细胞的形态

Hepatocyte Isolation and Culture
Hepatocytes were isolated from the liver of fed male BALB/c mice (22-25 g) by using the two-step collagenase perfusion method. After the induction of anesthesia with pentobarbital sodium (400 mg/kg ip), the peritoneal cavity was opened, and the liver was perfused in situ via the portal vein for 4 min at 37°C with calcium-free HEPES buffer and for 7 min with HEPES buffer containing 45 mg/100 ml collagenase D (Boehringer-Mannheim, Laval, QC, Canada) and 135 mg/100 ml CaCl2. The perfusion rate was set at 5 ml/min for both solutions.
（四） 抑制胶质细胞生长。培养3-5d后， 也有人认为培养7d后，用阿糖胞苷，或5FU抑制神经胶质细胞的生长。 （五） 观察。接种6-12h，开始贴壁，并有 集合现象，细胞生长突起明显，5-7d胶质细 胞增生明显，7-10d胶质细胞成片于神经细 胞下面，形成地毯，2周时神经细胞生长最
丰满，四周晕光明显，一个月后，有些神
经细胞开始退化，变形，甚至出现空泡， 一般培养2-4周最宜。
但神经细胞只能增大，而不能增殖，只能 原代，不能传代，不会有细胞周期，而且 随培养时间的延长，细胞数量在下降，但 胶质细胞可以，神经胶质细胞也可以。在 培养过程中，早期9-12d时，有较多的神经 细胞死亡，这是第一次死亡阶段，应注意 保持条件的恒定。在此之后存活下去的细 胞一般突起长而多，且相互形成突触。
体内上皮细胞生长在胶原构成的基
膜，因此培养在有胶原的底物上可
能利于生长，另外人或小鼠表皮细 胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射 线照射后）时，细胞易生长并可发 生一定程度的分化现象。降低PH、 Ca2+含量和温度，向培养基中加入表 皮生长因子，均有利于表皮细胞生 长。
表皮细胞培养
1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早 产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成0.5－ 1平方厘米小块。 2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。 3、换入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。 4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮 与真皮层分开。 5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶 中，37℃，30—60分钟。 6、反复吹打，制成悬液。 7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离 心，吸去上清。 8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清） 制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。
Fig. 5. Morphology of EGF-treated mouse hepatocytes in the presence and absence of PD-168393. Primary mouse hepatocyte cultures were incubated with medium (untreated) or EGF (50 ng/ml) in the presence or absence of 10 µM PD-168393. After 24 h in culture, EGF-treated hepatocytes were spread, and their cell surface increased compared with untreated cells. Hepatocytes treated with EGF in the presence of PD-168393 were spheroid and resembled control cells with or without PD-168393. Magnification, ×100.
Cultured Mouse Mammary Epithelial Cells
神经胶质细胞培养
神经细胞（神经元〕不易培养，只有在 适宜情况下，如接种在胶原底层上，或 加入神经生长因子和胶质细胞因子时， 可出现一定程度的分化，长出突起等现 象，但很难使之增值。而神经胶质细胞 是神经组织中比较容易培养的成分。 人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞 培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也 可形成能传代的二倍体细胞系。一般说 来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不 易自发转化，但对外界因素仍保持很好 的敏感性，
免疫荧光染色法
用于标记二抗体的荧光素： （1）异硫氰酸荧光素（FITC） 发射的荧光波长为490～619（绿色荧光） （2）四乙基罗丹明：荧光波长为540～660
（橙红色荧光） （3）DAPI或Hoechst33258 : 染核，用紫外
激发
免疫荧光的染色步骤
1、用95%乙醇固定细胞10-30 分或用冷丙酮固定 5～10分。
Cultured neuron
Cultured microglia
大鼠肝细胞的培养(成年)
培养液: Koga 培养液, 最好加入Williams 和 Waymouth MB752/1)
消化液:型胶原酶300U/mg, 使用浓度为 0.025%
方法: 1 灌流法分离肝细胞：门静脉和下腔 插管静脉插管
Neuronal culture
1. Rat pups aged l-l 5 d, were killed by cervical dislocation.
2. Cortex placed in Earle’s balanced salt solution (BSS) at 37°C. and cut into 500 urn slices
2、用PBS洗3次。 3、用PBS配制的1‰Triton 10分。用PBS洗3次 4、用2%～5%BSA封闭2 小时 5、加入一抗过夜，PBS洗3次 6、加入二抗1～2小时， PBS洗3次 7、核复染，荧光显微镜观察。
正常细胞和组织的培养
一、上皮细胞培养(epithelial culture) 上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、 乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮 组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但 上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培 养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以 纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存， 因此纯化和延长生存时间是培养关键。
3. Slices of visual cortex were incubated at 37°C with gentle stirring in 10 ml of enzyme solution
获取脑组织后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置 Hanks液中漂洗一、二次。 2、置于30—50倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较 柔软，反复吹打即制成细胞悬液。 3、把悬液注入离心管室温中直立5—10分钟后，细胞 或细胞团快自然下沉，脂肪等杂物易漂浮，可吸除上 层、反复二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并 获较多细胞成分。 4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网过滤，计数 并调整细胞密度。 5、接入培养瓶或皿中，置5%CO2温箱中培养。 该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。贴壁后 短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长后即 能迅速进入旺盛的增殖状态。细胞传代可以0.25%胰酶 消化处理。
5、然后重新悬浮于WE培养基中(含10%血 清, Insulin 0.2 U/ml, L-Glutamine 0.292 mg/ml， 100 nM dexamethas源自文库ne )。
6、Isolated cells were plated on collagen type Icoated dishes in medium I consisting of Williams‘ medium E 。
细胞形态学检查
一、倒置显微镜观察细胞的形态 （一）一般的形态学观察： （二）用相差显微镜观察细胞的形态 （三）荧光显微镜观察细胞的形态和结构
Identification of cultured adult rat RGCs. Cultured cells were co-labeled with anti-Thy-1 antibody (A), anti-NF-L antibody (B), and DAPI (C). (D) A digitally merged image simultaneously represents all three fluorescent labels. (E) The corresponding phase-contrast image.
2、用预灌流液(8.3 mg/ml NaCl,0.5 mg/ml KCl,2.4 mg/ml HEPES,pH 7.4)灌流8分钟
3、用含0.05%胶原酶的灌流液(预灌流液中 加入5 mmol/LCaCl2, 0.05%胶原酶)继续灌流 10分钟。
4、将肝叶剪下,将消化好的肝细胞轻轻刮下, 获得的肝细胞悬液离心(600 r/min)三次,每次 2分钟
The cells were used only if cell viability, as determined by trypan blue exclusion, was >80%. The cells were seeded onto plastic petri dishes (26,000 cells/cm2) in Williams' medium E (GIBCO BRL, Toronto, ON, Canada) supplemented with 10% fetal bovine serum (GIBCO BRL) and allowed 90 min to attach. The serumcontaining medium was then removed, and the cells were subjected to different culture conditions in serum-free medium.
大鼠心肌细胞的培养
新生大鼠鼠龄的选择
新生大鼠心肌细胞在出生后3d内具有部分 的增殖能力,成年大鼠心肌细胞则为终末分 化细胞,不再具有分裂增殖能力.因此,大鼠出 生时间越短,其心肌细胞分离后成活率越高, 越容易贴壁生长.大量观测表明,选择13 d龄 大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理 想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果 最佳.
神经细胞分散培养
（一） 选材 常用胚胎动物或新生鼠神经组织。鸡 胚常用胚龄6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚 胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以 19d为宜，小鼠以18d为宜，大鼠纹状体以10d为宜； 若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚，则黑质以13d， 纹状体18-21d为宜；小脑以20-21d小鼠胚胎，所获 蒲氏细胞成活率高，颗粒细胞正在分化；脊髓与 DRG联合培养，常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎， 取材易，神经成活率高。
(二） 取材。脑则取出相应组织，在解剖液 中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓则固定于 琼脂板上，用小刀将其要成背腹两侧，分 别培养。
（三） 细胞分离与接种。神经组织用0.1250.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接种 液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用细 口吸管吹打细胞悬液，使其充分分散，如 此多次，待沉淀后吸出上层细胞悬液，计 数，预置细胞密度，接种于培养皿 （1×106），做电生理应为5×105或更低。