分光光度法测定蛋白酶酶活知识讲解

分光光度法测定蛋白

酶酶活

分光光度法测定蛋白酶酶活

1适用范围

本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。

2测定原理

蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。

酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。

3仪器和设备

3.1分析天平：精度为0.0001g。

3.2紫外分光光度计。

3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。

3.4PH计：精度为0.01PH单位。

4试剂和溶液

除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。

4.1福林（Folin）试剂

市售分析纯福林试剂。

4.2福林使用溶液

一份福林试剂与两份水混合，摇匀。

4.3碳酸钠溶液（42.4g/L）

称取无水碳酸钠（Na

2CO

3

）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。

4.4三氯乙酸c（CCl

3

COOH）=0.4mol/L

称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L

称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。

4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L

1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。

0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。

4.7缓冲溶液

4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶）

称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）

0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶）

甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液：称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液：取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。

4.810g/L酪素溶液

称取酪素（固定厂家生产，不同厂家产品对实验结果有影响）1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的缓冲溶液（测中性蛋白酶加磷酸缓冲液，测酸性蛋白酶加乳酸缓冲液）约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。

4.9L－酪氨酸标准溶液（100μg/mL）

称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用

1mol/L盐酸60 mL溶解后再用蒸馏水定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。

吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。

5分析步骤

5.1标准曲线的绘制

5.1.1L—酪氨酸标准溶液：按表1配置。L—酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测

定。

分别取上述溶液各3.00ml，各加碳酸钠溶液（4.3）15.00ml、福林试剂使用溶液（4.2）3.00ml，振荡均匀，置于40℃±0.2℃水浴中显色20min，取出冷却至常温，用分光光度计于波长680nm测定其吸光度（A），以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）。

根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值;（其K值应在（95～100）范围内）。如不符合，需重新配制试剂，进行试验。

5.2样品测定

5.2.1待测酶液的制备

液体酶样：准确吸取样品10.0ml于100ml容量瓶中，用适宜溶剂（蒸馏水或者缓冲溶液）定容至刻度。控制稀释样品酶活力在100u/ml—1000 u/ml范围内。

固体酶样：准确称取样品4.0g，精确至0.0002g。用适量适宜溶剂（蒸馏水或者缓冲溶液）溶解后，定容至100ml。再将定容溶液用定性滤纸过滤后，准确吸取10.0ml，用相应溶剂定容至100ml。控制稀释样品酶活力在100u/ml—1000 u/ml范围内。

5.2.2测定

a、先将酪素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min；

b、按下列程序操作：

试管A（空白）试管B（酶试样，需作三个平行试样）

加酶液4.00 mL 加酶液4.00 mL

↓↓

40±0.2℃保温，2min 40±0.2℃保温，2min ↓↓

加三氯乙酸8.00 mL（摇匀）加酪素4.00mL(已预热)（摇匀）

↓ ↓

沸水煮沸，10min （精确计时） 40±0.2℃保温，30min （精确计时）

↓ ↓

加酪素4.00mL(已预热)（摇匀） 加三氯乙酸8.00mL （摇匀） ↓ ↓

40±0.2℃保温，30min ，过滤（定性滤纸） 沸水煮沸，10min ，过滤（定性滤纸）

↓ ↓ 取3.00ml 滤液 取3.00ml 滤液 ↓ ↓

加碳酸钠溶液15.0ml 加碳酸钠溶液15.0ml ↓ ↓

加福林试剂使用溶液3.00ml 加福林试剂使用溶液3.00ml ↓ ↓

40±0.2℃，显色20min 40±0.2℃，显色20min ↓ ↓

冷却至常温 冷却于680nm 波长，测定样品酪氨酸浓度 6 结果计算 6.1

液体样品酶活力的计算

从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/ml 。样品的酶活力按式（1）计算：

4

331621⨯⨯⨯⨯⨯=n

C X （1）

式中：

X —样品的酶活力，(u/mL )

；

C —由标准曲线得出的检测试液的酶活力，(u/mL)； 21—检测试液的体积，ml ； 16—反应试液的总体积，mL ； n —所测样品的稀释倍数；