流式细胞仪---教材

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流式细胞仪,大学课件

流式细胞仪,大学课件

细胞分选系统
样品分选原理

流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是:由喷 嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴,根据选定的某个参数由逻辑 电路判明是否将被分选,而后由充电电路对选定细胞液滴充电,带电 液滴携带细胞通过静电场而发生偏转,落入收集器中;其它液体被当 作废液抽吸掉,某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。 稳定的小液滴是由流动室上的压电晶体在几十KHz的电信号作用下发 生振动而迫使液流均匀断裂而形成的。 一般液滴间距约距约数百μm。实验经验公式f = v / 4.5 d给出形成稳定 水滴的振荡信号频率。其中v是液流速度,d为喷孔直径。 使分选的含细胞液滴在静电场中的偏转是由充电电路和偏转板共同完 成的。充电电压一般选 150V,或-150V;偏转板间的电位差为数千伏。 充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的,
可以引起发荧光的能量种类很多,由光激发所引起的荧光称为致荧光。
由化学应所引起的称为化学荧光,由X线或阴极射线引起的分别称为X线 荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。
寿命为10-8 ~ 10 -11s。由于是相同多重态之间的跃迁,几率较大,速度大,
速率常数kf 为106~109s-1。
Laser 荧光 SSC
FSC
在流式细胞术测量中,常用的是两种散射方向的散射光测量
FSC
forward scatter light (“fsc”) or forward angle light scatter (“fals”).
小角散射又称前向角散射光光它反应细胞的相对大小和截面积 的大小,一般说来,前向角散射光的强度与细胞的大小有关,对同 种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大;对球形活细胞经实验 表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系 ;

流式细胞仪ppt课件

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DNA倍体
2N 2N 2N~4N 4N 4N
.
43
Normal Cell Cycle
M G2
G0
G1
s
C o u n t
DNA Analysis
G0G1
s G2M
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
.
44
.
45
DNA Analysis
300
225
150
Counts
75
.
18
3-D Histograms
.
19
免疫荧光分析
细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的 荧光抗体结合,形成带有荧光的抗原抗体复合 物。通过流式细胞仪测定其荧光量,即可得到 细胞群的不同抗原位点表达情况。
.
20
.
21
免疫荧光分析的意义:
流式细胞术与单克隆抗体结合,可对细 胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体 进行定量检测,成为临床检验的一项重要指 标。流式免疫荧光技术不仅能将表达不同抗 原位点的细胞群区分开来,而且还能进一步 区分各细胞亚群。对于造血系统疾病、免疫 功能障碍及恶性肿瘤的诊断、治疗及预后评 估都起了重要作用。
.
3
FCM在生命科学中的应用,标志着细胞生物 学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平 的研究。为从微观认识细胞及横向比较特征提 供了精密、准确的方法和仪器.
.
4
流式细胞仪的发展史
1930 年 Caspersson 和Thorell 开始致力于细胞的计数 1934 年 Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人他试图用光 电仪记录流过一根毛细管的细胞

流式细胞仪培训手册(完成版)_图文

流式细胞仪培训手册(完成版)_图文

流式细胞仪培训手册序论学习仪器的最好方法是操作仪器,然而在理解原理的基础上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。

本书介绍了流式细胞仪的基本知识,并从不同角度详尽阐述了各种台式机(FACScanTM , FACSortTM , FACSCaliburTM ,和 BD LSR与大型机(FACS VantageTM, FACSVantageTM SE, 和 FACStarPLUSTM 之间的不同。

阅读本书有助于增强读者操作仪器的动手能力和经验。

目录第 1章综述…………………………………………………………………… 4 第 2章液流系统………………………………………………………………第 3章散射光信号及荧光信号………………………………………………3.1 散射光信号………………………………………………………3.2 荧光信号…………………………………………………………3.3 荧光补偿第 4章光电系统………………………………………………………………4.1 光平台……………………………………………………………4.2 光学滤片………………………………………………………4.3 信号探测器……………………………………………………4.4 阈值………………………………………………………………第 5章数据分析………………………………………………………………5.1 数据采集及显示…………………………………………………5.2 设门………………………………………………………………5.3 细胞亚群的数据分析…………………………………………5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析………………………………5.5 CellQuest软件使用……………………………………………5.6 MutiSet 软件使用………………………………………………5.7 Simultest 软件使用……………………………………………5.8 B27软件使用…………………………………………………5.9 WinMDI软件使用…………………………………………5.10 FACSPress软件使用…………………………………………5.11 System II软件使用…………………………………………5.12 MultiCycle软件使用…………………………………………5.13 Modfit使件使用……………………………………………第 6章流式基本检测项目6.1淋巴细胞亚群检测 (双色、三色、四色,三种软件分析6.2 B27的检测………………………………………………………6.3 血小板抗体检测………………………………………………6.4 网织血小板及红细胞分析……………………………………6.5 干细胞检测……………………………………………………6.6 DNA倍体分析……………………………………………………6.7 凋亡检测…………………………………………………………第 7章分选6.1 分选………………………………………………………………第 8章激光器及光路校正……………………………………………………7.1 激光器的工作原理………………………………………………7.2 光路校正…………………………………………………………第 9章答案………………………………………………………………第一章综述流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术,通常指细胞通过激光束时在液流中的特性,即粒子的大小,密度或是内部结构,以及相对的荧光强度。

流式细胞仪分析技术及应用(课件)

流式细胞仪分析技术及应用(课件)

流式细胞仪分析技术及应用第一节概述第二节数据的显示与分析第三节流式细胞仪技术要求一、工作原理一、参数一、免疫检测样品制备二、散射光的测定二、数据显示方式二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色三、荧光测量三、设门分析技术三、免疫胶乳颗粒的应用四、细胞分选原理四、流式细胞技术的质量控制第四节流式细胞仪技术的要求第五节、流式细胞仪的科研应用第六节流式细胞术在临床检测中的主要应用✧流式细胞术(flow cytometry, FCM)亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting, FACS):是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。

/是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。

/广泛应用于基础研究和临床实践各个方面,包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等。

✧流式细胞术发展史1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化,用光电仪记录流过一根毛细管的细胞1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理,成功设计红细胞光学自动计数器1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计1972年Herzenberg研制出细胞分选器1975年Kohler等提出单克隆抗体技术,为细胞研究提供大量的特异免疫试剂目前国内主要流式细胞仪厂家:Beckton Dickinson(BD)公司;BACKMAN COULTER公司✧流式细胞术的特点:最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下,通过荧光探针的协助,从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。

流式细胞仪 ppt课件

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9
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途
颜色
FITC
488
525
免疫荧光 绿色
PE(RD1) 488
575
免疫荧光 橙色
ECD
488
620
免疫荧光 橙红
PeCy5 488
675
免疫荧光 红
PI
488
620
DNA染色 橙红
PECy7 488
755
免疫荧光 深红
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7
流式细胞检测样本的制备: 细胞样本的处理: 组织样本的处理 流式细胞仪检测的信号: 散射光信号:前向角散射光(Forward scatter, FSC) 与细胞大小有关;侧向角散射(Side scatter ,SSC,又 称90°角散射光)与细胞精细结构和颗粒性质有关,对 胞膜、胞质、核膜变化更敏感。 荧光信号:特异性荧光信号是指将荧光素分子耦联到特 异性抗体或分子上,当其与细胞表面或者胞浆中的抗原 结合后,被特定波长激发光激发而产生的信号; 自发荧光:个别的细胞有着他们各自特异性水平的自发 荧光(荧光信号产生于他们自身)。
流式细胞仪 FLOWபைடு நூலகம்CYTOMETER
基本概念和原理
ppt课件
1
2003年推出世界上第一台单激光五色的流式细 胞仪FC500/MCL,2005年升级为FC500/MPL
Cytomics FC500
ppt课件
2
流式细胞术的基本概念
流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是一种可 以快速、准确、客观,能够同时检测快速直线流 动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性, 加以分析定量的技术,并且可以对特定群体加以 分选。其中用到的流式细胞仪(Flow Cytometer )是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术 、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆 抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。在国外 又把流式细胞仪称为荧光激活细胞分选器( Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS),所 以目前大多数流式细胞仪机型都以FACS命名。

流式细胞术PPT课件

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电荷式分选
lasers
–超声振动器(15-100kHz)
–液流充电系统
–高压偏转板
–收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电) 高压偏转板
29
四路分选原理
电荷式分选装置
30
分选指标
• 分选时间由三方面决定:进样速度、目标细胞所占比例、 需要收集的细胞数。
需要细胞数
目标细胞所占比例(%)
1
5
50
104
• Hoechst(343, 450)常见为Hoechst33342和Hoechst33258,非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色,用于活细胞 DNA定量分析,如精子分选;还用于侧群细胞的分选。
• PY(派若宁 560, 573) RNA染料,能进入活细胞。
• AO(吖啶橙 509, 525) DNA、RNA染料,染色后DNA呈黄绿色荧光, RNA呈橙黄色荧光,可进行DNA/RNA双参数分析。
• 多色标记荧光素搭配原则:每个通道只能选择一种荧光素; 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
FACSCalibur常用四色搭配:FITC、PE、PerCP、APC。
33
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同;
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料,更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原:
99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的,纯度提高,收获率
降低,反之亦然。
– 富集模式(enrich mode) – 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)

流式细胞仪分析技术及应用PPT课件

流式细胞仪分析技术及应用PPT课件
49
(四)石蜡包埋组织单细胞悬液制备 该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应
用范围,有利于进行临床回顾性研究和利 用。 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂 脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。 对石蜡切片的要求较严格。
50
(五)活检标本单细胞悬液制备 活检标本及各种内镜取材标本也克制备成
能对于处在快速直线流动状态 中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数、快速定量分析和分选
5
一、流式细胞仪分析的工作原理
荧光显微镜技术
激发光源改为激光
单克隆抗体与 荧光染料技术
计算机技术 处理光信号
提高检测灵敏度 和特异性
提高检测速度和 统计分析精确性
6
(一)流式细胞仪基本结构
液流系统
1
包括流动室(flow chamber)和液流驱动系统 作用:依次传送待测样本中的细胞到激光照射区 理想状态:细胞逐个传送到激光束的中心,而且
侧向散射光检测器
在激光束的垂直方 向,又称90°散射
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比,用于 检测细胞内部结构 属性
28
前向散射光示意图
细胞大小
29
结构复杂程度
侧向散射光示意图
30
当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过 激光束时,染料吸收光子跃迁到激发态,返 回基态时,染料释放出能量,大部分以光的 形式释放。
分选的方式有捕获式分选和电荷式分选,目前应 用最多的是电荷式分选。
21
电荷式分选1
当单细胞悬液形成液柱通过 流动室时,液柱被分割成一 连串均匀的液滴。
根据设定的被分选细胞的某 个参数由逻辑电路判断是否 被分选。
22
电荷式分选2
充电电路对选定细胞液滴充 电,使其带正电荷或负电荷, 未被设定分选参数的细胞液 滴则不带电荷。

流式细胞仪原理ppt课件

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300 nm 400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Excitation Emisson
流式细胞仪的组成
仪器硬件组成 计算机硬件系统 软件系统 应用
大型机——FACSVantage SE
多激光多波长 八荧光参数 高速分选 单细胞点对点分选
台式机——FACSCalibur
双激光 488nm 635nm
鞘液、洗液、PMA等:清洁无颗粒杂质
单细胞悬液的处理
荧光标记抗体的染色:使用特异的单克隆抗体
单色分析:直接标记、间接标记 双色分析:SimulSET IMK、HLA-B27 多色分析:TriTEST、MultiTEST、ProCOUNT
溶血:FACS Lysing Solution 细胞打孔:FACS Perm2 固定:1%多聚甲醛
荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放,转换为
振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子
荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多,产生的荧光信
号越强
荧光信号
FALS Sensor
Freq
Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)
Fluorescence
流式细胞仪的电子系统
进行信号检测和分析 当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时,
受到激发, 产生不同波长的、代表细胞内不同物 质的荧光信号 荧光信号由光电接收器接收,转变为电信号, 可分析电压脉冲的高度、面积和宽度 电脉冲信号经A/D转换成数字信号 数字信号传送到计算机,进行储存、 作图、 统计分析
荧光信号
激发光源与荧光标记物
流式细胞术样本来源
细胞悬液:
分离PBMC、PRP等:操作复杂,分离、离心步骤导 致细胞特定群体丢失,并可能引入某些误差

流式细胞术及其临床应用课件(1)

流式细胞术及其临床应用课件(1)
光源与光学系统
➢ 激发光源 ➢ 光学系统
信号收集与光电转 换系统
计算机与分析系统
细胞分选与浓缩系统
激发光源 滤光片
流动室、鞘 液和样本流
信号检测器
计算机分析
(二)激光光源与光学系统
(一)激发光源 :激光器
气体激光器:氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm);
(四)计算机和分析系统
十字门
线性门
流式细胞仪特点
流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微 粒的结构及功能不被破坏的状态下,通过荧光探针的 协助,从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分 析或纯化分选
细胞不被破坏,测量快速、大量、准确、灵敏、定量
目前国内主要流式细胞仪厂家 Beckton Dickinson(BD) BACKMAN COULTER
淋巴细胞亚群分析
试剂:BD Multitest IMK Kit 标本:外周血(常用) 配色:CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC
(三)荧光信号
目前常用FCM配置(BD Calibar) 488nm激光管常用染料有 第一通道(FL1):FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 第二通道(FL2):PE (Phycorey- thrin) 第三通道(FL3):PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) PE-Cy7、PE-Cy5、 PerCP-Cy5.5 633nm激光管常用染料有
1
10
2 700
3 720
4
15
……
Counts
0…………101…………102…………103

流式细胞仪培训手册(完成版)【范本模板】

流式细胞仪培训手册(完成版)【范本模板】

流式细胞仪培训手册序论学习仪器的最好方法是操作仪器,然而在理解原理的基础上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。

本书介绍了流式细胞仪的基本知识,并从不同角度详尽阐述了各种台式机(FACScanTM,FACSortTM,FACSCaliburTM,和BD LSR)与大型机(FACS VantageTM,FACSVantageTM SE,和FACStarPLUSTM)之间的不同。

阅读本书有助于增强读者操作仪器的动手能力和经验。

目录第1章综述 (4)第2章液流系统………………………………………………………………第3章散射光信号及荧光信号………………………………………………3.1 散射光信号………………………………………………………3.2 荧光信号…………………………………………………………3.3 荧光补偿第4章光电系统………………………………………………………………4。

1 光平台……………………………………………………………4.2 光学滤片………………………………………………………4.3 信号探测器……………………………………………………4。

4 阈值………………………………………………………………第5章数据分析………………………………………………………………5。

1 数据采集及显示…………………………………………………5.2 设门………………………………………………………………5.3 细胞亚群的数据分析…………………………………………5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析………………………………5.5 CellQuest软件使用……………………………………………5。

6 MutiSet软件使用………………………………………………5.7 Simultest软件使用……………………………………………5.8 B27软件使用…………………………………………………5.9 WinMDI软件使用…………………………………………5。

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流式细胞仪
1.流式细胞术概述 2.流式细胞仪概述 3.流式细胞仪系统结构 4.流式细胞仪软件介绍 5.流式细胞仪其它
目录
1.流式细胞术概述
1.流式细胞术概述
流式细胞术定义 流式细胞术发展史 流式细胞术特点
1.流式细胞术定义:
1.流式细胞术概述
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM或 FACS):是利用流式细胞仪 对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、 快速定量分析,同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。
2.流式细胞仪概述
2.流式细胞仪的发展史与商品化:
•1953年:Parker 和 Hutcheon 描述一种全血细胞计数器装置,成为流 式细胞仪的雏型; •1969年:Van Dilla Fulwyler 发明第一台荧光检测细胞计; •1970年:Phywe研制脉冲细胞光度计,备有荧光镜的FCM,DNA定 量;同年Kamensky发明白细胞分类流式细胞仪,激光光源,吖啶橙 染色,测定淋巴、单核、中性粒C; •1972年: Len Herzenberg等在斯坦福大学研制荧光激活细胞分选仪 (FACS),氩离子激光,标志着流式细胞仪商品化时代到来; •1973年: Becton Dikinson (BD)公司投入市场,第一台FACS-Ⅰ问世, 其 后 2 0 多 年 来 不 断 改 进 完 善 产 品 , 先 后 推 出 FA C S A n a l y z e r 、 FACScan、FACSCalibur、FACSLSR-Ⅱ、FACSVantage、FACSDiva、 FACSAria等; •1975年: Kochler 和 Milstein 提出单克隆抗体技术,为细胞研究中 大量的特异性免疫试剂的应用奠定基础;鉴于商业仪器的发展;
•1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白; •1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利; •1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞 •1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理,成功设计红细胞光学 自动计数器
2.流式细胞仪概述
2.流式细胞仪概述
流式细胞仪定义 流式细胞仪的发展史与商品化 流式细胞仪的生产厂家 流式细胞仪的分类 BD公司、Beckman公司的分析仪及分选仪外观
2.流式细胞仪概述
贝克曼库尔特Gallios流式细胞仪
1.流式细胞仪定义:
2.流式细胞仪概述
流式细胞仪(Flow Cytometor, FCM)是以流式细胞术为核心技术,对 高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器,主 要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术,计算机对数据的采 集和分析技术等。
2.流式细胞仪概述
Bec司的流式细胞分选仪:
3.流式细胞仪系统结构
3.流式细胞仪系统结构
流动室与液流系统 激光光源与光学系统 信号检测与分析系统 分选系统
3.流式细胞仪系统结构
•1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测 细胞计
•1972年Herzenberg研制出细胞分选器 •1975年Kohler等提出单克隆抗体技术,为细胞研究提供大量的特异 免疫试剂大量厂家不断生产流式细胞仪
3.流式细胞术特点:
1.流式细胞术概述
•分析对象:单细胞悬液或生物颗粒 •分析速度:快速,最高达上万个细胞/秒 •检测参数:多参数(两个散射光参数、多个荧光参数) •可同时测定多种可溶性细胞成分:流式微球芯片技术(Cytometric Beads Array,CBA) •检测结果:精度高、准确性好 •先进的细胞定量技术
流式细胞术是一项新型的、发展迅速的生物医学分析技术,它是集 激光技术、光电测量技术、计算机技术、流体力学以及细胞免疫荧 光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技细胞分析技术。
2.流式细胞术发展史:
1.流式细胞术概述
•1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究; •1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化,用光电仪记录流过一 根毛细管的细胞;
5.流式细胞仪分类:
2.流式细胞仪概述
临床型:光路调节系统固定,自动化程度高,操作简便,易掌握, 适用于临床常规测试;
科研型:分辨率高,选配多种波长和类型激光器,可将感兴趣细胞 分选到特定培养孔或板上,适用于科研。
2.流式细胞仪概述
BD公司的流式细胞分析仪
2.流式细胞仪概述
BD公司的流式细胞分选仪
BD、Beckman Coulter 产品型号种类齐全,占市场份额较大,如: 经济普及型流式细胞仪 :FACSCount、Cytomics FC500 ; 大型科研型流式细胞仪: BD FACSAria、EPICS ; 特点:产品价格昂贵,我国使用的单位基本上是科研机构。
Partec 产品结构紧凑,造价低,便于携带,适合边远地区和发展 中国家,在植物学的研究中占有较大份额。Partec 公司的 CyFlow 于2004 年 1 月进入太空站用于研究工作,成为世界上首台升上太空 的流式细胞仪,证明其结构紧凑,性能优越的特点。
2.流式细胞仪概述
•1983年:Shapiro 认为多参数分析流式细胞仪可以实现。此后,流式 细胞仪进入一个快速发展的时期; •1994年:美国Cytomation公司推出高性能、高速分选装置MoFlo,该 机以出色的性能和创新设计理念,一经推出即受到广泛关注; •2008年:美国BD公司推出Influx,在MoFlo基础上实现了原位、立 体分选。
2.流式细胞仪概述
4.流式细胞仪生产厂家:
目流式细胞仪生产厂家主要有 BD、Beckman Coulter、Partec、 Guava、Union Biometrica、ABI、Amnis 等等。
美国 BD、Beckman Coulter 和德国的 Partec 占领着流式细胞仪市 场的统治地位。
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