牛蒡子苷对胰腺癌细胞抑制作用及其作用机理的实验研究

【摘要】目的通过牛蒡子苷对胰腺癌细胞株(capan-1)体内外实验，验证其是否具有抗胰腺癌作用。方法在capan-1细胞培养液中加牛蒡子苷，培养72 h并观察癌细胞的增殖抑制率及癌细胞形态变化。流式细胞仪（fcm）检测capan-1细胞周期及凋亡率；tunel法检测capan-1细胞凋亡率；免疫细胞化学检测capan-1细胞的增殖凋亡调控相关蛋白(bax、bcl-2)表达。用capan-1细胞制作balb/c裸小鼠荷瘤模型，连续每天腹腔注射牛蒡子苷（10 mg·kg-1·d-1）10d，以5-fu（30 mg·kg-1·d-1）作阳性对照观察抑瘤率。结果牛蒡子苷抑制capan-1细胞生长；阻滞capan-1细胞周期于g0/g1期并诱导细胞凋亡；通过上调bax蛋白表达（p＜0.01），下调bcl-2蛋白表达（p＜0.05）诱导capan-1细胞凋亡；抑制荷瘤裸小鼠肿瘤生长，抑瘤率为41.7%。结论牛蒡子苷具有抗胰腺癌活性，其作用机理之一是诱导细胞凋亡。

【关键词】牛蒡子苷；抗肿瘤活性；细胞凋亡； capan-1细胞株

牛蒡子是具有疏散风热、宣肺透疹、解毒利咽的中药，且常用于抗癌方剂中。牛蒡子主要含牛蒡子苷（arctiin）、牛蒡子苷元（arctigenin）、牛蒡子酚a、b（lappaol a,b）、脂肪油等［1］。近来研究表明，牛蒡子苷及牛蒡子苷元在动物体内实验中具有抗癌活性［2～4］。牛蒡子苷对capan-1细胞是否具有抑制作用尚无报道，为进一步研究牛蒡子苷的抗肿瘤活性，利用capan-1细胞进行体内外实验，探讨牛蒡子苷是否具有抗胰腺癌活性及其作用机理。

1 材料

牛蒡子苷购于中国药品生物制品检定所；capan-1细胞株由上海细胞研究所提供；fcs-1640细胞培养液，胎牛血清，抗生素，胰蛋白酶等（gib co）；sp免疫组化试剂盒，小鼠抗人bcl-2及bax单克隆抗体（santa cruz co）。

2 方法

2.1 牛蒡子苷对capan-1细胞生长的影响取fcs-1640细胞培养液中对数生长期的capan-1细胞3ml(细胞浓度约为6.5×103个·ml-1)，接种于直径35mm的培养皿中。随机分为用药组和对照组。用药组分别加入用0.02%二甲亚砜溶解的牛蒡子苷0.5，1，1.5mg·ml-1；对照组加入0.02%二甲亚砜。每一浓度3个重复培养皿，培养72h，每24h用细胞计数仪检测癌细胞数，设对照组癌细胞增殖率为100%，用下面公式计算各用药组癌细胞增殖率。

增殖率（%）=［（用药组各时段癌细胞数－用药组开始癌细胞数）/（对照组各时段癌细胞数－对照组开始癌细胞数）］×100%。

2.2 癌细胞形态学观察倒置显微镜下动态观察培养皿中capan-1细胞用药前后的变化。

2.3 fcm细胞周期检测收集对照组和加牛蒡子苷1 μg·ml-1的用药组培养24，48，72h 的capan-1细胞；pbs洗涤后，4℃下用75%酒精固定12 h以上；离心除去酒精，pbs洗涤，加入10mg·ml-1 rna酶溶液150 μl，37℃水浴30 min，加入碘化丙啶（pi），300目尼龙网过滤后4℃下放置15 min，用fcm测定细胞周期各时相细胞的百分比及细胞凋亡率。

2.4 dna末端原位标记染色法（tunel）检测细胞凋亡在培养皿中放置盖玻片，capan-1细胞在盖玻片粘壁生长后，用药组加入1 μg·ml-1牛蒡子苷，收集对照组和用药组培养24，48，72h附细capan-1胞的盖玻片，按tunel试剂盒标记染色，结果判断：以细胞核内出现棕褐色为阳性。光镜下计算凋亡指数（apoptotic index,ai）。ai是指每张tunel玻片选取5个阳性细胞数最多的高倍镜视野，计算阳性细胞数与总细胞数的百分比。

2.5 免疫细胞化学检测增殖凋亡调控相关基因bax及bcl-2的蛋白表达分别收集对照组和加牛蒡子苷1 μg·ml-1的用药组培养48 h的capan-1细胞，用s-p法进行染色。小鼠bax 单克隆抗体按1∶200稀释，bcl-2单克隆抗体按1∶50稀释，阴性对照以pbs代替抗体。结果判断：细胞染色呈棕黄色为阳性，随机计数100个细胞，测定每一指标的标记指数（labeling index，li），重复3次，取均值。li=阳性细胞数/计数细胞总数×100%。