StepOneV2.X 相对定量简易操作流程
DISOCONT定量给料机简要操作说明(BV-H2061CH)
DISOCONT定量给料机简要操作说明(BV-H2061CH)DISOCONT VDB WEIGHFEEDER OPERATING INSTRUCTIONSDISOCONT VDB WEIGHFEEDER定量给料机简要操作说明书BV-H2061CH Copyright (版权所有)：All rights reserved. Any reproduction of the manual, regardless method, without prior permission by SCHENCK PROCESS GmbH in writing, even by excerpt, is prohibited.版权所有，未经德国申克公司书面许可，任何人不得翻印或摘录。
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ABI Step One型荧光定量PCR仪标准操作指南
StepOne 型荧光定量PCR仪操作规程：1.StepOne 上机可由两种方式来进行：由StepOne Software Quick Start进行上机或由StepOne 机器面板直接触控上机。
2.由StepOne Software Quick Start进行上机：开启StepOne Software v2.0 进入主画面后点选Quick Start 窗口进行快速上机设定。
进入Experiment Properties后输入：Experiment Name及档案储存位置；选择Experiment Type 选择使用荧光系统；选择Ramp Speed选择实验样品种类；点选Run Method确定PCR 反应条件是否需要修改后，按下START RUN。
如欲使用StepOne 机器上VeriFlex Block的功能，请由左方Setup功能列上点Plate Stepup窗口，在“Assign Targets and Samples”窗口下，勾选Enable VeriFlex Block选项，此时Block即被分成六个区块。
接着点选Run Method，在run program上点一下欲调整的温度步骤，选择“Set different temperatures for one or more zones”并设定每个区块的温度（两相邻区块温度差异不可以超过5度，第一和第六区块最多可差异25度）。
按下Start Run Now进行data 收集，反应结束后，则会回到“Main Menu”画面，触控Collect Result将data 存出。
3.由StepOne 机器面板直接触控上机：开启电源后，进入主画面，由触控式屏幕来进行StepOne 的设定。
按下TaqMan cDNA（Standard）进入PCR Thermal Cycle Program，可利用下面工具列再重新编辑反应条件，如果条件相同则直接按下Save。
定量测量操作教程
波长：546.0nm
09：21：19 D2 W
系统主菜单
①光度计模式 ②定量测量 ③光谱扫描 ④动力学测量 ⑤DNA/蛋白质测量 取消 上翻 下翻 选取
主菜单界面下，通过向下”方向键“，或”下翻“功能键，选择”定量测量“。
ENTER 点击“选取”功能键，或点
，进入“定量测量”。
波长：546.0nm 定量测试
Abs
09：21：19 D2
ID Conc.（mg/L）
1
0.000
W 波长（nm） 450.0
C = 1.000+1.000*A^1 拟合方法 系数
r = 1.000 标样设定 曲线
在“拟合方法”内选择“线性拟合后”，此处方程即变为线性方程 拟合方法”内选择“线性拟合后”
标样法做曲线
波长：546.0nm 定量测试
检索 C = 1.000+1.000*A^1 请输入标样含量：1_ r = 1.000
2号样品的浓度数值 号样品的浓度数值
波长：546.0nm 标样含量设置
Abs：
Abs
09：21：19 D2 W 波长（nm） 450.0
ID Conc.（mg/L）
1 2
0.000 0.000
检索 C = 1.000+1.000*A^1 请输入标样含量：1_ 输入完毕后，点击
C = 0.000*A^1 单位
r = NaN
拟合曲线
波长：546.0nm 定量测试
ID
Abs：
Abs Conc.（mg/L）
09：21：19 D2 W 波长（nm） 546.0
当前方程
检索 翻滚 C = 0.000*A^1 单位 r = NaN
ABI Stepone plus荧光定量PCR仪操作规程
ABI Stepone plus荧光定量PCR仪操作规程一、创建新实验使用StepOne 软件中的Design Wizard （设计向导）创建新实验。
1. 双击（StepOne 软件快捷键），或依次选择Start （开始）→All Programs （所有程序）→Applied Biosystems →StepOne →StepOne v2.0。
2. 从Home （主页）屏幕上，单击Design Wizard （设计向导）以打开Design Wizard （设计向导）屏幕。
二、定义实验属性1. 单击Experiment Name （实验名称）字段，然后输入Comparative CT Example （比较CT 示例）。
注意：实验标题会以您输入的实验名更新。
2. 单击Barcode （条码）字段，然后输入您的PCR 反应板上的条码。
3. 单击User Name （用户名）字段，然后输入Example User （示例用户）。
4. 单击Comments （注释）字段，然后输入Comparative CT Getting Started Guide Example （比较CT 入门指南示例）。
5. 选择Quantitation （定量）实验类型。
6. 单击Next> （下一步）。
三、定义方法和材料1. 选择Comparative C T (△△C T) （比较CT (△△CT)）作为定量方法。
2. 为试剂选择TaqMan®Reagents（TaqMan 试剂）或SYBR®Green Reagents （SYBR Green 试剂）。
3. 将Standard （标准）选为升降温速度。
4. 为模板类型选择cDNA (complementary DNA) （cDNA （互补DNA））。
5. 单击Next> （下一步）。
四、设置Targets1. 单击How many targets do you want to quantify in the reaction plate? （您想在反应板中定量多少靶？）字段，然后输入2。
StepOne荧光定量PCR仪操作规程
编号：XXXXX—2013
第0次修订
标题：StepOne荧光定量PCR仪简易操作规程
第1页共3页
实施日期2013年02月01日
StepOne荧光定量PCR仪简易操作规程
1操作步骤
1.1仪器开/关机程序
1.1.1开机程序
A.打开电脑，进入桌面；
B.打开ABI STEP ONE仪器背面的电源开关；
操作规程
编号：XXXXX—2013
第0次修订
标题：StepOne荧光定量PCR仪简易操作规程
第2页共3页
实施日期2013年02月01日
1.2.5查看反应设置：
在Set Up Reaction Setup屏幕上，输入要准备的反应体积和额外反应数，然后查看PCR母液、检测预混液、稀释后样本靶以及样本储液的浓度设置，并在必要时作出修改；
1.2.6实验材料：
在Order Materials List屏幕上，查看建议用于准备反应板的材料列表，将建议您使用订单中显示的材料；
1.2.7完成Design Wizard工作流程：
在Review Plate Layout for Experiment对话框中，选择一个选项以完成设计向导设置、查看反应板布局并开始运行。
1.3运行实验
1.3.1打开实验：在StepOne软件中，单击Open，选择相应程序，单击Open；
1.3.2仪器操作程序
装载反应板：打开扩增仪抽屉，将反应载体放置在样本加热块中；小心地关闭扩增仪抽屉；点击Start run，启动程序运行；
卸载反应板：当程序运行完成时，打开扩增仪抽屉，从样本加热块中取出反应板，小心地关闭扩增仪抽屉。
编制
审核
批准
1.4数据分析
StepOne培训手册
StepOne培训手册二零零八年八月StepOneTM荧光定量PCR 检测系统培训手册内容一、StepOne TM荧光定量PCR检测系统介绍二、系统安装条件三、培训所需试剂设备及样品四、培训程序及时间安排五、实验操作流程六、软件使用培训七、常见问题解答八、软件及主机常见问题处理一、StepOne TM荧光定量PCR检测系统介绍1.1 简介美国Applied Biosystems公司拥有PCR以及定量PCR技术的双重专利，一直以来致力于PCR技术的开发和应用。
StepOne TM是Applied Biosystems公司推出的第四代荧光定量PCR检系统，这套系统除了秉承Applied Biosystems 公司荧光定量PCR仪一贯稳定的性能，以及精确、可靠的结果保证外，还配备了最新一代易于操作的定量分析软件，同时可以通过触摸屏实现对仪器的控制，使用者还可以通过远程网络进行仪器监控，这些功能，都使得荧光定量PCR实验变得前所未有的方便。
正是得益与其高度灵活性和易用性，甚至对于先前从未有过实时定量PCR经验的科研人员来说，也非常有信心设置和操作StepOne扩增仪。
2007年StepOne TM还获得了SelectScience 评选的2007年度最佳生命科学新仪器奖。
1.2 专利的多组分算法荧光定量过程要求每种荧光染料的真实荧光能够辨别区分，StepOne TM系统采用Applied Biosystems公司专利的多组分算法，保证了检测装置能方便无荧光污染的进行检测。
同时配备波长范围较宽的滤光片，可以收集更多的光信号，提高了信噪比和灵敏度。
图1-1：专利的多组分算法1.3 光学模块StepOne TM采用蓝色高功率的光子发射二极管（LED）和高灵敏度的PDT来来激发和检测三种不同的光谱。
LED由于是单一波长激发，荧光信号强，消耗低，稳定，寿命长，可以连续使用40年；PDT 灵敏度高，逐一检测避免了样品间的荧光干扰。
相对定量简易操作流程SDS1.4
applied biosystems 7300/7500/7500 FastReal‐Time PCR System相对定量简易操作指南SDS 1.41. 仪器启动1.1. 打开计算机，待开机完成后再打开 7300/7500/7500 Fast 主机电源；1.2. 待仪器自检完成显示绿灯常亮后，双击计算机屏幕上的软件快 捷图标 开启ABI Prism 7300/7500/7500 Fast SDS软件 ；2. 实验文件设置2.1. 点击进入Create New Document界面：2.2. 在New Document Wizard界面中：在Assay中选择 ddCt (Relative Quantitation) Plate ○1 ，点击Next ○2；2.3. 编辑Detector：2.3.1.选中此次实验所用的Detector ○1，点击Add将Detector加入 Detectors in Document ○2，点击Next○3；2.3.2. 新建Detector：点击New Detector建立新的Detector○1，输入相应信息后点击ok○2，点击Next ○3；也可点击 Create Another，继续添加Detector；Name: 输入基因名称；Reporter Dye: 选择荧光种类；Quencher Dye: MGB 淬灭基团选None；TAMRA淬灭基团选TAMRA；SYBR 选 none；2.3.3. 删除Detector：如果文件中Detector过多需要删除，则在set up 界面中，点击Tools，并在下拉菜单 Detector Manager 中选择不需要的Detector 进行删除；2.4. 命名样品：选定Plate Document 中放样品的孔，选择Detector，在Detector列中Use下勾选○1，同时在Task栏中选择样品的种类○2：Target （目的基因），ENDO（内参基因），点击Finish○3；2.5. 保存文件：点击 File，在下拉菜单中选Save As，输入文件名称并存成SDS Document (*.sds) 的格式；2.6. 设置PCR反应条件：Plate Document 上点击Instrument，进入PCR反应程序设定窗口，可直接更改温度和时间，也可以利用Add Cycle，Add Hold，Add Step或Delete来更改反应步骤，信号收集设置在延伸步骤；使用 SYBR染料法，则点击Add Dissociation Stage添加熔解曲线步骤；3. 结果分析：3.1. 分析查看相对定量数据：运行结束后，单击分析数据；3.2. 在Results选项卡下查看扩增结果：3.3. 相对定量研究分析：点击File，选择New，进入New document Wizard，在Assay中选择ddCt (Relative Quantitation) study○1，点击Next○2；3.3.1. 单击Add plates添加反应板，然后单击Open；在一个RQ研究中最 多可添加10个反应板，单击Finish；如果要同时分析多个plate document，必须确认:a.所有PCR反应板的条件必须一致；b. 正确设置sample name；c. 所有PCR反应板需要有相同的内参基因；3.3.2. 数据分析：选择数据显示方式○1，选择对照样品○2，选择柱状图显示方式○3，进行分析○4；3.4. 导出数据：可点击File，在下拉菜单中选择Export，接着选择Results，导出 .csv数据，用Excel打开。
分析天平的使用和定性定量基本操作
基本构造：
• (3开关旋钮(升降枢) • 升降枢：用于启动和关闭天平。 • 启动时，顺时针旋转开关旋钮，带动升降枢，控制与
其连接的托叶下降，天平梁放下，刀口与刀承相承接， 天平处于工作状态。关闭时，逆时针旋转开关旋钮， 使托叶升起，天平梁被托起，刀口与刀承脱离，天平 处于关闭状态。 • 盘托：安在称盘下方的底板上，受开关旋钮控制。关 闭时，盘托支持着称盘，防止称盘摆动，可保护刀口。 (4) • 通过转动指数盘加减环形码(亦称环码)。 • 环码分别挂在码钩上。称量时，转动指数盘旋钮将砝 码加到承受架上。环码的质量可以直接在砝码指数盘 上读出。指数盘转动时可经天平梁上加10-990mg砝码， 内层由10-90mg组合，外层由100-900mg组合。大于 1g的砝码则要从与天平配套的砝码盒中取用(用镊子夹 取)。
（二）、定量分析基本操作练习
（1）容量瓶的使用 检漏，称样，（烧杯）溶解，转移，洗涤 （烧杯），定容 p34 注：完全溶解，定量转移，3次洗涤，定容 准确。
（2）移液管的使用 取20.00ml或25.00ml溶液至锥形瓶。 注：右手移液管，左手吸耳球，取放靠内 壁。
（三）、分析天平的使用
• 1. 固定质量称量法 • 称取0.5000g NaCl两份。 • （1）将干燥洁净的表面皿或小烧杯，在台秤
取样品。 • （２）取一洁净，干燥的称量瓶，加入约１克试样
（NaCl粉未），先台秤粗称重，再在分析天平上称重 （准确至0.1毫克）记下重量为Ｗ1克，（称量瓶需用 洁净的塑料薄膜或纸条套住后放在天平上称量）。然 后用右手自天平盘上将称量瓶取下（用纸裹上），将 它举在准备放试样的容器上方，用左手纸条将其盖打 开，并将盖也举在烧杯上方，以防止沾在盖上的试样 落在烧杯外。用盖轻轻敲击瓶口,不要使试样细粒撒落 在烧杯外。 转移试样0.3～0.4克于烧杯中, 需多次转样， 每次转样毕, 应把称量瓶慢慢竖起,用盖将称量瓶口样 品慢慢敲下，将盖盖好,再放在天平上称量，直至达到 要求，记下重量为Ｗ2，以同样的方法转移试0.3～0.4 克于烧杯２中 ，再准确称出称量瓶+剩余试样的重量 为Ｗ3克。
StepOnePlus型PCR仪操作规程和PCR仪简易设置指南设计
StepOnePlus型PCR仪操作规程1.StepOnePlus上机可由两种方式来进行：由StepOne Software Quick Start进行上机或由StepOnePlus 机器面板直接触控上机。
2. 由StepOne Software Quick Start进行上机：开启StepOne Software v2.0 进入主画面后点选Quick Start 窗口进行快速上机设定。
进入Experiment Properties后输入：Experiment Name及档案储存位置；选择Experiment Type选择使用荧光系统；选择Ramp Speed选择实验样品种类；点选Run Method确定PCR 反应条件是否需要修改后，按下START RUN。
如欲使用StepOnePlus机器上VeriFlex Block的功能，请由左方Setup功能列上点Plate Stepup窗口，在“Assign Targets and Samples”窗口下，勾选Enable VeriFlex Block选项，此时Block即被分成六个区块。
接着点选Run Method，在run program上点一下欲调整的温度步骤，选择“Set different temperatures for one or more zones”并设定每个区块的温度，请注意两相邻区块温度差异不可以超过5度，第一和第六区块最多可差异25度。
按下Start Run Now进行data 收集，反应结束后，则会回到“Main Menu”画面，触控Collect Result将data 存出。
2.由StepOnePlus 机器面板直接触控上机：开启电源后，进入主画面，由触控式屏幕来进行StepOnePlus 的设定。
按下TaqMan cDNA（Standard）进入PCR Thermal Cycle Program，可利用下面工具列再重新编辑反应条件，如果条件相同则直接按下Save。
QS 6 7 相对定量简易操作指南
Applied Biosystems QuantStudio6&7实时荧光定量PCR仪V1.X相对定量简易操作流程1.双击桌面图标，或从Start>All programs>Applied Biosystems>QuantStudio™Real-Time PCR Software>QuantStudio™Real-Time PCR Software开启软件。
进入主界面后选择“Experiment Setup”。
2.选择“Setup”下的“Experiment Properties”界面。
2.1输入实验名称(Experiment Name)。
2.2选择仪器类型及Block类型。
2.3选择相对定量实验类型，“Comparative C T”。
2.4选择试剂种类。
Taqman探针法选择“Taqman Reagents”，SYBR染料法选择“SYBR Green Reagents”。
2.5选择运行模式。
普通试剂选择“Standard”，快速试剂选择“Fast"。
3.选择“Setup”下的“Define”界面设置基因名称(Target)和样品名称(Sample)。
3.1在“Targets”下点击“New”，添加待测基因。
在“Target Name”中编辑基因名称，“Reporter”和“Quencher”中选择所标记的荧光基团及淬灭基团。
对于“Quencher”的选择，如果是MGB探针，请选择NFQ-MGB；如果是TAMRA探针，请选择TAMRA；如果是其他形式的非荧光淬灭基团则选择None。
3.2在“Samples”下点击“New”，添加待测样品。
在“Sample Name”中编辑样品名称。
3.3在“Analysis Settings”下选择合适的“Reference Sample”（对照样品）和“Endogenous Control”（内参基因）。
4.选择“Setup”下的“Assign”界面编辑样品板。
StepOneV2.X 绝对定量简易操作流程
applied biosystems StepOne/StepOnePlus荧光定量PCR仪绝对定量实验简易操作流程SDS 2.2StepOne/StepOnePlus定量PCR仪绝对定量实验简易操作流程1.双击桌面图标，或从Start > All Programs > Applied Biosystems > StepOneSoftware> StepOne Software V2.2开启软件。
进入主界面后选择Advanced Setup 。
2.进入Setup下的Experiment Properties界面：2.1输入实验名称（Experiment Name）2.2选择仪器型号2.32.3在实验类型中，选择Quantitation-Standard Curve2.4选择试剂种类2.5选择运行模式3.进入Setup下的Plate Setup界面，设置基因（Target）及样本（Sample）：3.1在左边界面中设置基因及样本。
利用 按钮添加新的基因，并在Target Name中编辑基因名称，Reporter和Quencher中选择所标记的荧光基团及淬灭基团。
对于Quencher的选择，如果是MGB探针，请选择NFQ-MGB；如果是TAMRA探针，请选择TAMRA；如果是其他形式的非荧光淬灭基团（如BHQ），请选择None。
也可以利用其他按钮保存（Save Target）或删除（Delete Target）已添加的基因。
利用 按钮添加样本，在Sample name中编辑样本名称。
3.2在右边 界面中进行样品板的排布。
利用鼠标单选或拖曳以选择反应孔，然后勾选左侧的基因及样本，同时在Task选项中指定该反应孔的类型（S 代表标准曲线数据点，U代表未知样本，N代表阴性对照）。
3.3设置标准曲线：利用鼠标单选或拖曳以选择反应孔（一般情况下，每个梯度设置三个副孔），而后勾选左侧的基因，在Task选项中选择S，然后在Quantity中输入拷贝数。
StepOnePlus型PCR仪操作技巧规章和PCR仪简单设置指南
StepOnePlus型PCR仪操作规程1.StepOnePlus上机可由两种方式来进行：由StepOne Software Quick Start进行上机或由StepOnePlus 机器面板直接触控上机。
2. 由StepOne Software Quick Start进行上机：开启StepOne Software v2.0 进入主画面后点选Quick Start 窗口进行快速上机设定。
进入Experiment Properties后输入：Experiment Name及档案储存位置；选择Experiment Type选择使用荧光系统；选择Ramp Speed选择实验样品种类；点选Run Method确定PCR 反应条件是否需要修改后，按下START RUN。
如欲使用StepOnePlus机器上VeriFlex Block的功能，请由左方Setup功能列上点Plate Stepup窗口，在“Assign Targets and Samples”窗口下，勾选Enable VeriFlex Block选项，此时Block即被分成六个区块。
接着点选Run Method，在run program上点一下欲调整的温度步骤，选择“Set different temperatures for one or more zones”并设定每个区块的温度，请注意两相邻区块温度差异不可以超过5度，第一和第六区块最多可差异25度。
按下Start Run Now进行data 收集，反应结束后，则会回到“Main Menu”画面，触控Collect Result将data 存出。
2.由StepOnePlus 机器面板直接触控上机：开启电源后，进入主画面，由触控式屏幕来进行StepOnePlus 的设定。
按下TaqMan cDNA（Standard）进入PCR Thermal Cycle Program，可利用下面工具列再重新编辑反应条件，如果条件相同则直接按下Save。
Step One Plus 相对定量： ΔΔCT法和相对标准曲线法
相对定量结果计算
Sample
Time 0
Plat 1 Average
Ct
30.49
GAPDH Average
Ct
23.63
∆Ct Plat 1 － GAPDH
6.86
∆∆Ct ∆Ct treated
－∆Ct untreated
0.00
Fold difference in
Plat 1 relative to untreated
1.0
Time= 12 hr
27.03
22.66
4.37
-2.50
5.6
Time = 24 hr
27.06
23.20
3.86
-3.00
8.0
Time = 48 hr
32.83
23.01
9.82
2.96
0.13
41
相对定量结果
Gene Expression
8 7
5.6
6
5 4 3
2
1
1
8.0 0.13
100% !
22
∆∆Ct法如何判断扩增效率一致
同时扩增目的基因和内参基因， 通过 查看扩增曲线中指数增长期是否平行来确 定扩增效率是否相似。
23
检查指数增长期的曲线之间是否平行
内参基因 目的基因
24
∆∆Ct法如何确认扩增效率接近100%
每对引物一条标准曲线
25 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/9/2011
18
0.0116 ʸ 0.0116 = 1 0.0484 ʸ 0.0116 = 4.2
StepOne软件操作指南
Applied Biosystems StepOne™Real-Time PCR System简易操作指南美国应用生物系统公司StepOne定量PCR仪简易设置指南1启动电脑，打开定量PCR仪电源开关，双击桌面“StepOne Software”图标，出现Login登录界面，点击“OK”，打开软件。
2 起始界面如图所示，点击红色椭圆的三角图标，展开软件功能按钮。
3 点击左侧“Set Up”功能选项中的“Advanced Setup”高级设置向导。
4 在打开的设置界面，左侧为导航树，选择不同的功能选项，右侧显现为不同的设置功能。
默认条件下，显示为“Experiment Properties”实验属性。
5 右侧界面，带有红色*号位置需要输入或者通过鼠标进行选择。
不带*号位置为选填，可以保持空白。
在途中位置输入实验名称，该名称根据需要进行填写。
6选择仪器类型、实验类型、荧光标记方法以及反应速度。
7 左侧导航树，选择“Plate Setup”设置选项。
右侧“Define Targets”选项下“Target Name”处设置检测基因的名称，如FluA，Reporter下拉菜单选择“FAM”，Quencher下拉菜单选择“None”。
8 点击“Add New Target”，并按照第7步所述进行设置。
根据需要添加所需基因，如SWH1、SWFluA1和RNP。
9 在“Define Samples”填写检测样本的名称，如果需要多个样本，通过“Add New Sample”添加多个样本。
10 鼠标点击“Assign Targets and Samples”切换设置界面。
鼠标滑倒图中椭圆所处位置，变化为双向箭头，通过拖动鼠标，可以改变左右两侧窗口大小。
11 鼠标选择样品放置的位置，如B4，鼠标勾选样品名称及所要检测的基因。
根据样品孔的数量，依次进行设置。
12 鼠标拖动椭圆位置，向下拖动。
在“Select the dye to use as the passive reference ”的下拉菜单处选择“None”。
StepOne荧光定量PCR仪操作规程
实施日期2013年02月01日
对RNase P实验问题排除故障。
3系统维护
3.1定期检查磁盘空间，备份实验数据，以便保证有足够的磁盘空间运行实验；
3.2每周用无绒布擦拭仪器表面，或仪器使用完后遮盖起来防止灰尘，忌用有机溶剂清洗仪
器；
3.3加热孔可以用酒精棉球擦洗，但在清洗前应注意加热板的温度需降至室温；
1.2.6实验材料：
在Order Materials List屏幕上，查看建议用于准备反应板的材料列表，将建议您使用订单中显示的材料；
1.2.7完成Design Wizard工作流程：
在Review Plate Layout for Experiment对话框中，选择一个选项以完成设计向导设置、查看反应板布局并开始运行。
值大于或等于0.990，则仪器良好，得到的结果可信；若结果为失败，或者R2值小于0.990，
则需参阅《Applied Biosystems StepOne™Real-Time PCR System安装、联网和维护指南》以
操作规程
编号：XXXXX—2013
第0次修订
标题：StepOne荧光定量PCR仪简易操作规程
操作规程
编号：XXXXX—2013
第0次修订
标题：StepOne荧光定量PCR仪简易操作规程
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实施日期2013年02Байду номын сангаас01日
1.2.5查看反应设置：
在Set Up Reaction Setup屏幕上，输入要准备的反应体积和额外反应数，然后查看PCR母液、检测预混液、稀释后样本靶以及样本储液的浓度设置，并在必要时作出修改；
1.4数据分析
1.4.1单击Analysis；
StepOneV2.X 相对定量简易操作流程
applied biosystems StepOne/StepOnePlus荧光定量PCR仪相对定量实验简易操作流程SDS 2.2StepOne/StepOnePlus定量PCR仪相对定量实验简易操作流程1.双击桌面图标，或从Start > All Programs > Applied Biosystems > StepOneSoftware> StepOne Software V2.2开启软件。
进入主界面后选择Advanced Setup 。
2.进入Setup下的Experiment Properties界面：2.1输入实验名称（Experiment Name）2.2确认仪器型号2.32.3在实验类型中，选择Quantitation-Comparative C T (ΔΔC T)2.4选择试剂种类2.5确认运行模式3.进入Setup下的Plate Setup界面，设置基因（Target）及样本（Sample）：3.1在左边界面中设置基因及样本。
利用 按钮添加新的基因，并在Target Name中编辑基因名称，Reporter和Quencher中选择所标记的荧光基团及淬灭基团。
对于Quencher的选择，如果是MGB探针，请选择NFQ-MGB；如果是TAMRA探针，请选择TAMRA；如果是其他形式的非荧光淬灭基团（如BHQ），请选择None。
也可利用其他按钮保存（Save Target）或删除（Delete Target）已添加的基因。
利用 按钮添加样本，在Sample Name中编辑样本名称。
3.2在右边 界面中进行样品板的排布。
利用鼠标单选或拖曳以选择反应孔，然后勾选左侧的基因及样本，同时在Task选项中指定该反应孔的类型（U 代表未知样本，N代表阴性对照）。
3.3 在Select Relative Quantitation Settings 中（参看上图）选择对照样本及内参基因。
Stepone安装培训
F
5 primer 3 ' ' 5 '
5 ' 3 '
5
' R primer
5 3 ' ' 5 '
5 ' 3 5 ' '
5 3 ' ' 5 3 ' '
5 ' 3 5 ' '
5 ' 3 5 ' ' 5 ' 3 5 ' '
PCR动力学曲线和四个阶段
线性图谱
平台期
线性增长期 指数增长期 基线期
平台期 线性增长期 指数增长期
logX log(R R ) logR 0 Ct B S Ct log(1 E) log(1 E)
Ct = - k lg X0 + b （线性方程）
标准曲线
Ct值
CT = - k lgX0 + b
lg [起始浓度的]
Байду номын сангаас 内容提要
定量PCR的数学原理
定量PCR的化学原理
仪器的维护
仪器的日常维护
每周
检查计算机磁盘空间，归档或备份实验文件 关闭控制计算机，30秒后再次打开计算机电源 用不脱毛布块清洁仪器表面 整理计算机硬盘驱动器碎片
每月
执行背景校准
1.5年
执行空间校准 执行染料校准
仪器的日常维护-背景校准
操作步骤
1. 将背景反应板放入仪器中，在 软件界面，依次选择Instrument → Instrument Maintenance Manager
探针法
TaqMan---水解型杂交探针
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applied biosystems StepOne/StepOnePlus
荧光定量PCR仪
相对定量实验简易操作流程
SDS 2.2
StepOne/StepOnePlus定量PCR仪
相对定量实验简易操作流程
1.双击桌面图标，或从Start > All Programs > Applied Biosystems > StepOne
Software> StepOne Software V2.2开启软件。
进入主界面后选择Advanced Setup 。
2.进入Setup下的Experiment Properties界面：
2.1输入实验名称（Experiment Name）
2.2确认仪器型号
2.3
2.3在实验类型中，选择Quantitation-Comparative C T (ΔΔC T)
2.4选择试剂种类
2.5确认运行模式
3.进入Setup下的Plate Setup界面，设置基因（Target）及样本（Sample）：
3.1在左边界面中设置基因及样本。
利用 按钮添加新
的基因，并在Target Name中编辑基因名称，Reporter和Quencher中选择所标记的荧光基团及淬灭基团。
对于Quencher的选择，如果是MGB探针，请选择NFQ-MGB；如果是TAMRA探针，请选择TAMRA；如果是其他形式的非荧光淬灭基团（如BHQ），请选择None。
也可利用其他按钮保存（Save Target）或删除（Delete Target）已添加的基因。
利用 按钮添加样本，在Sample Name中编辑样本名称。
3.2在右边 界面中进行样品板的排布。
利用鼠标单选或拖曳以选
择反应孔，然后勾选左侧的基因及样本，同时在Task选项中指定该反应孔的类型（U 代表未知样本，N代表阴性对照）。
3.3 在Select Relative Quantitation Settings 中（参看上图）选择对照样本及内参基因。
4. 在Setup 下的Run Method 界面，设定反应条件。
5. 如果想使用StepOnePlus 仪器上的VeriFlex TM
Block 温度梯度功能，需要先在
界面下，勾选Enable VeriFlex TM Block 选项。
此时Block 即被
分成六个区块。
（此功能仅限StepOnePlus 机型)
然后在Run Method界面中，点击想要调整的温度步骤，
在弹出的界面中，选择并设定每个区块的温度。
两相邻区块的温度差异不能超过5度，即第一与第六区块最多可差异25度。
6.点击，将文件存储成Experiment Document Single files (*.eds) 格式，然
后在Run界面中按下 按钮，反应即开始进行。
7.实验结束后，点击界面右上角的Analyze按钮，软件将会显示实验结果：
7.1在扩增图中（见上图），可通过更改Plot Settings来改变扩增图的显示方式。
如果
想查看阈值线或基线，请将Threshold及Baseline打勾。
7.2查看相对表达量结果时，利用Plot Settings选项，以不同方式显示表达量的结果。
7.3对于SYBR Green法实验，可以在Melt Curve界面中查看熔解曲线。
7.4检查QC Summary结果，可以快速查看实验中是否有反应孔存在异常情况。
黄色三
角中的数字1代表有一种异常情况，2代表有两种异常情况，以此类推。
详细信息及解决方案可以在Flag Details中看到。
8.分析之后的结果，可以利用菜单中的File>Export功能，导出Excel格式的结果。
若想存
储图片，可直接在图片上单击鼠标右键，选择Save as，存成JPEG格式的图片。