ｉ ｅ ｔｒｐ ｏ ａ ｒ２ ３ ｆｙ ａ ｔｄ ｕ ｌ ｙ ｒ ｙ ｔｍ ａ ｂａ ｅ ． ｈ ｒ ２ ｉ ｉ ３ ｏ ｉ ｆｍｏ ｓ
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浅析酵母双杂交文库构建的方法
浅析酵母双杂交文库构建的方法酵母双杂交技术是分子生物学研究领域的重要实验手段，是利用酵母遗传学方法来分析蛋白质之间的相互作用，现在已被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域。
酵母双杂交文库构建一般包括核体系和膜体系两种方法。
核体系包含通过同源重组的方式实现文库的构建、根据Gateway的技术实现建库采用BP重组和LR重组分别获得初级文库与次级文库这两种方法。
膜体系是由酶切连接的方法实现建库，主要是基于分离的泛素介导膜蛋白互作信号的识别。
美迪西生物医药专业从事酵母双杂交，出具权威检测数据报告，具有独立优质实验室，专业实验人员，提供详细的酵母双杂交实验步骤，原始数据和图片，结果分析。
1、膜体系和核体系酵母双杂筛库的不同点筛库所用菌株不同，在通过共转方式筛库时，核体系使用Y2HGold酵母菌，膜体系使用NMY51菌株。
核体系除了可以选择共转筛库，还可以通过mating的方法进行。
Mating自然要用到两种性别的菌株，含有AD文库质粒的Y187和含有BD质粒的Y2HGold。
2、核体系和膜体系在整个实验的流程上的差异。
值得注意的是核体系酵母双杂中如果BD基因本身为转录因子时，可能存在自激活现象，因此在诱饵载体构建完成后首先要做的则是诱饵基因的自激活检测。
而膜体系酵母双杂，理论上由于诱饵蛋白被“挂”在细胞质膜上，在没有互作蛋白相互靠近时，泛素的两部分彼此分离，转录因子不会被切割，便不会导致报告基因表达。
而对于膜体系酵母双杂，因为诱饵蛋白在细胞膜上的跨膜方式不同，构建BD载体时选用的质粒不同。
基于此，在BD载体构建完成后，首先要做的是功能验证，亦即所构建的BD质粒是否适用于该系统。
下面是两种体系的筛库主要实验流程。
（1）核体系筛库实验流程（2）膜体系筛库实验流程（3）另外，在阳性克隆的筛选方法上两者亦不同。
核体系，因为报告基因中有MEL1，在有蛋白互作时，α-半乳糖苷酶被表达，即在含X-α-Gal的选择培养基上阳性菌落呈蓝色。
第一实验：酵母双杂交（YeastTwo-Hybrid）
第一实验：酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid）一、目的掌握酵母双杂交原理和方法。
利用酵母双杂交方法在拟南芥转录因子AP2-EREBP家族中筛选与拟南芥Med25有相互作用的蛋白。
二、原理酵母双杂交系统由 Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。
典型的真核生物转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain，DBD)和转录激活结构域(transcription-activating domain，AD)。
DNA结合结构域可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
二个结构域可在其连接区适当部位断开，仍具有各自的功能。
将两个待测蛋白分别与这两个结构域组成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与DBD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
图 1-1 酵母双杂交基本原理酵母双杂交系统在发展中增添了接合型酵母双杂交和反向酵母双杂交系统。
其中接合型双杂交系统就是已预先将文库转化了某个接合型的单倍体酵母，然后再和转化了诱饵质粒的相反接合型的单倍体进行接合，形成二倍体，并检测报告基因的表达。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与DBD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
酵母双杂交系统常应用在：(1)研究两个已知蛋白是否存在相互作用，同一蛋白是否有自身相互作用以及相互作用的分子区域。