无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
美罗培南无菌检查的方法学验证
美罗培南化学名称为： （ ４ Ｒ， ５ Ｓ ， ６ Ｓ ） 一 ３ － ［ ［ （ ３ Ｓ ， ５ Ｓ ） 一 ５ 一 （ 二 ＝ ： 甲基氨 甲酰基） 一 ３ 一 吡咯烷】 硫】 － ６ 一 【 （ １ Ｒ ） 一 １ － 羟 乙基卜４ 一 甲基一 ７ 一 氧一 １ 一 氮双环【 ３ ． ２ ． Ｏ ］ 庚一 ２ 一 烯一 ２ 一 羧酸三水合物。美罗培南为人工合成 的广谱碳青霉烯类抗生素 ， 容易穿透 大 多数革兰 阳性和阴性细 菌的细胞壁 ，而达到其作用靶点青霉素结合蛋 白 美罗培南与氨基糖苷类抗生素合用可产生协同作用ｌ １ 。 美罗培南适用于成人 和儿童由单一或多种对美罗培南敏感 的细菌引起的肺炎、 子宫 内膜炎、 皮肤 软组织感染、 败血症等。无菌检查法系用于检查药 典要求无菌 的药 品、 医疗 器具、 原料、 辅料及其他 品种是否无菌的一种方法［ ６ － １ ３ ］ 。本实验对美 罗培南无 菌检硷方法进行验证。 １ 试 验环 境 与 材料 １ ． １试验环境： 在环境洁净度为 Ｂ ＋ Ａ的无菌室中进行 。 ｌ ＿ ２仪器： Ｎ Ｋ Ｆ ３ ３ ０一次性全封 闭集菌培养器 （ 温州图旺生物技 术设备有 限公司） 、 ＨＴ Ｙ一 ６ ０ １智能集菌仪 （ 温州 图旺生物技术设备有限公司） 、 Ｈ Ｙ 一 ２ （ Ａ ） 调速 多用 振 荡 器 （ 东莞 康 润 仪器 设 备 有 限 公司 ） 、 Ｓ Ｐ Ｘ 一 ２ ５ ０智 能 生化 培 养 箱（ 北京北瑞达医药科技有限公司） 、 ＭＪ Ｘ一 １ ５ ０ Ｂ智能霉菌培养箱 （ 北京北瑞 达 医 药 科技 有 限 公 司） 、 Ｙ Ｘ Ｑ － Ｌ Ｓ 一 ３ ０ Ｓ Ｉ Ｉ 高 压 灭 菌锅 （ 西 安 常仪 仪 器 设 备 有 限
Ｉ ３试验用菌株 ： 生孢梭 菌［ Ｃ ＭＣ Ｃ（ Ｂ ） ６ ４ ９ ４ １ １ （ 第 ４代 （ 上海北诺生物科 技有限公司） 、 白色念珠菌ｌ Ｃ ＭＣ Ｃ（ Ｂ ） ９ ８ ０ ０ １ 】 （ 第 ４代） （ 上海北诺生物科技有 限公司） 、 金黄色葡萄球菌［ Ｃ ＭＣ Ｃ （ Ｂ ） ２ ６ ０ ０ ３ １ （ 第 ４代） （ 上海北诺生物科技有 限公司） 、 枯草芽孢杆菌［ Ｃ ＭＣ Ｃ（ Ｂ ） ６ ３ ５ ０ １ １ （ 第 ４代） （ 上海北诺生物科技有限 公司） 、 大肠埃希菌 Ｅ Ｃ ＭＣ Ｃ（ Ｂ ） ４ ４ １ ０ ２ ３ （ 第 ３代） （ 七 海 北诺生物科技有限公 司） 、 黑 曲霉［ Ｃ ＭＣ Ｃ（ Ｂ ） ９ ８ Ｏ Ｏ ３ ］ （ 第 ３代） （ 上海北诺生物科技有限公 司） 。 ｌ － ４培 养基 、 稀释 液 及缓 冲 液 １ ． ４ ． １干粉培养基： 硫 乙醇酸盐培养基 （ 』 东环凯微生物科技有 限公司） 、
无菌、微生物限度检查及方法验证
01
02
03
直接接种法
将样品接种在培养基上， 观察是否有微生物生长。
薄膜过滤法
将样品通过薄膜过滤，收 集滤膜上的微生物，再进 行培养。
离心沉淀法
将样品离心，收集沉淀物 中的微生物，再进行培养 。
无菌检查的注意事项
确保环境洁净
无菌检查需要在洁净的环境中进行，以避免 外界微生物的污染。
避免样品中防腐剂的影响
方法验证
方法验证的定义与目的
定义
方法验证是对检测方法的可靠性、准确性和可重复性的评估过程，以确保该方 法能够满足预期的检测要求。
目的
方法验证的目的是确保所采用的无菌、微生物限度检查方法具有足够的灵敏度 、特异性、重现性和可操作性，以保证检测结果的准确性和可靠性。
方法验证的流程
准备验证计划
制定详细的验证计划，包括验 证实验的设计、实验步骤、数 据收集和分析等内容。
进出口检验
进出口药品需要进行严格的微生物限度检查，以确保药品符合进口 国或地区的质量标准，保障公众健康。
方法验证在药品质量控制中的应用
验证无菌、微生物限度检查方法的可靠性
通过方法验证可以确保无菌、微生物限度检查方法的准确性和可靠性，提高药品质量控制 水平。
评估检测方法的性能指标
方法验证过程中需要对检测方法的性能指标进行评估，如灵敏度、特异性、重现性等，以 确保检测结果的准确性和可靠性。
如果样品中含有防腐剂，可能会抑制微生物 的生长，因此需要进行相应的处理。
正确选择培养基
根据待测样品的特性，选择适合的培养基， 以确保微生物能够正常生长。
定期进行方法验证
无菌检查方法需要定期进行验证，以确保其 可靠性。
0义与目的
注射用万古霉素无菌检查方法学验证
试验样品处理
试验步骤
按照无菌检查方法学的要求，对试验样品进行处理，包括稀释、加 药、培养等步骤。
操作规范
在处理试验样品的过程中，需要严格遵守无菌操作规范，避免样品 中的微生物污染实验环境。
数据记录
记录每个试验样品的无菌检查结果，包括微生物种类、数量等。
03
方法学验证实验
样品准备
取注射用பைடு நூலகம்古霉素样品，用无菌方法将样品分别装入无菌容器中。
注射用万古霉素无菌检查方 法学验证
汇报人：
日期:
• 引言 • 方法学验证方案 • 方法学验证实验 • 方法学验证结果分析 • 注射用万古霉素无菌检查方法学验
证总结
01
引言
目的和背景
目的
确保注射用万古霉素的无菌检查方法具有可靠性、准确性和可重复性，为产品质量控制提供有力支持 。
背景
注射用万古霉素是一种广泛应用于临床治疗的抗生素药物，其无菌质量对于保障患者安全具有重要意 义。因此，对无菌检查方法进行验证是保证药物安全性的关键环节。
参考标准
《中国药典》2020年版
规定了注射用万古霉素的无菌检查方法和要 求。
《无菌检查法》国家药品标 准
提供了无菌检查方法学的通用指导原则。
《微生物限度检查法》国 家药品标准
提供了微生物限度检查的方法学指导原则。
定义与术语
无菌检查
01
指对药物中是否含有微生物的检查方法，是确保药物
无菌的重要手段。
实验设计
根据无菌检查方法学验证指导原则，设计实验方案，包括实验组和对照组。
实验操作
按照实验设计方案，分别对实验组和对照组进行无菌检查实验。
培养与观察
将实验组和对照组的培养皿放入无菌培养箱中培养 ，每天观察并记录培养结果。
盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液无菌检查方法学验证
盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液无菌检查方法学验证作者：吴羽岚嵇海澄来源：《中国医药科学》2013年第13期[摘要] 目的对盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液的无菌检查方法进行探讨，建立其无菌检查方法。
方法按《中国药典》（2010年版）附录ⅪH无菌检查方法进行。
结果在验证条件下，该方法能消除对微生物生长的抑制作用。
结论可以采用此法对本品的无菌进行检查。
[关键词] 盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液；无菌检查方法；薄膜过滤法[中图分类号] R-331 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）13-95-02Study of sterile examination method of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection WU Yulan JI HaichengJiangsu Hansoh Pharmaceutical Co.Ltd.，Lianyungang 222000，China[Abstract] Objective To discuss and establish the sterile examination method of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection. Methods The test were done according to appendix XIH-sterile examination method in"Chinese Pharmacopeia"（2010 edition）. Results The method could eliminate the inhibition of microbe growth under the validation condition. Conclusion This method can be used for the sterile examination of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection.[Key words] Levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection；Sterile examination method；Membrane-filter procedure盐酸左氧氟沙星（Levofloxacin Hydrochloride）化学名称：（S）-9-氟-2，3-二氢-3-甲基-10-（4-甲基-1-哌嗪基）-7-氧代-7H-吡啶并[1，2，3-de]-[1，4]苯并嗪-6-羧酸盐酸盐的水合物，属第三代喹诺酮类抗菌药。
微生物限度检查法及其方法学验证综述
１ ９ ｚ Ｈ一 ） ８ ６ ８ （ Ｈ ， Ｊ ８ １ ， ５ 、 ． ９ （ Ｈ ， ｄ ． Ｈ ， ２ 、 ． Ｏ １ ｄ， 一 ． Ｈｚ Ｈ－ ） ８ ６ ７ １ ｄ ，
ｂ ｎｙ ｕｙ ｌ ｔｎ 。化 合 物 Ⅲ为 该 植 物 中首 次 分 离 得 到 。 ｅｚ１ ｔｏａ ｏ ｅ ）ｂ ｅ
化 合 物 Ⅳ 棕 黄 色 粉 末 。［ ］ －８ ８ Ｃ Ｏ ２ Ｃ ｌ） ａ Ｄ５１． （ ＝ ． ， ＨＣａ 。 ２ Ｆ Ｃ３ 应 呈 阳性 。Ｅ Ｉ ｅ１反 Ｓ－ ＭＳ（ｏ ｉｖ ） ｚ４ ９ Ｍ＋ Ｎ ］ 推 ｐ ｓ ｉ ｍ／ ：０ ［ ｔｅ ａ ，
（ ３ 、 １ ７ ４ （ － ） ８ １ ． （ － ）、 １ ０ ６ ｃ ６ ８ ７ ９ Ｃ－ ） Ｃ－ ） ８ ４ ． Ｃ ４ 、 １ ６ ６ Ｃ ５ ８ ２ ． （ ． ）、 ７ ． （ ７ 、
ｐｉｃｓＪ ． ｈ ｔｅ ｅ ｓｒ ，０ ３ ６ ：０— １． ｒ ｅ［＇ Ｐ ｙｏｈ ｍｉｔｙ２ ０ ，２ ８ ５８ １ ｎ ］
ｏ ｔａ ｙ ｒ ｄ ｂ ｎ ｏ ｙ １ ｏ ｔ ｎ ｇｎ ｎｓ ａ ｄ ｐ ｒ ｄ ｅ ｏ ｅ ｆＴｅ ｒ ｈ ｄ ｏ ｜ ｅ ｚ ｃ ｃｏ ｃ ｅ ｅ Ｌｉ ａ ｎ Ｓ ｉｏ ｉ ｎ ｎ ｓ ｂｙ Ｈ ｙ ｅ ｖ ｌ ｎ Ｉ ｄ ｎ Ｏｘ ｄ ｔｏ ｏ Ｐｈ ｎ ｉ Ｄｉ ｅ ｚ ｌ ｕ ｙ ｏ ａ — ｐ ｒ ａｅ ｔ ｏ ｉｅ ｉａ ｉｎ ｆ ｅ ｏｌ ｃ ｂ ｎ ｙｂ ｔ ｒ ｌｅ
７）８ ２． （ 一 、６． （ － 。 上 述 核 磁 数 据 与 异 美 商 陆 酚 、１８ ５Ｃ ８）８ ４ Ｏ Ｃ ９） （ｏｎ ｒａｏ ｉ ａｍｅｉ ｎ ｎＡ）进 行 对 比 ［］ 本 一 致 ， 鉴 定 为 ｉ ａ — ｓ ｃ １基 故 ｓ ｎ ｏ ｍｅｉ ｎ ｎＡ。 化合 物 Ｖ为 该 属 植 物 中 首 次 分 离 得 到 。 ｒ ａｏ ｃ
微生物方法学验证
速效心痛滴丸2.微生物限度检查参照中国药典2005年版一部要求，对微生物限度检查作验证试验如下：2．1微生物限度检查法验证实验2.1.1.验证用菌种：金黄色葡萄球菌CMCC（B）26 003、枯草杆菌CMCC （B）63 501、大肠埃希菌CMCC（B）44 102、白色念珠菌CMCC（F）98 001、黑曲霉CMCC（F）98 0032.1.2方法：中国药典2005年版附录一部XIII C 微生物限度检查方法验证试验。
2.1.3操作方法：（1）菌液制备：a. 取经37℃培养24h金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的肉汤培养物1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-5（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。
b. 取经25℃培养24h的白色念珠菌肉汤培养物1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-5（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。
c. 取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，用5ml生理盐水洗下霉菌孢子，吸取菌液，用标准比浊管比浊，然后取1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-4（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。
（2）供试液制备：称取供试品10g，研细，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪，混匀，作为1:10的供试液，分别人工污染上述5种代表实验菌株。
（3）回收率测定a. 实验组：取1:10供试液1ml和1ml实验菌液同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时，观察计数。
b. 活菌组：照上述方法测定每1菌株的实验菌数。
c. 供试液对照：测定供试品本底菌数。
d. 稀释剂对照组，取稀释液同法操作，测定，应无菌生长。
4.结果：菌落计数结果，回收率实验结果，见表2、表3：表2 菌落计数（cfu/ml）从表3可知，玉屏风泡腾颗粒样品处理后，按常规法进行微生物限度检查，供试品对5种菌株的回收率试验均高于70%可采用此法检验。
两种医院制剂微生物限度检查方法学验证
常规 法不 完全适 用于这两种 医院制剂的微 生物 限度检查 ， 儿咳合剂（ Ｉ ） 对枯草 芽孢杆 茵具有抑制作 用， 可采用
培养基稀释法进行 细菌计数 ； 复方肌苷 口服 液无 明显抑 茵作 用。 可采用常规法进行微 生物 限度检查 。结 论
下， １ ５种氨基酸总量均呈下降 的趋 势 ， 移植时 间越长 ， 下降越
明显 ， 以福建 红 霞种 为 例 ， 组 培 ５个 月 ， 移 植林 下 ３个 半月
（ Ｙ ２ ） ， １ ５种氨基酸 总量为 ２ ８ ． ３ ９ ｍ ｇ・ ｇ ～； 组 培 ５个 月 ， 移植
林下 １ ２个月（ Ｙ ３ ） 及 １ ８个月 （ Ｙ ４ ） ， １ ５种 氨基 酸总量 分别降 低至 ２ ４ ． １ ９ ｍ ｇ・ ｇ 和 ６ ． ６ ５ ｍｇ・ ｇ ～。同样的规律也 出现在 了 福建尖叶种及台湾种上 ， 这可能是 由于组织 培养过程中 ， 培养 基营养丰富 ， 导致氨基 酸含量 高 ， 而随着 移植至林 下 ， 生长基
基酸的含量均较低 。在单 个氨 基酸 上 ， 以Ｙ ７的门冬 氨酸 含 量最高 ， 达７ ４ ． ６ ８ ｍ ｇ・ｇ ～， 其 次 为福 建 尖 叶 种 组 培 ５个 月 （ Ｙ ５ ） ， 为２ ７ ． ４ ０ ｍｇ・ ｇ 一， 与福 建野生种 的 ２ ６ ． ７ ０ ａ ｒ ｇ・ ｇ 相 比 并无显著差异 ， 但 随着移植 至林 下的时间越长 ， 门冬 氨酸的含 量均明显下降。另外 ， 在本次 分析 的 ８ 个金 线莲样品 中， 除台 湾种未检 出蛋氨酸 （ 其最 小检 出限为 ０ ． ０ ２ ０ ￣ ｇ・ ｍＬ ） 外， 其
［ ９ ］ 赵振宇 ， 张蠲慧 ． 牛磺酸药 理作用的研究 新进展 （ Ｊ ］ ．中国医院药
无菌、微生物限度检查及方法验证
此法为实验室工作用菌种的最常用的保藏方法，仅能用于工作用菌种的短期保藏。
8
琼脂斜面低温保藏法保藏法（厂家常用）
保藏芽胞液对
产芽胞的微生物宜制成芽胞菌悬液后再保藏， 无菌操作，取1ml孢子液接入茄形瓶或培养皿内，轻轻转动使菌液均匀分布于培养基表面。 将培养皿在适当的温度下培养。一般需要7天或更长时间 在层流台下，取3~5ml氯化钠磷酸盐缓冲液（pH7.0）加入培养皿内 用无菌玻璃L棒轻轻刮下菌苔，注意不要划破培养基。 用无菌注射器或无菌吸管吸取菌悬液，收集于试管中。 将收集的芽胞液放在80~90℃水浴中加热15分钟，冷却。 做好标记，放至2~8℃冰箱中保藏。原始芽胞液可保存1年。 每次使用前用平皿法重新标定其浓度。
微生物实验室的质量管理
设施—洁净室、净化工作台、生物安全柜。 设备—高压蒸汽灭菌器、电热恒温干烤箱、培养箱、冰箱。 实验仪器—全封闭薄膜过滤装置、电动匀浆仪、电热恒温水浴箱、离心机、显微镜，及刻度吸管、试管、三角烧瓶、培养皿等。 建立主要设施、设备、仪器的明细记录，内容包括名称、型号、生产厂家、购买日期。 质量保证档案：购买发票、安装验收或开箱验收记录、调试记录、计量检定或运行校验合格证、指定专人负责、制订标准操作规程（SOP）、建立使用登记册，维修、保养记录、改造或更新记录、直至报废记录。
记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌室前，至少开启机房运转1小时以上。
实验室使用管理
微生物实验室的质量管理
平时实验室内应尽可能减少人员的走动或活动，通向洁净室的门要关闭或安装自动闭门器使其保持关闭状态。
枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）63501] 金黄色葡萄球菌 [CMCC（B）26003] 生孢梭菌 [CMCC（B）64941] 铜绿假单胞菌 [CMCC（B）10104] 大肠埃希菌 [CMCC（B）44102] 乙型副伤寒沙门菌 [CMCC（B）50094] 白色念珠菌 [CMCC（B）98001] 黑曲霉 [CMCC（B）9 003]
5种医院制剂微生物限度检查法的方法学验证
中国药业 !"#$% &"%’(%)*+,#)%-.
・!"・
药物鉴定
2 批号为 !""+"/,!4 !""+"/,04 !""+"/,1 3 ， 一方散 2 批号为 !""+"/!14 风湿散 2 批号为 !""+"/,*4 !""+"/!,4 !""+"/!/3， !""+"/!)4 !""+"//" 3， 外敷一号液 2 批号为 !""+"/"!4 !""+"/,*4 !""+"//" 3 ， 均为广西玉 林市骨科医院制剂。 培养基与稀释剂： 培养基包括营养琼脂培养基、 玫瑰红钠琼脂 培养基、 营养肉汤培养基、 硫乙醇酸盐流体培养基、 胆盐乳糖培养 （.5） 、 改良马丁培养基、 改良马丁琼脂培养基、 甘露醇氯化钠琼 基 脂培养基、 溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基。 稀释剂为 67 8 +9 " 的 无菌氯化钠 : 蛋白胨缓冲液、 "9 *’ 无菌氯化钠溶液等。 仪器： 霉菌培养箱。 ;7< : !-" 型生化培养箱， ! !" # 方法与结果 菌液制备 大肠埃希菌、 枯 取 /- = 下培养 ,) > !0 ? 的金黄色葡萄球菌、 草芽孢杆菌、 铜绿假单胞菌的营养肉汤培养物， 用 "9 *’ 无菌氯化 钠溶液制备成每 , @5 含菌数为 -" > ,"" #$% 的菌悬液， 备用； 取 !+ = 下培养 !0 > 0) ? 的白色念珠菌改良马丁培养基培养物， 用 "9 *’ 无菌氯化钠溶液制备成每 , @5 含菌数为 -" > ,"" #$% 的菌悬液， 备用； 取 !+ = 下培养 - > + A 的黑曲霉改良马丁琼脂培养基斜面培 养物， 用 "9 *’ 的无菌氯化钠溶液 - @5 洗下霉菌孢子， 吸取孢子悬 液， 置无菌试管内， 用 "9 *’ 无菌氯化钠溶液制备成每 , @5 含孢子 备用。 数为 -" > ,"" #$% 的孢子悬液， !" ! 供试品溶液制备 !" & 取跌打散、 十味散、 一方散、 风湿散各 ," B， 加 67 为 +9 " 的无 菌氯化钠蛋白胨水缓冲液至 ,"" @5， 混匀即得 , C ," 的溶液， 作为 供试品溶液。 对于外敷一号液， 则取原液作为供试品溶液。 !" $ 回收率预试验 为确定细菌、 霉菌和酵母菌菌落数的测定方法， 选用敏感菌 株金黄色葡萄球菌、 白色念珠菌， 分别用常规法、 培养基稀释法 （"9 - @5 & 皿 ） 对供试品进行预试验。 常规法： 取平皿， 分别注入供试品溶液和菌悬液各 , @5， 每株 菌平行做 ! 个皿， 再加入相应的培养基， 依法培养， 进行菌落计数。 （"9 - @5 & 皿） 培养基稀释法 ： 取平皿， 分别注入供试品溶液 "9 - @5 和菌悬液 , @5， 每株菌平行做 ! 个皿， 再加入相应的培养基， 依法 培养， 进行菌落计数。 结果： 见表 , 。 可见， 跌打散、 十味散、 一方散、 风湿散采用常规 法检查， 金黄色葡萄球菌及白色念珠菌回收率均大于 +"’ ， 达到 《 中国药典 》 要求， 予以采用； 外敷一号液采用常规法检查， 金黄色 葡萄球菌回收率均小于 +"’ ， 白色念珠菌回收率均大于 +"’ ， 因 此霉菌及酵母菌检查可采用常规法， 而细菌检查须采用培养基稀 （"9 - @5 & 皿 ） 进一步预试。 预试结果显示， 金黄色葡萄球菌回 释法 《中国药典 》 收率为 ),’ ， 达到了 要求， 予以采用。
微生物限度检验方法验证报告
微生物限度检查检验方法验证报告
方案编制年月日方案审核年月日方案批准年月日
上海美宝生命科技有限公司
7
7.1试验样品
确认人：日期：
7.2 产品试验组微生物生长情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：7.3 供试品对照组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：
7.4 稀释剂对照组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：7.5 菌液组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：
7.6稀释剂对照组菌回收率计算
检验人：日期：复核人：日期：7.7 试验组菌回收率计算
检验人：日期：复核人：日期：
7.8 结果说明
经过验证，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分别为： %、 %、 %、 %、 %。
稀释剂回收率为： %、 %、 %、 %、 %。
7.9 结论
以上验证结果证明，本品（适合/不适合）采用上述方法进行微生物限度检查。
附录。
微生物限度方法学验证完整版
微生物限度方法学验证 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。
二、菌种、培养基及稀释液表2培养基表3对照用培养基表4试剂稀释液：（1）缓冲液取L磷酸二氢钾溶液250ml,加L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。
（2）%无菌氯化钠溶液取氯化钠，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。
（3）％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液取聚山梨酯80 ，用％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。
（4）靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。
三、菌液的制备1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。
上述培养物用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。
2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。
用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu 的菌悬液。
熊胆粉微生物限度检查方法学验证
熊胆粉微生物限度检查方法学验证目的建立熊胆粉微生物限度检查方法，并对方法进行验证。
方法采用《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法对熊胆粉进行微生物限度检查。
结果用pH 7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制备样品，可采用培养基稀释法（1∶20供试液，0.1 mL/皿）进行细菌计数；采用培养基稀释法（400 mL 营养肉汤）进行沙门菌检查；采用1∶10供试液的常规法进行霉菌及酵母菌计数和控制菌检查。
结论该方法消除了样品的抑菌性，可用于该品种的微生物限度检查。
[Abstract] Objective To set up the microbial limit test ways for bear gall powder and verification of the method. Methods A microbial limits method of Chinese Pharmacopeia (2010 edition) part one appendix ⅩⅢC was used to detected the microbial limit test method of bear gall powder. Results Sodium chloride-peptone aseptic buffer solution (pH=7.0) was used to prepare the test sample. Culture media dilution (1∶20 sample solution, 0.1 mL/dish) was used to count the bear gall powder bacteria. Salmonella test method for culture media dilution method (400 mL NB) was used. 1∶10 selected liquid was adopted to do the mildew and yeast count and control bacteria inspection by the conventional method. Conclusion This method can eliminate the antimicrobial properties and it can be used for the microbial limit test for bear gall powder.[Key words] Bear gall powder; Microbial limit test; Validation熊胆粉为熊科动物黑熊Selenaretos thibetanus Cuvier经胆囊手术引流胆汁而得的干燥品，收载于国家药品标准《新药转正标准》第11册[1]，本品有一定的抑菌作用[2]，但其微生物限度檢查一直采用常规方法检验，根据《中国药典》2010年版的要求，对原用的常规方法进行验证[3]。
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
计数 (CFU)
均值 (CFU)
22 26 24
金黄色葡萄 球菌
36 39
38
枯草芽孢杆 菌
62 66
64
铜绿假单胞 菌
58 54
56
生孢梭菌 20 20
20
菌种 计数(CFU) 均值(CFU)
表2 真菌数计数结果 黑曲霉菌
白色念珠菌
86
93
86
83
89
85
2024/4/20
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
7. 活菌计数 活菌计数结果见表1。
2024/4/20
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
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10－4稀释 10－5稀释 10－7稀释
试验次数
1 2 1212
金黄色葡萄球菌
56 60
枯草芽孢杆菌
77 79
白色念珠菌
86 70
黑曲霉菌
80 76
铜绿假单胞菌
47 50
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无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
方法： 中国药典相关微生物程度检验法方法验 证试验。
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无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
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详细操作方法
菌液制备： (1)取经37℃培养18~24h，金黄色葡萄球菌 、大肠埃希菌、枯草杆菌肉汤培养物 1ml+9ml盐水，10倍稀释至10-5 ~10-7，细菌 数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。
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无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
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供试液制备：每2支以100ml生理盐 水溶解，混匀备用。
薄膜过滤：将要求量供试品按薄膜 过滤法过滤，冲洗，每次50ml，在最 终一次冲洗液中逐一加入试验菌少于 100CFU。按要求将培养基直接加至 滤筒内。天天观察并统计结果。
复方菌陈注射液无菌检查方法验证实验
ｒｃ ｖｒ ａｅ（ ｉ ｔ ｎｍｅｈ ｄ） ｎ ＝３ ｅｏ ｅｙｒｔ ｄｌ ｉ ｔｏ （ ｕｏ ）
复方 五仁醇软胶囊 ， 按文献 微生 物限度检查 方法 验证 试验 ： 样 １ ｇ 加 ｐ ７ ０无 菌 氯 化 钠 蛋 白 胨 缓 冲 液 至 取 ０， Ｈ． １Ｏ ｌ４ ￣ ０ ｒ ，５Ｃ保温振荡 ， ａ 作为 １ １ ： ０供 试液 。细菌 数测 定 ： 用培 养基稀 释法每皿 ０ ５ （ ．ｍｌ 即取 供试 液 ｌ 分别 注入 ２个平 皿 ｍ１
液 ０ ２ ｌ 种至 ５ ｌ Ｇ培 养基 的试 管 内 ， ．ｍ 接 ｍ ＭＵ 培养 ５ ２ ｈ 在 、４ ， ３６ ｍ紫外线下观察 ， ６ｎ 均可见荧 光反应 ， 滴加 靛基 质试液 ， 液 面均 呈玫 瑰 红 色 。（ ） ２ 阴性 菌对 照组 取 １１ ： ０的 供 试液
［ ］ 杜平华 ， ２ 朱世真 ， 赵鲁青 ． 品微 生物限度检查预实验及方法验 药
聂渝琼① 嵇 ， 扬， 锦 ， 高 张润婕 ， 胡 丹
北京 １０ ７ ０ ０ １） （ ①总后 勤部卫生部药 品仪器检 验所
关键词 ： 复方茵陈注射液 ； 菌检查 ； 无 簿膜过滤法 ； 验证实验 复方茵陈注射液 主要用于清热化湿 ， 利胆退 黄。治疗各型
肝炎 、 胆道感染、 胆石症属湿热内蕴之阳黄者 。为确保该品种无 菌检查法的有效性 ， 本实验依据 中国药典 ２０ ０５年版～部附 录 ｘ
培养 基及所选 用的溶 剂按 照有关规 定进 依 据文献 …无菌检 查法 中培养基
行配制 、 分装 和灭 菌后备用 。 培养 基灵敏度检查
释法对复方五仁醇 软胶 囊细 菌数 进行 检测 可 以消除 复方 五 仁醇软胶 囊对金黄 色葡萄球菌和枯草芽孢 杆菌的抑制作用 。
微生物限度检查方法学验证实验
生物安全柜（Biological safety cabinets， BSCs）是为操作原代培养物、菌毒株以及诊 断性标本等具有感染性的实验材料时，用来 保护操作者本人、实验室环境以及实验材料， 使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的 感染性气溶胶和溅出物而设计的。
生物安全柜正广泛用于微生物和生物工程及 其他对操作环境有苛刻要求的场所，目前正 在为医疗卫生、制药、科学研究领域提供无 菌、无尘的可移动的工作环境。
用于微生物限度验证的菌种
菌株选择的原则:代表性,普遍性,低或非致病性,标准 菌株(或该药品中常见的污染菌)
菌种的要求：不得超过5代,采用适宜的方法保存。
CMCC (China Medical Culture Collection Center) 中国医学微生物菌种保藏管理中心 B- Bacteria(细菌) F-Fungi(真菌)
(1) 不确定性:药品受外来微生物的污染,这种 污染是可有可无;在有中又可多可少;其种类可 以多样.污染的情况依生产,设备,原材料,管理, 剂型等等条件而定,非药品本身所固有.所以微 生物限度检验的对象是不确定的.药品所规定 的项目,除无菌检查,热原具有上述性质,其他 项均无此特征.这一点往往被忽视.污染对药品 而言是一个意外事件.污染批号中的不合格品 是一个随机变量.
结果时 。 定期的验证。
同一产品不同批次、不同企业生产的同一产品。
当建立药品的微生物限度检查方法时，应进 行细菌、霉菌及酵母菌计数的方法学验证， 以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、 霉菌及酵母菌数的测定。
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵 母菌计数所规定的方法及下列要求进行，对 各试验菌的回收率逐一进行验证。
产单位全面质量管理水平与提高药品质量的 重要措施.
2008 无菌_微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析_国明
中国药品标准 2008年第 9卷第 1 Nhomakorabea 47以减少膜的吸附, 对于抑菌性较强的注射用无菌粉 末或固体原料, 一定要充分溶解、混合均匀。 114 加菌时机不一致
验证试验主要考虑滤器中残留抗菌物质对阳性 菌生长的影响, 应与对照滤器比较而作出判断, 所以 验证试验中加菌时机要与对照一致 [ 2] 。
115 薄膜过滤法滤膜材质选择不正确, 直接影 响试验结果
20 05年 版药 典执 行以 来药 品 生 产企 业 、科 研 单 位等 在药品质量标准建立及检验工作中困难和问题较多 的项目。我们在药品注册品种的审核检验中, 发现 有的申报单位对方法学验证的意义理解不够, 验证 试验的科学性、完整性及可操作性均存在着很多问 题。为尽快提高方法学验证水平, 更好地保证用药 的安全性, 现将方法学验证工作中常遇到的问题进 行分析、讨论。 1 无菌检查方法学验证问题及分析 111 验证菌株选择不正确 11111 敏感菌株与阳性对照菌不一致, 降低了阳性 对照菌的意义。有些药品选择了敏感菌株进行方法 学验证试验, 但是无菌检查时阳性对照菌不是验证 试验选定的敏感菌株。实际工作中抑制枯草芽孢杆 菌的样品很多, 可用此作为敏感菌株, 但药典规定无 菌检查时以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌, 使金 黄色葡萄球菌失去了阳性对照菌的意义。应在此类 无菌检查时也增加敏感菌株作为阳性对照菌。 11112 2005年版药典无菌检查中规定 / 抗革兰阴 性菌为主的供 试品以大肠埃希菌为对照菌 0, 但方 法学验证规定用菌株没有大肠埃希菌, 缺少了验证 此类药物抗菌作用的代表菌株。建议对抗菌作用中 明确具有抗革兰阴性菌的药品进行无菌检查方法学 验证时, 应增加大肠埃希菌作为验证菌株。 112 验证时取样量不符合要求 11211 无菌检验量与验证试验的取样量不同, 与中 国药典 2005年版方法学验证要求不符。进行供试 品检查时, 所采用的检验方法和检验条件应与验证 的方法相同, 应按照规定的检验数量和检验量取样。 11212 有的生产单位无菌检查方法学验证仅按抽 验产品检验数量进行验证, 药典规定应按照批出厂 产品最少检验数量进行试验 [ 1] 。 113 方法选择错误或不恰当, 不符合 2005 年版中 国药典要求 11311 有的申报单位无菌检查时无论什么药品都 用直接接种法。 2005年版中国药典规定, 只要供试 品性状允许, 应采用薄膜过滤法 [ 1] 。 11312 有些申报单位对非抑菌性供试品也用大量 的冲洗液冲洗, 如每次 100 mL, 10次 /膜, 既增加了 对膜的损伤和对微生物生物特性的破坏机会, 也增 加了检验繁琐性和检验人员的工作量。所以薄膜过 滤时尽 可能 减少 冲 洗量, 冲 洗 不一 定 为每 次 100 mL, 可少量多次, 并注意充分振摇。对于抑菌性较 强的供试品, 可以先用适宜的稀释液稀释后再过滤,
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白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁 培养基或改良马丁琼脂培养基中[见附录1.3], 25.5±2.5℃培养24～48小时。
取经25.5±2.5℃培养72小时的白色念珠菌 真菌斜面培养物，加入生理盐水4ml洗下孢子 ，吸出转移至空试管作为原液，取1ml加9ml 生理盐水，10倍稀释至10-6，取1.2ml加生理 盐水9ml，混匀备用。
菌液制备：
取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大 肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许 接种至营养肉汤培养基中, 生孢梭菌的新鲜 培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中, 32.5±2.5℃培养18～24小时；
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取经32.5±2.5℃培养19~21h小时的大肠 埃希菌、金黄色葡萄球菌、理盐 水，10倍稀释至约10-5~10-8之间。
21
供试液制备：每2支以100ml生理盐 水溶解，混匀备用。
薄膜过滤：将规定量的供试品按薄 膜过滤法过滤，冲洗，每次50ml，在 最后一次的冲洗液中逐一加入试验菌 少 于 100CFU 。 按 规 定 将 培 养 基 直 接 加至滤筒内。每天观察并记录结果。
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结论：
根据上述结果，由于采用直接接种 法进行虎杖苷注射液的无菌检查，存在 对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌生长的抑 制作用。因此，虎杖苷注射液的无菌检 查应依据中国药典无菌检查方法中的薄 膜过滤法进行，冲洗量规定为500ml。
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• 方法：中国药典2005版无菌检查中薄膜 过滤法方法验证
• 验证试验用菌种：验证试验用菌种包括 金黄色葡萄球菌（26003）、铜绿假单胞 菌（10104）、枯草芽孢杆菌（63501）、 生孢梭菌（64941）、白色念珠菌 （98001）、黑曲霉菌（98003），来自
中国医学细菌保藏中心。
无菌检查、微生物 限度检查 方法学
验证实例
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1
虎杖苷注射液无菌检查的方法验证
• 样品：虎杖苷注射液由深圳海王药业有限公司 提供，批号20040305。
• 培养基：无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基，
批号040203；霉菌液体培养基，批号 040302； 营养肉汤培养基，批号 0403045；营养琼脂培 养基，批号 040513；0.1%蛋白胨溶液，批号 050217；虎红钠琼脂培养基，批号040202；由 中检所所培养基室提供。
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13
头孢噻肟钠无菌原料的无菌实验方法验证
• 样品：头孢噻肟钠无菌原料，规格：0.5g/瓶； 批号：40807001；生产单位：Aventis Pharma Deutschland GmbH
• 培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、真菌培养基、 营养肉汤、普通斜面、真菌斜面、营养琼脂、 虎红琼脂(均由中国药品生物制品检定所培养基 室提供)
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菌液计数：分别取上述5种细菌菌液1ml加 入培养皿，每种菌液做平行2皿。注入营养 琼脂约18ml。30~35℃培养（生孢梭菌置厌 氧培养箱中培养）。分别取上述2种真菌菌 液1ml加入培养皿，每种菌液做平行2皿。 注入虎红琼脂约18ml。23~28℃培养。
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(3) 大肠埃希菌（Escherichia coli） [CMCC(B) 44102]；
(4) 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10104]；
（5) 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64941]；
(6) 白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]；
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3
供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋 白胨溶液30 ml溶解后，过滤。
7. 活菌计数 活菌计数结果见表1。
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10－4稀释 10－5稀释 10－7稀释
试验次数
1 2 1212
金黄色葡萄球菌
56 60
枯草芽孢杆菌
77 79
白色念珠菌
86 70
黑曲霉菌
(7) 黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F)98003]。
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仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，全封闭无 菌试验过滤培养器（批号20050105）北京牛 牛基因有限公司。
方法：中国药典2005年版无菌检查的验证实 验
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操作方法
80 76
铜绿假单胞菌
47 50
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7
方法验证
直接接种法：取样品12支，分别接种8 支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基 2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌 液（30-100个/ml），置规定温度培养 3-5天，逐日观察结果。
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8
薄膜过滤法：
取样品11支，将样品过滤于封闭式滤器（3 联筒/套），用0.1%蛋白胨氯化钠溶液冲洗 500ml后，再分别人工污染金黄色葡萄球菌、 枯草杆菌50~100个/筒即可，同时平行做稀释 剂的对照组。将稀释剂对照滤筒和污染阳性 菌的验证滤筒置37℃培养3～5d，逐日观察， 结果见表2、3、4。
• β-内酰胺酶：2ml大于300单位/毫升（批号： 20030630）
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验证试验用菌种：
（1）金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003]；
(2) 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]；
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将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至 改良马丁琼脂斜面培养基上，25.5±2.5℃ 培养5～7d，使大量的孢子成熟 。取经 25℃培养7d的黑曲霉真菌斜面培养物，加 入生理盐水4ml洗下孢子，吸出转移至空 试管作为原液，稀释至10-4，取0.5ml加 生理盐水10ml混匀备用。