雷帕霉素对高糖诱导的肾系膜细胞自噬抑

SA-β-gal 染色阳性率下降（P<0.05），细胞核异染色质斑块形成减少；高糖培养的细胞用 3-MA 干预 72 h 和 10 d 后，LC3 表达下
降，p62/SQSTMI表达升高，MDA及蛋白质羰基含量升高（均P<0.05），72 h细胞SA-β-gal染色阳性率上升（P<0.05），细胞核斑块
形成增多。 结论 高糖可抑制系膜细胞自噬功能，促进系膜细胞氧化损伤，加速细胞衰老；雷帕霉素干预可减轻高糖对系膜细胞
自噬功能抑制，减少氧化损伤，延缓衰老；3-MA 加重高糖对系膜细胞自噬功能的抑制，进一步加重细胞氧化损伤，加速衰老。
关键词：系膜细胞；高糖；雷帕霉素；自噬；氧化损伤；衰老
中图分类号：R587.2; R691.6
1 材料和方法 1.1 材料
2 月龄雄性 Spraque-Dawley 大鼠（清洁动物）购自 北京维通利华实验动物技术有限公司；雷帕霉素和 3-甲 基腺嘌呤购自Lc Labortatories；RPMI 1640细胞培养基 和胎牛血清分别购于 Gibco 和 Hyclone Thermo；Pierce BCA assay kit购于Thermo；丙二醛（MDA）试剂盒购自 南京建成公司；兔多抗 LC3 抗体来自 Sigma，小鼠抗 p62/SQSTMI单抗来自美国Santa Cruz，鼠二抗、兔二抗 购自 Abcam；DAPI 购自北京碧云天公司。 1.2 原代肾小球系膜细胞分离培养及分组 1.2.1 大 鼠 系 膜 细 胞 的 分 离 培 养 将 2 月 龄 雄 性 Spraque-Dawley 大鼠在无菌条件下取双侧肾脏，剥离 肾包膜，用剪刀把肾皮质剪成碎块，放于重叠 3 层不锈 钢筛网上，边研磨边冲洗。镜下观察，若见 98%以上的 肾小球去包曼氏囊，视野中基本上无肾小管存在，即可 停止研磨冲洗。收集第2层筛网（75 μm）上的肾小球组 织移入离心管，800 r/min×5 min 离心，弃上清，沉淀加 入 V 型 胶 原 酶 ，37 ℃ 消 化 10~15 min，用 15% FBS RPMI 1640培养液终止消化后，800 r/min×5 min离心， 弃上清，收集肾小球至铺有明胶的培养瓶中，用含有 15%胎牛血清的RPMI 1640培养基在37 ℃、5% CO2条 件下培养［2］。7~10 d 后第 1 次传代，传代后 24 h 细胞贴 壁，形态为梭形或不规则星形，3~4 d 汇合成片，用细胞 免疫荧光染色鉴定，抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及抗 波 形 蛋 白（Vimentin）染 色 阳 性 ，抗 细 胞 角 蛋 白 （Cytokenratin）及抗Ⅷ因子染色为阴性。传至第 3 代用 于实验。 1.2.3 实验分组 细胞分 4 组。正常对照组：细胞在含 5 mmol/L 葡萄糖的 15% FBS RPMI 1640 培养液中培 养。高糖组：细胞在含 30 mmol/L 葡萄糖的 15% FBS RPMI 1640 培养液中培养。雷帕霉素+高糖组：细胞在 30 mmol/L 葡萄糖和 10 nmol/L 雷帕霉素的 15% FBS RPMI 1640 培养液中培养。3-MA+高糖组：细胞在含 30 mmol/L 葡 萄 糖 和 1 mmol/L 3-MA 的 15% FBS
Abstract: Objective To investigate the effects of rapamycin and 3-methyladenine on autophagy impairment, oxidative stress and premature senescence induced by high-glucose in primarily cultured rat mesangial cells. Methods Rat glomerular mesangial cells (GMCs) were isolated and cultured in normal glucose, high glucose, high glucose with 3-methyladenine (3-MA), or high glucose with rapamycin. At 24 h, 72 h and 10 days of culture, the cells were examined for expression levels of autophagy markers LC3 and p62/SQSTM1, malondialdehyde (MDA) and protein carbonyl, β-galactosidase (SA-β-gal) activity and heterochromatin foci (SAHF). Results Compared with those of normal cell culture, the cells exposed to high glucose for 72 h and 10 days showed down-regulated LC3 expression, up-regulated p62/SQSTM1 expression, elevated MDA and protein carbonyl levels, and increased SAHF formation and percentage of SA-β-gal-positive cells. These changes were reversed in GMCs exposed to high glucose and rapamycin for 72 h and 10 days, but exacerbated in cells incubated with 3-MA. Conclusion High glucose can suppress autophagic function of rat GMCs to result in oxidative damage and cell senescence. Rapamycin can attenuate autophagy impairment, oxidative damage and senescence induced by high glucose, whereas 3-MA can further aggravate high glucose-induced cell injuries in rat GMCs. Key words: mesangial cells; high glucose; rapamycin; autophagy; oxidative damage; senescence
RPMI 1640培养液中培养。分别于培养24 h、72 h、10 d 后取样检测各指标。 1.3 Western blotting 检 测 自 噬 标 志 物 LC3 和 p62/ SQSTMI 蛋白的表达
取 2×106个细胞加 0.1 ml 预冷的 RIPA 裂解液（50 mmol/L Tris-Cl［pH 7.6］，150 mmol/L NaCl，1% NP-40， 0.1% SDS，0.5%脱氧胆酸，1 µg/ml leupeptin，1 µg/ml aprotinin，0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟）进行匀浆，冰浴 30 min，在 4 ℃、12 000 r/min 离心 30 min，吸取上清蛋 白，用 Micro BCA Protein Kit 测蛋白浓度。取 30~50 µg 总蛋白，加2×SDS上样缓冲液（2 ml，0.5 mol/L Tris pH 6.8，2 ml甘油，2 ml 20% SDS，0.5 ml 0.1%溴酚蓝，1 ml 1 mol/L DTT，2.5 ml ddH2O），100 ℃ 变 性 5 min。 SDS-PAGE 分离后转印至硝酸纤维素膜，用 1×封闭液 室温封闭 1 h，一抗用 LC3 抗体（1∶2000 稀释）和 p62 抗 体（1∶200 稀释）4 ℃过夜；TBST 洗 3 次，每次 5 min，二 抗（1∶2000稀释）室温孵育1 h；TBST洗3次，每次5 min， 用化学发光（ECL，普利莱公司）显色。以β-actin 为内参 照，采用Image J图像分析软件进行半定量分析。 1.4 系膜细胞衰老标志物-SA-β-Gal染色
文献标志码：A 文章编号：1673-4254（2012）04-0467-05
doi: 10.3969/j.issn.1673-4254.2012.04.006 /kcms/detail/44.1627.R.20120407.1635.002.html
Effect of rapamycin on high glucose-induced autophagy impairment, oxidative stress and premature senescence in rat mesangial cells in vitro
2012;32(4)
南方医科大学学报（J South Med Univ）
·467·
基础研究
雷帕霉素对高糖诱导的肾系膜细胞自噬抑制、氧化损伤和衰老 的影响
李 锦，白雪源，崔少远，傅 博，陈香美 中国人民解放军总医院肾病科/肾脏疾病国家重点实验室，北京 100853
摘要：目的 探讨雷帕霉素及 3-甲基腺嘌呤（3-MA）对高糖诱导的原代大鼠系膜细胞自噬、氧化损伤及衰老的影响。 方法 从大
· Med Univ）
第 32 卷
及衰老的发生有关。近年来随着生活水平提高和生活 方式的变化，热量摄入呈明显增加的趋势，代谢综合征 在中国的发生率逐年递增。代谢综合征是导致糖尿病 及心脑血管疾病的危险因素，也可引起代谢性疾病肾损 伤。研究表明，高热量饮食可以加重组织器官的氧化损 伤与衰老。但目前对于自噬在代谢性疾病肾损伤发生 中的作用还不清楚。本研究首次观察了高糖对大鼠系 膜细胞自噬活性、氧化损伤和衰老的影响，并探讨了自 噬增强剂雷帕霉素及自噬抑制剂 3-MA 对高糖诱导的 系膜细胞自噬抑制、氧化损伤及衰老的影响。
白质损伤产物-羰基含量，通过进行衰老相关β-半乳糖苷酶活性（SA-β-gal）染色及衰老相关异染色质斑块（SAHF）分析检测细胞
的衰老程度。 结果 与对照组相比，细胞经高糖处理 72 h 和 10 d 后，自噬标志物 LC3 表达降低，p62/SQSTMI 升高，MDA 及羰基
含量上升（均P<0.05）；处理72 h细胞SA-β-gal染色阳性率增加（P<0.05），细胞核异染色质斑块形成增加。高糖培养的细胞用雷 帕霉素干预 72 h 和 10 d 后，LC3 表达升高，p62/SQSTMI 表达下降，MDA 及蛋白质羰基含量均下降（均 P<0.05），72 h 后细胞
收稿日期：2012-02-11 基金项目：国家重点基础研究计划（973计划）（2011CBA01003）；国家重大 科学研究计划项目（2011CB964904）；国家自然科学基金（30870920, 30270505, 30070288） Supported by National Key Basic Research Program（2011CBA01003）, National Key Science and Technology Program（2011CB964904）and National Natural Science Foundation of China (30870920, 30270505, 30070288). 作者简介：李 锦，硕士，E-mail: lijin1001@ 通讯作者：白雪源，教授，博士生导师，E-mail: xueyuan_bai@yahoo.
LI Jin, BAI Xueyuan, CUI Shaoyuan, FU Bo, CHEN Xiangmei Department of Nephrology, State Key Laboratory of Kidney Diseases, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China
自噬，即自我吞噬作用，是存在于从酵母至人类等 高等真核生物细胞中的高度保守的、维持细胞内环境自 身稳定的一种重要细胞内降解机制［1］。在生理情况下， 细胞的自噬功能保持在一个较低的基础水平，机体可通 过自噬作用清除细胞内少量受损的细胞器（如线粒体 等）和生物大分子（如蛋白质等），维持细胞正常的生理 功能。因此，当自噬功能受损伤或缺陷时，机体可能出 现损伤及衰老，研究已发现自噬可能与多种人类疾病以
鼠肾分离培养原代肾小球系膜细胞（GMCs），分为正常对照组、高糖组、高糖+雷帕霉素（自噬增强剂）及高糖+3-甲基腺嘌呤（自
噬抑制剂）干预组。在细胞培养 24 h、72 h 及 10 d 时，Western blotting 观测自噬标志物-自噬相关基因 LC3 及泛素结合蛋白 p62/
SQSTMI 的表达变化；硫代巴比妥酸法检测细胞脂质损伤产物-丙二醛（MDA）水平，2,4-二硝基苯肼（DNPH）比色法测定细胞蛋