肿瘤个体化治疗基因检测流程

肿瘤个体化治疗基因检测流程1、目的：保证所有肿瘤组织准确检测，符合技术要求。

2、范围：所有技术人员及质检人员均适用。

3、职责：3.1技术主管负责本规程的执行和监督。

3.2所有技术人员必须严格按照本规程的要求进行操作。

4、主要内容：4.1病理常规操作4.1.1病理样本的接收4.1.1.1首先核对病理申请单与标本上的红色号码是否一致。

4.1.1.2核查病理申请单上写明的送检标本及数目是否与实际送检标本一致。

4.1.1.3观察送检标本的大小及固定液比例是否合适。

(1)穿刺活检及纤支镜所取的小标本，4％中性甲醛(10％中性福尔马林)固定组织的量应在6～10倍。

(2)对于较大的手术切除标本，应及时切开固定；核对后将病理申请单和标本编上病理标本号。

4.1.1.4将病人姓名、性别、年龄、病历号、科别、临床诊断、部位、标本来源、标本例数等逐项录入电脑存储。

4.1.1.5作为病理资料不仅要做好计算机录入工作，还须进行文字登记，以便病理档案长期保存。

4.1.2组织固定临床医师切取标本后，应尽快将标本置于盛有足够量固定液的容器内，尽量避免可能出现固定不及时或不充分导致标本干涸或腐败，无法进行切片制作。

添加的量应6～10倍于标本体积.4.1.3取材及其后期处理4.1.3.1病理科病理医生取材4.1.3.2核对标本及其标志与申请单是否一致。

4.1.3.3按照病理取材规范选取病变及正常组织。

4.1.3.4对送检标本进行大体描述。

4.1.3.5取材后的标本保存至少两周。

4.1.3.6放入自动脱水机进行水洗－脱水－透明－浸蜡前处理。

4.1.4包埋4.1.4.1先将熔化的石蜡倾入模具，再用加热的镊子夹取已经浸蜡的组织块，注意：特定的制定面或最下面向下埋入熔蜡。

4.1.4.2注意标本的编号和标本要对准，防止污染。

4.1.4.3为下一步切片准备，提供介质。

4.1.5切片4.1.5.1刀片锋利，组织块预冷。

4.1.5.2切5-10um的连续组织切片，置于玻片上。

4.1.5.3捞片，烘干。

4.1.6HE染色苏木素－伊红染色。

苏木素染细胞核（核酸），伊红染细胞质（蛋白），使组织细胞对比清晰，便于显微镜下观察。

主要流程：二甲苯脱蜡－梯度酒精脱二甲苯－苏木素染色－分化、返蓝－伊红－梯度酒精、二甲苯－封片。

4.2标本前处理4.2.1申请单填写4.2.1.1登记患者基本情况，包括姓名、性别、年龄、送检单位、床位、门诊号/住院号、送检日期、取材部位、病理诊断、标本病理号等4.2.1.2患者签署知情同意书，留下联系方式4.2.1.3患者病史及临床情况有无手术（穿刺标本）、手术时间、术前术后有无化疗、化疗方案及化疗效果及毒副作用（相关血项指标、胃肠反应、皮肤反应、神经反应等）、治疗的单位、癌症有无转移、复发或者不能切除、相关病史及家族史4.2.2送检标本种类外周全血；胸腹水；痰；尿新鲜(冰冻)标本；内镜活检标本；手术标本蜡块或切片外周血4.2.3送检标本要求新鲜标本用10%中性福尔马林固定或用RNAlater浸泡20分钟以上（常温可保存10天）外借病理蜡块，常规病理大小即可常规石蜡切片（10张白片），5-10um，常温送检4.2.4样本评估血：保存温度、时间，是否凝固胸腹水、尿及痰：涂片HE染色观察结果是否有癌细胞蜡块或白片：组织保存时间、福尔马林固定时间、组织大小、有无癌细胞4.2.5申请单登记入册登记基因检测申请号、姓名、送检单位、病理号、检测项目4.3基因检测前处理4.3.1石蜡白片前处理4.3.1.1烤片（90-95℃，0.5小时）4.3.1.2脱蜡（过夜，最后一缸换新二甲苯）4.3.1.3HE染色4.3.1.4镜下区分选择肿瘤组织4.3.1.5刮片4.3.1.6消化肿瘤组织（200μlTL+20μlOB酶，55℃2-3h消化时间视具体情况定）4.3.2DNA的提取4.3.2.1血液DNA提取4.2.2.1.1250μl抗凝血加入250μl Buffer BL和25μl OB酶，70℃孵育15分钟。

4.3.2.1.2加入260μl无水乙醇震荡混合约20秒。

4.3.2.2.3取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟。

4.3.2.2.4将收集柱置一新收集管上，加入500μl HB solution，12000rpm离心2分钟。

4.3.2.2.5加入700μl wash Buffer，12000rpm离心2分钟。

空甩离心，12000rpm2分钟。

4.3.2.2.6将收集柱置一新1.5ml离心管上，加入50μl70℃预热的洗脱液，静置5分钟，12000rpm离心4分钟洗脱，即为DNA模板。

4.3.2.2.7琼脂糖电泳检测提取DNA质量（或用分光光度计定量并记录）。

4.3.2.2石蜡DNA提取4.3.2.2.1在消化充分的组织中加入220μl BUffer BL，震荡混合，于70℃孵育。

4.3.2.2.2加入220μl无水乙醇震荡混合约20秒。

4.3.2.2.3取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟。

4.3.2.2.4将收集柱置一新收集管上，加入500μl HB solution，12000rpm离心2分钟。

4.3.2.2.5加入700μl wash Buffer，12000rpm离心2分钟。

4.3.2.2.6空甩离心，12000rpm2分钟。

4.3.2.2.7将收集柱置一新1.5ml离心管上，加入50μl70℃预热的洗脱液，静置5分钟，12000rpm离心4分钟洗脱，即为DNA模板。

4.3.2.2.8琼脂糖电泳检测提取DNA质量（或用分光光度计定量并记录）。

4.3.3RNA的提取4.3.3.1石蜡组织RNA的提取RNAlater样本处理另注4.3.3.1.1加入250μlbufferPKD和10μl的蛋白酶K,涡旋混匀后，55°C孵育2-3h，80°C15min。

4.3.3.1.2然后加入500μl的bufferRBC，充分混匀。

4.3.3.1.3将溶液转入gDNA Eliminator spin柱内，10000g离心30s，吸取收集管内液体至新的离心管，重复操作直至溶液都过滤收集柱。

4.3.3.1.4在溶液内加入1200μl无水乙醇，混匀，将溶液转入RNeasy MinElute spin柱内，10000g离心15s，弃收集管内液体。

4.3.3.1.5加入500μl buffer RPE，10000g离心15min，弃收集管内液体。

4.3.3.1.6加入500μl buffer RPE,10000g离心2min。

小心将柱取出，放入一新的收集管内，最大速度离心5min（将柱盖打开）4.3.3.1.7将柱放入1.5ml收集管内，加入40-60μl无Rnase酶水，盖上盖子，室温放置2min，最大速度离心1min洗脱RNA.4.3.3.2血RNA的提取4.3.3.2.1300μl全血+1500μl1×buffer ERL（150μl10×ERL+1350μl H2O）混匀。

同时做3管。

4.3.3.2.2冰上孵育10min，至半透明。

4.3.3.2.3450g4℃，10min，弃上清。

4.3.3.2.4600μl1×buffer ERL混匀，洗涤细胞。

洗涤后合并3管液体。

4.3.3.2.5450g4℃，10min，弃上清。

4.3.3.2.6600μl TRK裂解液+12μlβ-巯基乙醇吹打混匀（可以暂时-70℃冻存）。

加等体积70%乙醇，吹打混匀。

4.3.3.2.7将液体转入HiBind RNA提取柱内（<800μl/次），10000g 离心1min，弃收集管内液体，重复操作直至所有液体都过柱。

4.3.3.2.8加700μl RNA wash BufferⅠ，10000g离心1min弃收集管内液体。

4.3.3.2.9换新的收集管，加500μl RNA wash BufferⅡ，10000g 离心1min弃收集管内液体。

4.3.3.2.10柱内加500μl RNA wash BufferⅡ，10000g离心1min 弃收集管内液体。

4.3.3.2.1112000g空柱离心2min。

4.3.3.2.12取一新的1.5ml离心管，在柱中央加入40μl洗脱液，12000g离心1min。

4.3.3.2.13核酸蛋白仪检测提取RNA纯度及浓度。

-70℃保存RNA。

4.4基因操作4.4.1PCR扩增（以K-ras为例）4.4.1.1反应体系为：4.4.1.2PCR反应条件：置PCR扩增仪中95℃预变性15min用TouchdownPCR，94℃变性50秒，63℃-58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共循环10次，94℃变性50秒，57℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共循环30次，最后于72℃延伸10分钟。

4.4.1.3电泳图用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增产物是否为单一目的条带。

4.4.1.4PCR产物纯化4.4.1.4.1加100μlPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，室温静置10min，12000rpm离心2min。

4.4.1.4.2弃收集管内液体，加700μlwashing buffer，12000rpm 离心2min。

4.4.1.4.3弃收集管内液体，加400μlwashing buffer，12000rpm 离心2min。

4.4.1.4.4弃收集管内液体，12000rpm离心2min。

4.4.1.4.5柱内加30μl70°C预热洗脱液，12000rpm离心2min。

4.4.1.5测序反应（以K-ras为例）4.4.1.5.1反应体系为：4.4.1.5.2测序产物纯化a.每管加1μlEDTA（125mM）;1μlNaAc（3M）到管里。

b.每管加100μl100%酒精，震荡混匀，室温静置15min。

c.10°C;4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min。

d.每管加100μl70%酒精，5°C;4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min。

e.37°C;30min挥发净酒精，加10μl Hi-Di溶解DNA。

f.95°C；变性5min，4°C；4min，加样上机。

4.4.1.6片段分析操作a多重荧光PCR：15μlPCRmix＋五种（胃肠）或七种（尿）引物0.8μl（其中D17S283加1.2μl）＋1μlDNA.条件：95°C15min，94°C1min，56°C1min，72°C1min，30个cycle.b２μlPCR产物＋0.4μlLIZ size standard+8μl HiDi,95°C5min,4°C冰冷5min。