流式抗体的选择及美天旎新荧光染料的特点

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流式细胞术中应用的荧光染料介绍

流式细胞术中应用的荧光染料介绍流式细胞术（Flow Cytometry）是一种用于分析和计数细胞的技术。

在流式细胞术中，荧光染料起着至关重要的作用，可以标记细胞的不同成分，使其能够通过流式细胞仪进行检测和分析。

荧光染料通过特定的荧光光谱来发出荧光信号，这些信号被流式细胞仪采集和分析，从而提供有关细胞类型、数量和功能的信息。

以下是几种常见的流式细胞术中应用的荧光染料的介绍。

1. FITC（Fluorescein Isothiocyanate）：FITC是最常用的荧光染料之一，通过与免疫球蛋白G（IgG）结合，可用于免疫细胞表面分子的检测。

FITC在波长为488 nm的激光下激发，发射的荧光信号在525 nm 左右。

它可以与其他荧光染料（如PE或APC）结合使用，以实现多参数流式细胞分析。

2. PE（Phycoerythrin）：PE是一种从红藻中提取的荧光染料，其发射的荧光信号在575 nm左右。

PE通常用于检测细胞表面的抗原或细胞内的蛋白质，如细胞因子。

PE也可以与其他染料结合使用，以实现多参数分析。

3. APC（Allophycocyanin）：APC是一种类似于PE的荧光染料，通过独特的发射波长（约于660 nm附近）和长的荧光寿命来区分。

APC适用于检测多种细胞表面分子和蛋白质，在深色的区域提供了可靠的信号。

5. PE-Cy7：PE-Cy7是PE染料与Cyanine 7（Cy7）结合形成的荧光染料。

它适用于多参数流式细胞术，利用其较长的荧光寿命和波长（激发于488 nm，发射于780 nm左右），可以与其他染料一起使用，以实现更多的细胞表面和内部分子的检测。

除了上述染料外，还有很多其他的荧光染料可以用于流式细胞术。

例如，Alexa Fluor系列、eFluor系列、Brilliant Violet系列等。

这些染料具有不同的光谱特性和荧光强度，可以根据实验需要选择合适的染料。

需要注意的是，在选择荧光染料时，需考虑染料的互相干扰问题和流式仪的激发和检测系统。

美天旎公司磁珠分选产品

美天旎公司磁珠分选产品标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]美天旎公司MACS(磁珠分选)相关产品一、MACS微珠（MicroBeads）MACS微珠是一种与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒，用于目的细胞或者去除细胞的磁性标记。

微珠直径约有50nm，比细胞小200多倍，体积为细胞的百万分之一，光学显微镜下不可见。

微珠由多聚糖和氧化铁组成，无毒性，对细胞无损伤，可以生物降解。

MACS微珠与流式细胞仪兼容，不会影响细胞的光散射特性；磁性标记只占用2 0－30％的结合位点，不影响细胞的荧光抗体标记。

此外，MACS微珠可以最大限度地避免细胞活化；无需解离磁珠，可以直接进行后续实验：如流式细胞仪分析或分选、细胞培养、分子生物学研究、回输给人或者动物。

MACS微珠主要有三种：直标微珠、间标微珠、多选微珠。

其中间标微珠有抗免疫球蛋白微珠、抗生物素微珠或链霉亲和素微珠、抗荧光素微珠。

多选微珠是专门为分选细胞亚群而研制的一种微珠。

这种微珠通过特殊的方式与抗体偶联，在第一次阳性分选完成后，与细胞结合的多选微珠可以被解离试剂剪切下来，阳性分选的细胞可以进行再次阳性分选或者去除分选。

MACS技术分选的CD8阳性T细胞（箭头所示为磁性结合在细胞表面的微珠）二、MACS分选柱（Separation Column）MACS分选柱是一类填充有不同规格铁珠的塑料容器，铁珠表面有亲水包被，因此不会损伤细胞。

在磁场外MACS分选柱不带有磁性，但是当置于一个永久性磁场—MACS分选器中时，分选柱内的铁珠可以使分选器的磁场增强1000倍，足以滞留仅标记有极少量微珠的目的细胞；磁性标记细胞从分选柱中通过时可以受到均匀的磁力作用，从而提高分选纯度和回收率。

手动操作在30分钟内可完成，自动分选仅需分钟，得到的细胞可立即用于后续实验。

此外，大多数MACS分选柱都是无菌包装，一次性使用，可以满足细胞培养所需的无菌条件。

BrilliantViolet多色流式介绍

355
496
515/30
Brilliant Violet BUV661
Bright
348
355
661
670/25
Brilliant VioletBUV737
Bright
348
355
737
740/35
Brilliant Violet BUV805
Dim
348
355
805
820/60
三、BD HorizonTM Brilliant Blue 515 （BB515）
5）BV 染料和 BD FACS Buffer 很好的兼容性保证能用于各种流式实验，无毒，适合做流式分选及活细胞成像
二、BUV家族BD Horizon Brilliant UltraViolet (BUV Family)
1、家族成员BUV395 BUV496 BUV737 BUV805荧光素图谱
2、各BUV荧光素信息详细介绍
3、BV421明星product介绍
BD Horizon BV421 的亮度相当于 PE 或比 PE 还要亮，比 Pacific Blue 亮 10 倍
更亮，更好的分辨率，弱表达抗原的第一选择，让 Pacific Blue 通道变得wonderful
BV421染色案例数据
4、Brilliant Violettm 染料标记流式抗体优势
710/50
Qdot705, eFluor700NC
Brilliant Violettm786
Bright
407
405
786
780/60
Qdot800
Brilliant Violet tm450
Dim
404

美天旎流式

流式细胞仪 Flow Cytometer
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。
流式细胞仪的发展及商品化
1934 Moldavanl: First try ( 固定式细胞分析-流动式)； 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系统(解决难题)； 1956 Coulter原理(血细胞计数器)； 1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用； 1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置； 1969 Vandilla等: 第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)； 1972 斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)； 1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流式细胞仪-FACS Ⅰ。 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。
如：Annexin V；如：BudU掺入染色；如：CFSE；如：aldefluor；
流式细胞术临床应用（主要血液科、检验科）
淋巴细胞亚型分析(CD3/CD4/CD8/CD19/CD16CD56)；白血病免疫分型；白血病微小残留病灶MRD检测；多发性骨髓瘤MM的检测；骨髓增生异常综合征MDS的检测；血红蛋白尿PNH的检测；造血干细胞移植CD34干细胞检测；强直性脊柱炎HLA-B27的检测； „„
一、流式细胞术基本原理
流式细胞术（flow cytometry，FCM）： ―细胞在流动的过程中检测细胞的各项指标。

流式抗体及荧光染料的选择

下又可解离为游离抗原与抗体的特性
影响因素：抗体对相应抗原的亲合力－亲合力越高，结合
越牢固，越不易解离环境因素对复合物的影响－pH、离子强度
比例性：抗原与抗体发生
可见反应需遵循一定的量比关系
前带(prezone)：抗体过量后带(postzone)：抗原过量等价带(equivalence zone)：
抗原抗体比例合适
抗原抗体反应比例性示意图
阶段性
第一阶段：特异性结合阶段，反应快，不可见
第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象
❖ 影响抗原抗体反应的因素
一、反应物自身因素
抗原:理化性状、表位种类和数目抗体:来源、特异性、亲和性、效价
二、环境因素
电解质: 生理盐水或缓冲液酸碱度: pH6～pH9（pH7.2～pH7.4）温度: 15℃～40℃（4℃ ），37℃最适
流式抗体的选择、荧光染料应用
IVD
Ⅱ类体外诊断试剂
ASR
分析物特异性试剂
RUO
仅用于研究
❖ 单克隆抗体 ❖ 混合单克隆抗体 ❖ 多克隆抗体
•荧光直标的抗体 •未标记的抗体（需要荧光标记的二抗进行间接标记检测）
•单分子荧光素 •复合分子荧光素
信噪比（S/N）：特异性荧光信号（signal）与非特异性荧光信号的比值
❖细胞自发荧光：检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光波长较长的荧光染料（如APC）可以得到较好的S/N比值。
理想荧光素
❖ 具有高的光子产量，信号强度高 ❖ 对激发光有较强的吸收，降低背景信号 ❖ 激发光谱与发射光谱之间距离较大，减少背景信号的干扰 ❖ 易与被标记的抗原、抗体或其他生物物质结合而不影响被标记

不知道分选柱该如何选择

不知道分选柱该如何选择？给你方案！美天旎的分选柱分几类，如MS、LS、LD级autoMACS column 等，那么，这些有什么区别呢，您在实验中又该如何去选择适合您的分选柱呢？首先，让我们来认识一下分选柱：美天旎的分选柱（Column）是MACS技术的核心，其特点如下：•填充有不同规格的铁珠，可分选或者去除10^7-10^10细胞；•表面亲水包被，不损伤细胞，同时保证流速；•可以将磁场放大1000-10000倍，因此只需极少的细胞表位被识别即可被磁场捕获，从而为后续实验预留足够抗原表位，如磁珠分选后的细胞无需切除磁珠即可直接染流式抗体，而不受影响。

我们知道，美天旎的MACS分选策略有阳性分选、去除分选，那我们就按两种分选策略来分析如何选择恰当的分选柱：一、阳性分选1、要分选的细胞数量：如下图所示：MS柱容纳的最大细胞上样量是2×10^8细胞（既包含阳性细胞又包含阴性细胞），而其能捕获的阳性细胞最多是10^7。

2、目的细胞是常见细胞还是稀有细胞为了在分选稀有细胞（表达频率〈5%）时得到较更高的纯度，您可以使用两个分选柱：用一根分选柱进行一次分选后，阳性成份再过一次新的分选柱。

3、大体积的细胞另外，如果您要分选的目的细胞是体积较大的特殊细胞，如原生动物细胞、人皮肤郎罕式细胞、鼻咽癌细胞、心肌细胞等，那推荐您使用Large cell column。

因为大细胞柱的铁珠间隙足够大，容许这些特殊的大体积细胞顺利通过。

二、去除分选去除分选中需要考虑以下几个因素：1您使用MACS isolation kits 或MACS microbeads吗？2 抗原表达强还是弱呢？3 您需要更高的纯度还是回收率呢？4 您需要分选多少细胞？根据这几个因素，您可以按下图的标识来选择合适的去除分选柱。

常用抗体荧光染料的选择

常用抗体荧光染料的选择随着免疫荧光技术的不断发展，荧光染料及其标记的抗体偶联物也被广泛的应用于生物学实验中。

目前，市场上抗体及蛋白标记的荧光染料主要有CFTM系列(BIOTIUM, USA); Alexa Fluor®系列(Life technology, USA); DyLight系列; Cy系列; IR Dye系列等等。

使用最多的为Alexa Fluor®系列和CFTM系列。

一、CFTM系列染料的核心对比Alexa Fluor®系列具有以下几点优势：1、新型罗丹明核心罗丹明染料以优异的耐光性和良好的荧光量子产量著称。

因此很多Alexa Fluor®染料具有罗丹明核心结构，但是，传统罗丹明的化学结构很难从长波长的荧光染料延伸至远红外区域甚至是更具挑战性的近红外区域，而且生物偶联后其水溶性并不理想。

Biotium 科学家发现从绿色到近红外多色荧光的罗丹明染料的新型化学方法。

该方法被有效的应用于CF染料的产品中，尤其是远红外CF染料，而且通过这种方法制备的染料不仅水溶性极佳而且耐光性极好。

2、特异性高的近红外染料近红外染料最大的特点是比可见光范围要大很多，大滴的染料常会导致染料水溶性低、染料聚合体多、荧光量子产量差等问题。

为了解决这些问题，许多商用的近红外染料比如AlexaFluor®、DyLight®dyes和IRDyes®近红外染料，在制备时吸附了大量的带负电荷的磺化基团，其磺化作用可以在一定程度上会提高染料的溶解性和荧光性，但这样也带来了另一些更加严重的问题，经这种染料标记的生物耦联物的非特异性结合。

Biotium的科学家用革命性的方法设计出近红外染料CF，在避免引入大量负电荷的情况下，极大的保证了染料优异的理化特性。

Biotium 近红外的CF 染料以花青或罗丹明染料为核心结构，该核心结构的特殊化学修饰限制了染料的分子内位移，从而获得染料的高量子产率和更好的水溶性。

流式抗体选择

1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL1通道检测；3）可用于荧光显微镜技术4）荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。

2、Alexa Fluor 488：激发波长488nm，最大发射波长519nm。

1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL1通道检测；3）具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜技术；4）在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4～10）。

3、Cy3：激发波长488nm，最大发射波长570nm。

1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL2通道检测；3）适用于荧光显微镜技术；4）为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于PE。

4、Cy5：激发波长633/635nm，最大发射波长670nm。

1）其标记的抗体适用于所有配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL4通道检测；3）适用于荧光显微镜技术；4）同样为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于APC。

5）与单核和粒细胞非特异性结合多，易出现假阳性结果。

5、PE：激发波长488nm，最大发射波长575nm。

1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL2通道检测；3）其荧光泯灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术，但适用于激光共聚焦显微镜技术。

6、PE-TR：激发波长488nm，最大发射波长615nm。

1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测；2）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。

7、PE-Alexa Fluor 610：激发波长488nm，最大发射波长628nm。

1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测；2）荧光强度高；3）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。

流式抗体使用说明书

流式抗体使用说明书流式抗体是一种用于检测细胞表面分子的重要工具。

它可以通过荧光标记来检测细胞表面分子的表达情况，从而帮助研究人员了解细胞的功能和特性。

在使用流式抗体时，需要注意以下几点：1. 样本的制备在使用流式抗体之前，需要对样本进行制备。

样本可以是细胞悬液、组织切片或血液等。

对于细胞悬液，需要进行细胞计数和细胞浓度调整。

对于组织切片，需要进行切片和染色等处理。

对于血液样本，需要进行红细胞溶解和白细胞分离等处理。

2. 抗体的选择在选择抗体时，需要考虑抗体的特异性和亲和力。

特异性是指抗体只能与目标分子结合，而不与其他分子结合。

亲和力是指抗体与目标分子结合的强度。

选择合适的抗体可以提高检测的准确性和灵敏度。

3. 抗体的标记在使用流式抗体时，需要将抗体标记上荧光物质。

常用的荧光物质有FITC、PE、APC等。

不同的荧光物质有不同的激发和发射波长，需要根据实验需要选择合适的荧光物质。

4. 流式细胞仪的设置在使用流式抗体时，需要使用流式细胞仪进行检测。

在使用流式细胞仪之前，需要进行仪器的设置。

包括激光的选择、荧光信号的检测、数据采集等。

不同的实验需要不同的设置，需要根据实验需要进行调整。

5. 数据分析在使用流式抗体进行检测后，需要对数据进行分析。

常用的数据分析软件有FlowJo、FCS Express等。

数据分析可以帮助研究人员了解细胞表面分子的表达情况，从而进一步研究细胞的功能和特性。

流式抗体是一种重要的细胞分析工具，可以帮助研究人员了解细胞的功能和特性。

在使用流式抗体时，需要注意样本的制备、抗体的选择、抗体的标记、流式细胞仪的设置和数据分析等方面，以保证实验的准确性和可靠性。

流式细胞所用试剂配置及荧光特性

一、流式细胞术常用试剂1、10％NaN3：将10gNaN3溶解于100ml蒸馏水中，室温保存；活体实验或在辣根过氧化酶反应中可不使用NaN3。

2、3％BSA/PBS：100ml PBS中加入3g BSA，使之溶解，再加入0.2ml 10％的NaN3。

3、500mmol/L EDTA：将186g EDTA•Na2•2H2O溶解于400ml蒸馏水中，用NaOH将PH调至8.0，补充蒸馏水至500ml，分装，高压灭菌，室温保存。

4、4％多聚甲醛：在磁力搅拌下，将4g多聚甲醛溶于100ml PBS，加入数滴NaOH，在通风柜中于60度加热，使其溶解，调整PH至7.4，使用前新鲜配制。

5、消化液：0.25％胰蛋白酶（用培养液或PBS配制）或0.25％胰蛋白酶与0.02％EDTA的混合液。

6、红细胞裂解液：NH4Cl 4.16g，KHCO3 0.5g，EDTA•2Na 0.02g，溶于100ml水中，调PH 至7.2，补充蒸馏水至500ml，4度储存，使用时需恢复至室温。

7、流式细胞抗体稀释剂：0.1mmol/L PBS液（PH 7.4）＋1％BSA＋0.1％Na2N3。

8、常用细胞破膜剂：PBS液（PH 7.4）＋1％FBS（或BSA）＋0.1％NaN3＋0.1％saponin（Sigma 的效果不错）。

9、流式细胞染色洗涤液：含2％的BSA、0.1％NaN3的PBS（PH 7.4）。

10、PI染液（保存液，10×，用于细胞周期和凋亡检测）：10mg PI溶于10ml PBS，加入2mg 无DNA酶的RNA酶，4度保存备用。

应用时，10倍稀释，每管加0.3ml～0.5ml PI染液。

11、Hanks液的配制（BSS，主要用于培养液、稀释剂和细胞清洗液，不能单独作为细胞、组织培养液）原液ANaCl 160gMgSO4•7H2O 2gKCl 8gMgCl•6H2O 2gCaCl2 2.8g溶于1000ml双蒸水原液B1）Na2HPO4•12H2O 3.04gKH2PO4 1.2g葡萄糖20.0g溶于800ml双蒸水2）0.4％酚红溶液：取酚红0.4g置玻璃研钵中，逐滴加入0.1N NaOH并研磨，直至完全溶解，约加入0.1N NaOH 10ml。

如何选择合适的流式抗体

如何选择合适的流式抗体随着流式细胞术应用领域的日益广泛，流式抗体及荧光标记产品的种类、数量也在不断增多，加上多色分析实验方案需求的增长，逐渐产生了抗体难选择、荧光难搭配等问题，给实验顺利开展带来了诸多困扰。

流式抗体如何选择，也成为了流式技术是否能被成功应用的关键因素之一。

如何从众多的流式厂商中筛选出最适合您的抗体，优宁维交给您方法：第一：满足所需抗体的基本要求（抗原、识别种属、能用于流式实验）①目标蛋白特异性：确定目的细胞的特异性表面标记或者胞内标记，确定检测指标；②识别种属：严格按照样本种属来源进行选择，流式抗体基本无法进行种属交叉反应；③可用于流式实验,说明书中明确标注经FC 实验测试，最好有实验数据图和用量说明；在查询抗体时这三要素是抗体查询必需填写项，下面是正确示范案例图1（参考优宁维官网高级查询）流式微信公众号：流式专家或UNIV-FCMsolution图1第二：确定流式细胞仪的配置（激光器+探测器）图2任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱：第一个是激发光谱（Excitation，Ex）：–是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。

–吸收波峰（最大吸收波长）。

第二个是Ex-Max 发射光谱（Emission）：–是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光。

–发射波峰（最大发射波长）：Em-Max 发射波峰--最大发射波长。

（如图2）那么荧光素跟我们的流式抗体选择有什么关系？在设计流式配色方案前，根据可能需要同时检测指标的多少，先确定需要在哪台流式细胞仪上机检测，对该仪器的参数配置，要了解以下几个方面信息：①激发器：常见的流式细胞仪有 405，488nm 和 635nm 三个激光器，不同流式仪器激光器配置不同，但有些机器在购买时只装了一个激光器，需要注意的是，型号相同的机器也未必激光配置相同;激光器是跟荧光素的激发波长相关，所选择荧光素一定是流式仪器激光激发范围内的。

流式抗体的选择

流式抗体的选择：1 流式抗体本身也是抗体，所以选择流式抗体一定要满足抗体选择最基本的条件：目标蛋白特异性，反应种属以及应用实验。

2 流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。

在流式实验过程中，尽量减少实验工序和过程，以保证实验的真实和准确性。

因此在条件允许的范围内，建议尽量用直接标记的抗体进行实验而不去做间接标记。

3 流式抗体荧光标记的选择：如果实验中检测单一指标：不同荧光标记在不同的仪器上强度不同。

FACS Calibur仪器为例：PE ＞APC ＞PE-Cy5 ＞PerCP ＞FITC ＞PerCP-Cy5.5，通常来说，PE最强，适用于弱表达抗原。

FITC强度较弱，适用于强表达抗原，使用范围比较广。

用户需根据检测的目标蛋白进行具体选择。

如果同时检测多个指标：确认流式细胞仪能检测多少个通道：流式抗体每个通道只能选择1种荧光素。

各个通道之间的荧光素可以随意搭配。

如：实验者同时检测三个指标，可以在图1中绿色、黄色和红色三个通道中各选一个适当的荧光素标记，FITC、PE和PE-cy5。

切忌所有指标选择同一个通道的荧光标记，以防止荧光的重叠和相互干扰，影响最后结果。

因此，流式细胞仪的通道越多，同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多。

常用荧光标记包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。

同型对照的选择：流式细胞实验和其他抗体相关实验有点不同的就是需要选择同型对照。

同型对照，是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，相当于实验的阴性对照。

同型对照选择与标记抗体同种属来源，同亚型，同荧光标记的抗体。

比如：抗人的CD3的PE标记的抗体，小鼠的IgG2a。

同型对照选择PE标记的小鼠的IgG2a。

流式抗体使用注意事项：1、建议实验细胞的数量和抗体的比例要适当。

细胞过量或抗体过量都可能使实验结果受影响，因此需要优化试验条件。

注：不同的流式技术对抗体的需求量有较大差异，例如传统流式细胞术（采用鞘液流系统）需要1×106个细胞为起始上样量，抗体用量为10μl，而微流式细胞术则只需5×105个细胞，抗体用量减少到5μl。

【技术资料】多色流式实验荧光素的选择

【技术资料】多⾊流式实验荧光素的选择近⼗年来流式细胞仪已经成为临床医⽣、免疫学家和细胞⽣物学家必不可少的⼯具，这项技术在不断进步。

流式细胞仪的多参数细胞分析这⼀独特的功能让⼤多数细胞分析成为了可能。

Coon⾸先提出了荧光抗体标记细胞内的⽬的蛋⽩技术，在20世纪80年代，细胞亚群仅仅通过检测单⼀的细胞表⾯标志物来确定，使⽤的单抗和荧光素很受限制。

基因表达技术的诞⽣和新的单抗以及荧光素的获得使更复杂的多参数分析成为可能。

1. 常⽤荧光素的种类及特性1）. FITC（Fluorescein）⼜称异硫氰酸荧光素，其标记的抗体适⽤于所有配备488nm氩离⼦激光器的流式细胞仪；FITC的最⼤发射波长为525nm，在流式细胞仪的FL1通道检测。

2). PE（R-Phycoerythrin）⼜称藻红蛋⽩，有R-PE和RD1的别称，其标记的抗体适⽤于所有配备488nm氩离⼦激光器的流式细胞仪；PE的最⼤发射波长为575nm，在流式细胞仪的FL2通道检测。

3). PE-TR（PE-TexasRed）/ECDPE-TR⼜名ECD，是由PE和TexasRed（TR）组合⽽成的Tandem荧光素；其标记的抗体适⽤于所有配备488nm氩离⼦激光器的流式细胞仪；PE-TR的最⼤发射波长为615nm，在流式细胞仪的FL3通道检测；PE-TR标记的抗体可⽤于毫⽡级激光器的⼩流式细胞仪，也适⽤于配备有全功率激光器的⼤流式分选仪。

4). PI（PropidiumIodide）⼜称碘化丙啶，其标记的抗体适⽤于所有配备488nm氩离⼦激光器的流式细胞仪；PI的最⼤发射波长为617nm。

在流式细胞仪的FL3通道检测。

5). PE-Cy5（TRI-COLOR，TC）⼜称TRI-COLOR或TC，是由PE和Cy5组合⽽成的Tandem荧光素；其标记的抗体适⽤于所有配备488nm氩离⼦激光器的流式细胞仪；PE-Cy5的最⼤发射波长为670nm，在流式细胞仪上⽤FL3通道检测；PE-Cy5标记的抗体可⽤于毫⽡级激光器的⼩流式细胞仪，也适⽤于配备有全功率激光器的⼤流式分选仪。

流式细胞术中应用的荧光染料介绍

流式细胞术中应⽤的荧光染料介绍当我们在进⾏多⾊流式分析的时候，对分析成功的⼀个关键影响因素是每个抗体选择何种荧光染料标记。

通常会有很多可⾏的结合，我们在做选择的时候有很多的因素需要我们去考虑。

对任何单克隆抗体，其阴性和阳性的信噪⽐相差四到六倍都取决于荧光素的使⽤。

相对的荧光强度也取决于使⽤的仪器。

⾼密度表达的抗原我们可以应⽤任何荧光素标记的抗体来检测，低密度表达的抗原就需要我们应⽤⾼信噪⽐⾼的荧光素，譬如PE或者APC标记的抗体来充分检测分离出阳性表达的细胞与阴性表达的细胞。

⾃发荧光个别的细胞有着他们各⾃特异性⽔平的⾃发荧光（荧光信号产⽣于他们⾃⾝）。

当在全波长荧光通道中进⾏观察的时候，⾃发荧光信号在长波长（>600nm）明显的降低。

对于有较⾼⽔平⾃发荧光类型的细胞，如长期组织培养的细胞，应使⽤较⾼发射波长的荧光染料（APC、APC-Cy7等）标记抗体，通常他们会有⼀个较好信噪⽐的结果。

对于那些不是有较多⾃发荧光类型的细胞，如新鲜的细胞，可以使⽤FITC 标记的抗体了。

以下为各种常⽤荧光素介绍：Alexa Fluor 488 has a spectrum almost identical to that of fluorescein isothiocyanate (FITC), but with extraordinary photostability. Because of this photostability, it has become a choice for fluorescent microscopy applications and has become popular in cytometry applications. It is detected in the FL1 detector of the FACSCalibur or FACScan. Unlike other fluorochromes with similar emission spectra, Alexa Fluor 488 is pH insensitive over a broad range.Alexa Fluor 633 is a practical alternative to APC as well as Cy5. Alexa Fluor 633 conjugates can be used in multi-color flow cytometry with instruments equipped with a second red laser or red diode. It is detected in the FL4 detector of the FACSCalibur. The FACScan cannot be used to detect Alexa Fluor 633 conjugates because the FACScan lacks a red laser or diode. Like other Alexa Fluor dyes, Alexa Fluor 633 exhibits uncommon photostability, making it an ideal choice for fluorescent microscopy.A great number of different Alexa Fluor dyes exist that are beyond the scope of this introductory fluorophore section. Many manufacturers sell directly-conjugated Alexa Fluor antibodies. Know that Molecular Probes' Zenon Antibody Labeling Kits, which are available for all of their Alexa Fluor dyes, make it possible to rapidly and quantitatively label antibodies from a purified antibody fraction or from a crude antibody preparation such as serum, ascites fluid or a hybridoma supernatant. See /servlets/publications?id=150 for specifics.Allophycocyanin (APC) is an accessory photosynthetic pigment found in blue-green algae. APC has 6 phycocyanobilin chromophores per molecule, which are similar in structure to phycoerythrobilin, the chromophore in phycoerythrin or PE. APC tandem dyes, APC-Cy5.5 and APC-Cy7, are also available. APC has a 650-nanometer wavelength absorption maximum and a 660-nanometer fluorescence emission maximum. APC can be used in flow cytometers equipped with dual lasers for multi-color analysis. Like Alexa Fluor 633, APC is excited using the helium-neon red diode laser (633 nanometers) of the FACSCalibur and is detected on the FL4 detector. APC cannot be detected on the FACScan as that instrument is not equipped with a red laser.APC-Cy7 is a tandem conjugate system that combines APC and a cyanine dye (Cy7) and has an absorption maximum at~650 nanometers. This tandem uses the efficiency of the fluorescence light energy transfer between the two fluorochromes. When excited by light from a helium-neon laser, the excited fluorochrome (APC) is able to transfer its fluorescent energy to the cyanine molecule, which then fluoresces at a longer wavelength. The resulting fluorescent emission maximum is in the deep red at approximately 767 nanometers. APC-Cy7 run on a FACSCalibur results in dim expression because the FL4 detector's optical filter is centered for APC emission (660 nanometers) and not the longer red wavelengths excited with the helium-neon diode. It is recommended that special precautions be taken with this conjugate, and cells stained with them, to protect the fluorochrome from long-term exposure to visible light.Carboxyfluorescein Diacetate (CFSE) can be used to track asynchronous cell division. Cell division results in sequential halving of the initial fluorescence, resulting in a cellular fluorescence histogram.The peaks labeled 1, 2, 3, 4 and 5 represent successive generations of CFSE-cultured cells.Cy3 and Cy5 are excited by the 488-nanometer line of an argon laser and the 633-nanometer line of a helium-neon diode or laser, respectively. These conjugates can be used in flow cytometry but typically do not give the fluorescence intensity comparable to that of PE or APC. Applications where a smaller dye is required are more appropriate for these dyes. These fluorochromes are well suited for fluorescent microscopy.Enhanced Cyan Fluorescent Protein (eCFP) cannot be analyzed using the FACScan or FACSCalibur as this molecule requires excitation in the violet range. The protein is easily detected using the violet laser of the LSRII, or the violet lines of the MoFlo's argon or krypton lasers. This molecule has an excitation maximum at 475 nanometers and is best excited using the MoFlo's 457nm line of the argon or argon-krypton mixed gas laser. Use of the 407nm violet laser of the LSRII will result in weak eCFP expression. More detailed discussion of this molecule can be found in the next section of this web site, the section on Fluorescent Proteins.Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) can be excited at 488 nanometers with a peak emission at 509 nanometers and is detected in the FL1 detector on the FACSCalibur or FACScan. The MoFlo and LSRII are able to distinguish between concurrently expressing eGFP and eYFP cells if the proper optical filters and experimental controls exist. More detailed discussion of this molecule can be found in the next section of this web site, the section on Fluorescent Proteins. Enhanced Yellow Fluorescent Protein (eYFP), a yellow-shifted variant of the eGFP molecule, is also excited at 488 nanometers with a peak emission at 535 nanometers and is also detected in the FL1 detector on the FACSCalibur or FACScan. More detailed discussion of this molecule can be found in the next section of this web site, the section on Fluorescent Proteins.Fluorescein isothiocyanate (FITC) is currently the most commonly used fluorescent dye for flow cytometry analysis. When excited at 488 nanometers, FITC has a green emission that's usually collected at 530 nanometers, the FL1 detector of the FACSCalibur or FACScan. FITC has a high quantum yield (efficiency of energy transfer from absorption to emission fluorescence) and approximately half of the absorbed photons are emitted as fluorescent light. For fluorescent microscopy applications, FITC is seldom used as it photobleaches rather quickly though in flow cytometry applications, its photobleaching effects are not observed due to a very brief interaction at the laser intercept. FITC is highly sensitive to pH extremes.Peridinin chlorophyll protein (PerCP) has a 677 nanometer maximum emission, red, when excited at 488 nanometers and is detected on the FL3 detector of the FACSCalibur or FACScan. A PerCP tandem dye is also available (PerCP-Cy5.5). PerCP is not suited for the high-powered lasing (>150mW) applications, such as on the MoFlo, due to its photobleaching characteristics. PerCP conjugates can only be obtained from Becton Dickinson and its subsidiary, Pharmingen. Phycoerythrin (PE or R-PE) has a huge absorption coefficient and almost perfect quantum efficiency. In vivo, it functions to transfer light energy to chlorophyll during photosynthesis. It is one of the brightest dyes used today and emits in theyellow/orange at about 570 nanometers. Those accustomed to fluorescent microscopy may not be familiar with this fluorochrome as it photobleaches rather quickly under a microscope.Phycoerythrin-Cy5 (PE-Cy5) is a tandem conjugate where PE is coupled to the cyan dye, Cy5. When excited by 488-nanometer light, the excited fluorochrome (PE) is able to transfer its fluorescent energy to the cyanine molecule, which then fluoresces at a longer wavelength in the red at 670 nanometers. This tandem dye is known by a confusing myriad of names to include Becton Dickinson's CyChrome, Caltag and Sigma's Tri-Color, GIBCO's RED670, Coulter's PC5, and probably others. Other PE conjugates exist, e.g., PE-Cy5.5 and PE-Cy7, that will not be discussed in this introductory fluorophore section. It is recommended that special precautions be taken with this conjugate, and cells stained with them, to protect the fluorochrome from long-term exposure to visible light.Phycoerythrin-Texas Red (PE-Texas Red) is a tandem conjugate where PE is coupled to Texas Red. Similar to other tandem conjuates, when excited by 488-nanometer light, the excited fluorochrome (PE) is able to transfer its fluorescent energy to the Texas Red molecule, which then fluoresces at a longer wavelength with a peak in the orange at 612 nanometers. This tandem is also known by other names such as Red 612 and ECD (Electron Coupled Dye). Know that PE-Texas Red conjugates run on the FACScan or FACSCalibur will result in dull expression due to the extant optical filters. This is not observed on the LSRII or MoFlo when equipped with the appropriate optical filters for this conjugate. There is considerable overlap of emission when running PE and PE-Texas Red specimens.Propidium Iodide (PI) is a membrane-impermeant dye that stains by nondiscriminately intercalating into every 4th or 5th nucleic acid base pair, binding both DNA and RNA. Once bound, PI undergoes a conformational change and becomes ~40 times brighter. Propidium iodide has a broad emission spectrum with a peak in the orange at 620 nanometers. A number of assays employ propidium iodide. Cells or nuclei with altered DNA content are identified by staining alcohol-fixed, RNAse-treated cells or nuclei with this dye (see below).The first peak (M1) on the left represents normal diploid cells. The next major peak (M2) represents tumor cells with increased DNA content and DNA index of 1.27. Propidium iodide can be combined with additional fluorescent antibodies that are specific for a unique cell population and allow for more accurate S phase analysis of multiple overlapping populations.Propidium iodide has also been employed for many years as a marker for viability as the disrupted membranes of dead cells allow the dye to pass freely to the nucleic acids. However, this dye is very sticky; it will stick to sample tubing and, given sufficient time exposure to living cells, living cells will appear to be propidium iodide positive. Given this dye's broad emission spectrum and its sticky properties, contemporary flow cytometry labs have replaced propidium iodide with other nucleic acid dyes, e.g., 7-AAD (listed below), TO-PRO-3, or DAPI, among many others, for viability measurements though propidium iodide remains the most commonly used dye for DNA content analysis.Texas Red has an excitation maximum in the yellow-orange range of the color spectrum; consequently, Texas Red cannot be excited on any of the benchtop analyzers in the core facility. It can, however, be detected using one of green laser lines of the MoFlo's argon laser but ideally using the yellow laser line of the MoFlo's krypton laser. When excited, Texas Red has an excitation maximum in the orange at 612 nanometers.7-Aminoactinomycin D (7-AAD), like propidium iodide, is a DNA intercalating dye but 7-AAD is specific for C-G base pairs. It is well suited for viability measurements and also for apoptosis experiments where it's paired with Annexin V. Unlike propidium iodide, this dye has minimal emission bleed from the FL3 detector into the FL2 (PE) detector on the FACSCalibur or FACScan. Whereas PI can be detected in either FL2 or FL3, though it is typically detected in FL2, of the FACScan or FACSCalibur, 7-AAD is detected in FL3.PE：Phycoerythrin 藻红蛋⽩；488nm，575nm（橙红）FITC，异硫氰酸荧光素 488nm，525nm（绿APC：英⽂全名：allophycocyanin，中⽂名：别藻青蛋⽩，最⼤吸收峰：650nm，最⼤发射荧光峰：660nm，适⽤于双激光流式仪，可被600-640nm波长的激光激发。

流式细胞术的染料基本要求-概述说明以及解释

流式细胞术的染料基本要求-概述说明以及解释1.引言1.1 概述流式细胞术是一种重要的细胞分析技术，它可以快速、准确地检测和分析细胞中的各种组成成分。

在流式细胞术中，染料的选择和使用是非常关键的，它直接影响到实验的结果和准确性。

因此，了解染料的基本要求对于开展流式细胞术研究至关重要。

首先，染料的选择要符合实验的目的和需要。

不同的细胞成分需要使用不同的染料进行标记，比如细胞膜表面标志物需要使用荧光标记染料，细胞内的DNA或RNA则需要使用核色素染料进行标记。

因此，在选择染料时，需要根据实验的研究对象和要解决的科学问题来决定使用什么样的染料才能达到最佳效果。

其次，染料的浓度和处理方法也是十分重要的。

染料的浓度应该适中，过高或过低都会对实验结果产生影响。

浓度过高可能导致非特异性标记或背景信号过强，而浓度过低则可能导致信号弱化或者检测不到。

此外，还需要注意染料的稳定性，某些染料可能会受到光照、温度等因素的影响而失去活性，因此在实验前需要充分了解染料的储存和处理方法，以确保其在实验过程中的稳定性和准确性。

总之，流式细胞术的染料基本要求包括选择符合实验目的和需要的染料以及合理控制染料的浓度和处理方法。

只有在满足这些要求的前提下，才能确保流式细胞术实验的准确性和可靠性。

对于未来的研究，可以进一步研究和开发更为稳定和高效的染料，并探索更多新的染料应用于流式细胞术中，以提高该技术在细胞学研究中的应用和发展。

文章结构的设计是为了使文章内容有条理、清晰、易于阅读和理解。

在本文中，文章结构的设计主要围绕着流式细胞术的染料基本要求展开。

下面是文章结构的详细描述：1.2 文章结构本文主要由引言、正文和结论三个部分组成。

1. 引言部分简要介绍了流式细胞术以及染料在其中的作用。

首先，概述了流式细胞术在生物医学研究中的重要性和应用范围。

然后，概括性地说明了文章的整体结构，并指出了引言、正文和结论的内容和目的。

最后，阐述了本文的目的，即探讨流式细胞术中染料的基本要求。

流式抗体荧光选择原则

流式抗体荧光选择（FACS）是一种流式细胞分析技术，可以用来对具有不同功能特性的细胞进行自动化分类。

它基于一种称为抗体荧光标记（AFM）的原理，通过将特定的抗原（或膜蛋白）与抗体结合，来标记细胞表面上的特定细胞表面抗原，以便在流式细胞分析仪中根据荧光强度进行选择。

FACS 有三个基本原则，它们分别是抗体标记原则，荧光原则和选择原则。

抗体标记原则指的是将抗体结合到特定的抗原上，以便将抗原与膜蛋白结合。

荧光原则则指的是将荧光标记物结合到抗体上，以便在流式细胞分析仪中可以根据荧光强度进行选择。

最后，选择原则是基于荧光强度对细胞进行选择的原则。

FACS 技术对于研究特定细胞类型的功能和表型特性非常有用，因为它可以快速、准确地识别出感兴趣的细胞类型。

它也可以用来研究不同细胞之间的关系，以及调查细胞间的相互作用。

由于 FACS 具有如此多的优势，它现在被广泛应用于生物学，免疫学和癌症研究中。

流式抗体怎么选比较靠谱？

研究细胞的手段众多，而流式细胞术有它独一无二的魅力。

流式细胞术的优点可以说是数不胜数：高速客观、富有统计意义、能够处理复杂样本、并同时获取多种参数、性能可靠、可重复性好……所以，流式细胞术也越来越广泛应用。

随着流式细胞术的日益发展，流式抗体及荧光标记产品的种类、数量也在不断增多，加上多色分析实验方案需求的增长，逐渐产生了抗体难选择、荧光难搭配等问题，因此，如何选择合适的流式抗体，也成为了流式实验是否能成功的关键因素之一。

成功的实验需要有高特异性和已验证的流式抗体，那么，流式抗体到底该怎么选择呢?我们可以从以下几个方面来看：一、要满足抗体具备的基本条件流式抗体也是一种抗体，所以你需要首先确定所需检测的目的细胞的特异性表面标记或胞内标记，我们要明白自己需要检测什么样的细胞群，想从数据中获取哪些信息。

在实验开始前，根据细胞表达水平和标记在生物学设想中的重要程度，对抗体进行排序。

二、荧光的选择荧光有强弱之分，如抗原表达弱或分群不明显的建议选择强荧光，如PE、APC;反之，抗原表达强或分群明显的建议选择最常用的弱荧光例如FITC即可。

常用荧光强弱排序程度为：PE>APC>PE-cy5Cy5>PercCPp-Cycy5.5>FITC三、多色荧光搭配根据荧光素亮度和抗原在细胞上的表达水平，对抗原和荧光素进行配对，弱表达抗原可以搭配强的荧光素。

很多实验需要同时检测几个指标，此时就需要多个荧光标记进行搭配。

如果需要做多个指标，而流式细胞仪能检测的通道不够，首先将指标归成2类，再将样本分成2份，分别进行检测。

所选各种荧光素光谱的重叠应当尽量减少，否则将会导致较大的补偿。

四、同型对照抗体同型对照，是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，类似于阴性对照，是流式细胞实验不可或缺的一项。

同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型及亚链、相同荧光标记的免疫球蛋白，也要求使用相同剂量。

流式抗体的选择和搭配荧光素的选择

流式抗体的选择第一、选择流式抗体要看清楚抗的是你的目标蛋白质，目标蛋白的物种不要搞错了，有些抗体对好几个物种的目标蛋白有反应，重要的是对你的实验有没有影响。

第二、抗体的物种是小鼠，大鼠，兔子还是什么。

以备不时之需，最好还是选择你有匹配二抗。

如果抗体还能够做荧光染色啊，western blot用途多了更好。

第三、选择流式抗体还要看荧光的颜色的选择：一是你的流式仪一定要能读，二是跟你需要counterstain的其他流式抗体错开频率。

第四、抗体的球蛋白亚型。

因为要根据这个选择isotype对照用抗体。

每个抗体分子携带的荧光分子数量也要一样才行。

最好是一个isotype你的好几个抗体都能用，就省事了。

第五、到底能测试多少样品。

有些产品介绍没说清楚，可以根据推荐的浓度计算一下。

一是这样才看出价格高低，二是根据自己需要选择大支还是小支.买多了过期也是浪费。

另外，选择流式抗体时还可以看制作抗体所用的抗原是什么，有的是肿瘤组织提取液，有的是重组蛋白，有的是肽链片断。

选用哪个跟你的实验用途有关。

有些蛋白质有很多亚型，也要注意是否测试过跟那些亚型起反应。

流式抗体搭配荧光素的原则流式抗体搭配流式荧光素主要有2个原则：第一，每个通道只能选择1种荧光素。

第二，各个通道之间的荧光素可以随意搭配，因此需要注意：1、流式抗体每个通道只能选择1种荧光素。

以Calibur为例说明，Calibur 的FL1通道选择了Alexa Fluro488就不能选FITC ，或者选择了FITC就不能选择AlexaFluro488。

Calibur的FL3通道尽管能检测PE-Texas Red，PE-Cy5，PerCP，PerCP-Cy5.5，PE-Cy7五个荧光素，但是我们搭配的时候只能选择其中1个。

2、各个通道之间的荧光素可以随意搭配：如果客户的流式细胞仪能做4个通道，在第1个原则之下，那么每个通道随便选出1个荧光素就可以组合成4个颜色。

以2跟激光的Calibur为例，Calibur各个荧光素之间可以搭配出16种组合。