种子扩大培养 2011
第三章 种子扩大培养
2、对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可
以用液体培养法。
1、孢子的制备
A、细菌孢子的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富 的配方。
培养温度一般为37˚C。
细菌菌体培养时间一般为1-2天，产芽孢的细菌
培养则需要5-10天。
1、孢子的制备
B、霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸 皮、麦粒等天然农产品为培养基。
培养的次数，取决于：菌种生长特性、孢子发芽及 菌体繁殖速度；所采用发酵罐的容积。
1、种子罐级数的确定
细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。 茄子瓶→种子罐→发酵罐 霉菌： 生长较慢，如青霉菌，三级发酵
孢子悬浮液→一级种子罐（27˚C,40小时孢子发
芽，产生菌丝 ）→二级种子罐（ 27˚C,10-24小 时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐
培养的温度一般为25-28˚C。
培养时间一般为4-14天。
1、孢子的制备 C、放线菌孢子的制备
放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基， 培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮 、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。 培养温度一般为28˚C。
培养时间为5-14天。
2、液体种子制备
A、好氧培养：
对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产
锥形瓶（23℃）→卡式罐（40L，20℃）→汉生罐
（13～15℃）→一级繁殖罐（12～13℃）→二级繁
殖罐（12～11℃） →发酵罐（10℃）
B、培养条件
湿度: 制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质 量有较大的影响。
pH：
主要是H＋对微生物生命活动的影响。
B、培养条件
通气量与搅拌：
简述种子扩大培养的一般步骤
简述种子扩大培养的一般步骤
种子扩大培养是一种常用的微生物培养方法，用于从初始培养物中扩大微生物数量，以便进行后续实验或工业应用。
一般而言，种子扩大培养的步骤包括以下几个方面：
1. 培养基准备，选择适当的培养基，根据目标微生物的需求添加合适的营养物质和pH调节剂。
培养基的配制需要严格按照配方和操作规程进行，以确保培养基的质量和一致性。
2. 种子接种，从初始培养物中选择合适的菌株或菌落，通过无菌技术将种子接种到含有适当培养基的培养容器中。
接种时需要注意保持无菌操作，避免外界的污染。
3. 培养条件调控，根据目标微生物的生长特性和要求，调节培养条件，包括温度、pH值、氧气供应和搅拌速度等。
这些条件的调节可以促进微生物的生长和代谢活性，从而实现种子的扩大。
4. 培养过程监测，在培养过程中，需要定期监测微生物的生长情况，可以通过测量生物量、菌落形态观察、代谢产物测定等方法进行。
监测结果可以帮助调整培养条件，以达到最佳的生长效果。
5. 收获和处理，当微生物达到预定的生长状态时，可以进行收获。
收获方法根据具体情况而定，可以选择简单的离心沉淀、滤液
或离子交换等方法。
收获后的种子可以进行后续的实验或工业应用。
6. 清洁和消毒，在种子扩大培养结束后，要进行培养容器和设
备的清洁和消毒工作，以防止微生物的交叉污染和感染。
总结起来，种子扩大培养的一般步骤包括培养基准备、种子接种、培养条件调控、培养过程监测、收获和处理，以及清洁和消毒。
这些步骤的严格执行可以确保种子扩大培养的成功，并提供足够的
微生物种子用于后续实验或工业应用。
第二章 种子扩大培养
一、种子扩大培养流程图
摇瓶液体培养
冷冻干燥孢子
茄子瓶斜面培养
斜面孢子 砂土孢子 固体培养基培养 一级种子罐 二级种子罐 发酵罐
实验室种子制备阶段 （一级种子培养）
生产车间种子制备阶段 （二级种子培养、 三级种子培养） 二级发酵 三级发酵
（一）实验室种子的制备
两种方式：在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程
3 液体深层培养（发酵）法：(liquid submerged
culturing)
液体深层发酵法从罐底部通气，进入的空气由搅拌桨叶 分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐的底部通气搅 拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的
二级种子扩培
实验室种子
一级种子罐
二级种子罐
三级种子扩培
发酵罐
e.g. Streptomycin fermentation 实验室种子 一级种子罐
二级பைடு நூலகம்子罐
三级种子罐
发酵罐
(Streptomyces griseus)－－灰色链霉菌
三、种子培养
工业微生物培养的类型
静置培养法：即将培养基盛于发酵容器中，在接种后， 不通空气进行培养发酵，也称为嫌气性培养
用哪一代的斜面孢子接入液体培养，视菌种特性而定。 母斜面孢子接入液体培养基有利于防止菌种变异， 子斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。 菌种进入种子罐有两种方法： 孢子进罐法，即将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种子 罐．此方法可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工 艺过程简单、便于控制孢子质量等优点，孢子进罐法已成 为发酵生产的一个方向。 摇瓶菌丝进罐法，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，此 方法的优点是可以缩短种子在种子罐内的培养时间
种子扩大培养 认识种子扩大培养
4.1 种子扩大培养的目的及要求
种子扩大培养的目的及要求
概述 种子扩大培养：又称种子制备工序，是指将保存在沙土管、冷冻干燥管
中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种 子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。 这些纯种培养物称为种子。
种子扩大培养的目的及要求
种子扩大培养的目的及要求
种子必须满足以下条件：
条件一
菌种细胞的生长活 力强，移种至发酵罐后能 迅速生长，缩短迟缓期
条件二
生理状态稳定，以便 获得稳定的菌体生长过程
五个
条件五
无杂菌污染，以保证 整个发酵过程正常进行 Nhomakorabea条件
稳定的生产能力
条件四
保持稳定的生产能力，使最终产
物的生物合成量持续稳定高产
条件三
菌体总量及浓度
种子扩大培养的意义 ① 为发酵生产提供充足的代谢旺盛、生命力强的种子 ② 有效地缩短发酵生产周期
种子扩大培养的目的及要求
目前工业规模的发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。如按百分之十左 右的种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子。因此，种子扩大培 养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的 种子。这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。
适宜，可以保证在大发 酵罐中有适当的接种量
发酵工程种子的扩大培养
孢子培养
母瓶：活化、纯化,使保藏菌种生长,并去处变异株. 所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落.
子瓶: 大量繁殖,得到大量孢子. 接种：①从母斜面上点接种,选取生长好的单 菌落 ②接种时密一点,得到大量的孢子.
孢子培养时注意湿度,子斜面使用一般不超过1个月
三、生产车间阶段 1、培养物的选择原则 在生产车间阶段,最终一般都是获得一定数量的菌丝体. 菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果
原则：对数生长期末,细胞活力强,菌体浓度相对较大, 但是最终由实验结果定.
6、种子的质量要求：
量：要求达到一定的浓度
质: 形态 生长处于某个阶段、均匀等等 理化指标：C、N、P的含量,pH 酶活等
无污染
本章小节：
了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念 理解种子扩培的目的和要求 掌握控制种子质量的基本方法和手段
培养基的特点：长菌体,更接近于发酵培养基
种子的质量要求：
108-109个/ml 大小均匀,呈单个或八字排列 PH 7.0-7.2时结束,6.8→8→7.0-7.2 活力旺盛
二、青霉素生产的种子制备 制备过程
安培管 → 斜面孢子 → 大米孢子
→ 一级种子 → 二级种子
→ 发酵
一、斜面孢子 培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培养条件：25℃、7天, 注意湿度50%左右
目的：种子扩培到一定的量和质,根据菌种的特点最终的 培养物可分为两类：
对于不产孢子和芽胞的微生物 ——获得一定数量和质量的菌体
对于不产芽孢和孢子的微生物,实验室阶段的种子扩培 最终是获得一定数量和质量的菌体,如谷氨酸的种子培 养.
对于产孢子的微生物 ➢ 获得一定数量和质量的孢子
简述种子扩大培养的一般步骤
简述种子扩大培养的一般步骤种子扩大培养是一种常用的细胞培养技术，用于从少量的起始细胞种子扩大培养大量的细胞。
一般情况下，种子扩大培养的步骤包括以下几个方面：1. 选择合适的培养基，根据所培养细胞的特性和需求，选择适合的培养基。
常见的培养基有DMEM、RPMI-1640等，可以根据需要添加适当的补充物如血清、生长因子等。
2. 准备种子细胞，从原始培养物中取出一定数量的细胞作为起始种子。
细胞可以通过离心、洗涤等方法获得。
3. 细胞计数和调整，使用细胞计数仪对种子细胞进行计数，以确定种子细胞的浓度。
根据需要，可以通过离心和重新悬浮的方式调整种子细胞的浓度。
4. 接种种子细胞，将调整后的种子细胞悬浮液加入到培养皿或培养瓶中。
种子细胞的密度应根据所需的扩大倍数和培养容器的大小进行合理调整。
5. 细胞培养条件的控制，将接种的培养皿或培养瓶放入细胞培养箱中，控制培养箱的温度、湿度和二氧化碳浓度等环境参数，以提供适宜的生长条件。
6. 细胞生长监测，定期观察和记录细胞的生长情况，包括细胞形态的变化、细胞数量的增加等。
可以使用显微镜观察细胞形态，也可以通过细胞计数仪等设备对细胞数量进行监测。
7. 细胞传代，当种子细胞达到一定的生长程度时，可以进行细胞传代，即将细胞分离并重新接种到新的培养皿或培养瓶中。
传代的目的是避免细胞过度密集和资源耗竭，以保证细胞的健康生长。
8. 细胞收获，根据需要，可以在细胞达到预期生长程度后，将细胞收获下来进行后续的实验或应用。
收获细胞时，可以使用适当的方法如离心、洗涤等将细胞从培养皿或培养瓶中分离出来。
以上是种子扩大培养的一般步骤。
具体的操作细节可能会因细胞类型、培养条件和实验目的的不同而有所差异。
在进行种子扩大培养时，需要严格控制培养条件，遵循无菌操作规范，以确保细胞的健康生长和培养的成功。
种子扩大培养.ppt
C 种子质量的判断
由于菌种在种子罐中的培养时间较短，可供分析 的参数较少，使种子的内在质量难以控制，为了保证 各级种子移种前的质量，除了保证规定的培养条件外， 在过程中还要定期取样测定一些参数以观察基质的代 谢变化及菌丝形态是否正常。在生产中通常测定的参 数为
1）pH；
2）培养基灭菌后磷、糖、氨基氮的含量；
8.l.2 生产车间种子制备
实验室制备的孢子或摇瓶菌丝体种子移种至 种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌 种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如 葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，同时还需供给足 够的无菌空气，并不断搅拌，使菌丝体在培养 液中均匀分布，获得相同的培养条件。孢子悬 浮液一般采用微孔接种法接种，摇瓶菌丝体种 子可在火焰保护下接入种子罐或采用压差法接 入。种子罐之间或发酵罐间的移种方式，主要 采用差压法，由种子接种管道进行移种，移种 过程中要防止接受罐表压降至零，否则会引起 染菌。
B 培养条件
（l）温度 温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影 响。温度高，菌丝过早自溶，效价降低等现象。一般 各生产单位都严格控制孢子斜面的培养温度。
（2）湿度 制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量 和质量有较大的影响。
（3）通气量 在种子罐中培养的种子除保证供给易被 利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。
B 接种龄与接种量
（l）接种 接种龄是指种子罐中培养 的菌丝体开始移入下一级种子罐或发 酵罐时的培养时间。选择适当的接种 龄显得十分重要。通常，接种龄以菌 丝处于生命力极为旺盛的对数生长期， 且培养液中菌体量还未达到最高峰时， 较为合适。
过于年轻的种子接入发酵罐后， 往往会出现前期生长缓慢、整个发酵 周期延长、产物开始形成的时间推迟， 甚至会因菌丝量过少而在发酵罐内结 球，造成异常发酵的惜况。过老的种 子会引起生产能力下降而菌丝过早自 溶。
简述种子扩大培养的一般流程
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种子的扩大培养
种子异常分析
1、菌种生长速度过慢 2、菌丝结团 3、菌丝粘壁
第三节
种子制备过程的技术概要
种子制备的过程大致可分为：
实验室种子制备阶段
生产车间种子制备阶段
一、实验室种子的制备
实验室种子的制备一般采用两种方式
对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁
殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子， 孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作 简便，不易污染杂菌。 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种， 可以用液体培养法。
搅拌转速340r／min； 250L种子罐1:0.3
搅拌转速300r／ min
500L种子罐1:0.25 搅拌转速230r／ min
(3)二级种子的质量要求 种龄 7~8h pH 7.2左右 OD值 净增0.5左右 无菌检查 (-) 噬菌体检查(-)
二、啤酒酵母的扩大培养
一般可采用三级扩大培养，扩大倍数：第1级 到第2级为8-10倍，第2级到第3级为4-6倍。 1，实验室扩大培养
(2) 培养条件 用1000mL三角瓶装入培养基 200mI，灭菌后置于冲程7．6cm、频率96次 ／min的往复式摇床上振荡培养12h，培养温 度33~34℃ (3) 一级种子质量要求 种龄：12h pH值：6.4± 0.1 光密度：净增OD值0.5以上 残糖：0.5％以下 无菌检查：(-) 噬菌体检查： (-) 镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐 革兰氏阳性反应。
水质的影响：地区不同、季节变化 和水源污染，均可造成水质波动， 影响种子质量。 菌种在固体培养基上可呈现多种不 同代谢类型的菌落，氮源品种越多， 出现的菌落类型也越多，不利于生 产的稳定。
措施
培养基所用原料要经过发酵试验合格才可
种子的扩大培养
☆（2）接种量的确定 ◆与该菌在发酵罐中生长繁殖的速度、种子质量和发酵条件 等有关。 a.接种量过多，菌丝生长过快、过稠，培养液粘度增加， 营养基质缺乏或溶解氧不足，影响产物的合成。 b.接种量过小，引起发酵前期菌体生长缓慢，使发酵周期 延长，菌丝量少，还可能产生菌丝团，导致发酵异常。
生产上多以大接种量和丰富培养基作为高产措施
（2）注射接种 用于种子罐接种，在罐顶接种管口压 盖一层橡胶膜，将注射器针嘴插入橡胶膜进行接种。
（3）摇瓶直接进罐法 适合种子罐接种，一般需三人 配合操作。
二、注意事项
（1）按照无菌操作
（2）消毒灭菌一定要彻底、干净
（3）在接种操作中，一定要严格按照无菌操作进行，规范生 产操作，严禁误操作带来的杂菌污染，经常提醒，建立严格 的无菌概念，避免出现二次污染。
如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更 多的菌丝——二级种子；将二级种子转入发酵罐内发酵，称为 三级发酵。
使用三级种子的发酵，称为四级发酵。
◆接种 将孢子或菌落，或试管、三角瓶或种子罐中 菌体接入培养容器的操作过程。
◆接种量 移种的种子液体积和培养液体积之比。
◆接种龄 种子罐中培养的菌体开始移种到下一级种 子罐或发酵罐的培养时间。
1．实验室种子制备 （1）斜面种子培养 活化菌种，同时也培养一定数量的斜面 种子。 （2）液体培养 包括液体试管和三角瓶摇床震荡或回旋式培 养。
①液体试管培养 无菌条件下，用接种针自斜面试管挑取 一环斜面种子菌体，接入装有液体培养液的试管，摇匀后，置 培养箱培养，待培养成熟后，再接入三角瓶培养。
②三角瓶液体培养（摇瓶种子）
（4）生产中使用的斜面菌种不宜多次移接，一般只移接三次 (三代)，以免由于菌种的自然变异引起菌种不纯。因此，要 经常进行菌种的分离纯化，不断提供新的斜面菌株供生产使 用。
6.种子的扩大培养
生产车间种子制备阶段：
种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理， 因此形象地称这些培养过程为生产车间种子制备阶段。
二、实验室阶段 1、培养物选择的原则 目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终 的培养物可分为两类： 对于不产孢子和芽胞的微生物 ——获得一定数量和室阶段的种子 扩大培养最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸 的种子培养。
生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材 料质量波动。 原材料质量的波动，起主要作用的是其中无机离子含量不同，如 微量元素Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或 太少也会影响孢子的质量。 以培养菌体为目的，种子罐与发酵罐培养基成分一致较好。 主要是碳源、氮源、无机盐、生长素和水等。 选用原则：组分简单，来源丰富，价格便宜，取材方便等。
不同接种量影响菌体的生长和发酵
发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高, 发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率.
20%种子罐＋10%发酵罐前期发酵液效果最好
本章小节：
了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念
理解种子扩培的目的和要求
掌握控制种子质量的基本方法和手段
在原料方面： 不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发 酵培养 基，这有两个方面的原因: 一是成本 二是驯化
例：柠檬酸发酵
以蔗糖为原料
成分 麦芽汁 蔗糖 NH4NO3 K2HPO4 MgSO4.H2O KCl 琼脂
斜面 麦汁
种子罐
发酵
2.5-5% 0.225% 0.03% 0.025%
20% 0.11% 0.025% 0.015%
8.生产发酵罐的无菌接种
生产规模发酵罐的接种，包括两个方面： –从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一个种子罐. –从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。
种子的扩大培养
液体深层种子罐从底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成 微小气泡以促进氧的溶解。该法容易按照生产菌种对于代谢 的营养要求一级不同生理时期的通气、搅拌、温度与培养基 中氢离子等条件，选择最佳培养条件。
四、种子质量的控制
（二）影响种子质量的因素及控制
培养基
（1）营养成•分种适龄合：种是子指培种养子的罐需中要培养的菌丝体开始移入
种子培养要求一定量的种子，在适宜的培养基中，控制一定的培养条 件和培养方法，从而保证种子正常生长。
工业微生物培养法分为静置培养和通气培养两大类型。
❖静置培养即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培养。 ❖通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给 空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称好气培养法。
（1）放线菌孢子的制备
a) 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含 有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白 胨和一些无机盐等。
b) 碳源和氮源不要太丰富（碳源约为1％，氮源不超过0.5 ％），干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。
c) 放线菌斜面的培养温度大多数为28℃，少数为37℃，培 养时间为5～14天。
菌种细胞的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生 长，延滞期短。
菌种生理状态稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率和 种子培养液的特性等符合要求。
菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求。 无杂菌污染，保证纯种发酵。 菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。
二、种子制备的过程
从工业发酵的角度来说，种子制备分成两个 阶段：
摇瓶培养基配方和培养条件与种子罐相似。
常采用母瓶、子瓶两级培养。种子培养基要求比 较丰富和完全，易被菌体分解利用，氮源丰富有 利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓， 子瓶培养基浓度比母瓶略高，更接近于种子罐的 培养基配方。
2011 发酵工程习题学生(有答案)
发酵工程复习题一、填空1、我国白酒的分类方法多样，其中以香型分类为常用，一般认为白酒可分为四种，即浓香型酒，以泸洲老窖（酒）为代表；酱香型，以茅台（酒）为代表；清香型，以五粮液（酒）为代表；米香型香型，以桂林三花酒（酒）为代表。
2、我国传统酿造常用到曲，种曲作用是提供大量的孢子，而曲通常用来提供大量的菌体或酶。
4、一般酒精度低于16 度的饮料酒均须后杀菌，一般采用巴氏消毒法。
6、发酵生产按生产操作工艺分类，可分为连续、分批、流加三种。
7、通用发酵罐通常由空气系统、温度系统、蒸汽系统等几个重要系统组成。
8、在工业发酵中，10吨以下小型发酵罐一般以夹套式装臵控温，10吨以上的大中型发酵罐一般以盘管式装臵控温。
9、在工业发酵过程中，与代谢变化有关的物理参数主要有：罐压、温度、溶氧、搅拌、发酵液表观粘度等，生物参数主要有：菌体形态、菌体比生长速率等。
10、发酵生产中试车间常用的接种方法主要有压差和火圈接种两种。
11、一般来说，发酵工业的生产过程主要包括以下环节：原料预处理；培养基配制；发酵设备和培养基灭菌；无菌空气的制奋；微生物菌种制备和扩大培养；发酵；发酵产品的分离和纯化。
12、发酵工业根据操作方式不同可分为三种模式，即间歇发酵、连续发酵和流加发酵。
常见的间歇发酵，也称分批发酵。
13、1956年，日本木下祝郎发明了代谢控制发酵技术，使谷氨酸发酵生产实现产业化。
14、发酵工业的发展经历了天然发酵阶段、纯培养技术的建立、通气搅拌发酵技术的建立、代谢控制发酵和现代发酵工程技术的发展四个时期。
15、1929年，英国科学家弗莱明发现了青霉菌，1940年英国弗洛里和钱恩分离出青霉素，1941年英美两国合作对青霉素开发研究，1942年实现了青霉素工业化生产。
16、发酵工程技术服务的领域包括食品工业、医药工业、化学工业、能源开发以及环境治理等。
17、发酵工业以微生物的生命活动为基础，决定发酵工业生产水平的三个要素：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件和生产设备，其中优良的菌种是最重要的。
第二章 种子扩大培养
2 固体培养（发酵）法(solid culturing)： 固体培养又分为浅盘(shallow pan)固体培养和深 层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特 有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。
（二）生产车间种子制备
实验室制备的孢子或液体种子移种 至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽 因不同菌种而异，但其原则为采用易被 菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸 盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足 够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝） 体在培养液中均匀分布，获得相同的培 养条件。
1.摇瓶种子制备
一、种子扩大培养流程图
摇瓶液体培养
冷冻干燥孢子
茄子瓶斜面培养
斜面孢子 砂土孢子 固体培养基培养 一级种子罐 二级种子罐 发酵罐
实验室种子制备阶段 （一级种子培养）
生产车间种子制备阶段 （二级种子培养、 三级种子培养） 二级发酵 三级发酵
（一）实验室种子的制备
两种方式：在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程
用哪一代的斜面孢子接入液体培养，视菌种特性而定。 母斜面孢子接入液体培养基有利于防止菌种变异， 子斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。 菌种进入种子罐有两种方法： 孢子进罐法，即将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种子 罐．此方法可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工 艺过程简单、便于控制孢子质量等优点，孢子进罐法已成 为发酵生产的一个方向。 摇瓶菌丝进罐法，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，此 方法的优点是可以缩短种子在种子罐内的培养时间
第二章-种子的扩大培养
(2)培养条件 • 接种量：0.8~1.0％ • 培养温度：32~34℃ • 培养时间：7~8h • 通风量： • 50L种子罐1:0.5 • 搅拌转速340r／min； • 250L种子罐1:0.3 • 搅拌转速300r／ min • 500L种子罐1:0.25 • 搅拌转速230r／ min
(3)二级种子的质量要求 • 种龄：7~8h • pH：7.2左右 • OD值净增0.5左右 • 无菌检查(-) • 噬菌体检查(-)
种子罐培养：
获得足够的菌种数量； 种子罐的培养基接近发酵罐培养的醪液成分和 培养条件，使菌体适应发酵环境。
种子罐级数的确定
种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大培养的次 数
种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并 减少由于多次转种而带来的染菌机会以及减少因 种子罐生长异常而造成的发酵波动 但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的种子 以满足发酵的需求
（5）pH
●
pH影响菌体的生长和代谢
（6）通气搅拌
影响培养基中的溶氧，通气过大或搅拌速度过快容易导致某些酶失 活或菌体细胞破裂。
●
3、接种量和种龄的影响
移入种子的体积 接种量＝ ————————— 接种后培养液的体积
接种量大小最终以实践定。
接种量过多：菌丝生长过快、溶 氧不足，衰老细胞增加等，发酵 后劲不足 种量过少：延长发酵周期，形成 异常形态，而且易造成染菌。 以生产菌种在发酵罐中的繁殖速 度为依据 接种量的大小直接影响发酵周期。
碳源和氮源不太丰富（ 碳源约1%，氮源不超过
0.5%）。碳源丰富易造成生理酸性的营养环境，不 利于放线菌孢子形成；氮源丰富有利于菌丝繁殖不 利于孢子形成。
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4种子质 量控制
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第一节 种子扩大培养的目的与要求
种子扩大培养的概念: 种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休
眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及 种子罐逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种过程。这些 纯种培养物称为种子。
种子扩大培养的目的: □ 接种量的需要
□ 缩短发酵时间、提高发酵效率
需要数量多、代谢旺盛、活力强的种子接入发酵罐中。
□ 菌种的驯化
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优良种子应具备的条件：
菌体浓度及总量能满足大规模发酵罐接种量的要求； 生理状态稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率等； 生长活力强，移种至发酵罐后，能够迅速生长；
无杂菌污染，保证纯种发酵；
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对于不产孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是 获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。
三角瓶摇床培养
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对于产孢子的微生物
➢ 获得一定数量和质量的孢子：
对于产孢子能力 强及孢子发芽、生长迅速的菌种可 采用固体培养基培养孢子，所获孢子可直接作为种子罐 的种子。
◆ 培养温度：大多数为28˚C，少数37˚C 。
◆ 培养时间：5～14天。
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e.g 产黄青霉菌
原始菌种 斜面试管 获得孢子
250ml 茄子瓶（大米或小米） 25 ~28 ℃ ，4~14天
成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以
下，于4 ℃冰箱保存）。
菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。
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第二节 种子制备技术概要
一、种子制备的过程
1－砂土孢子 2—冷冻干燥孢子 3－斜面孢子 4—摇瓶液体培养 5—茄子瓶斜面培养 6—202固0年5体月16培日星养期六基培养 7、长江8大—学生种科院子生物罐工程培系 养 9—发酵罐
（27 °C ~28 °C ，3天） （25°C， 2天）
5~10 L卡氏罐
（15 °C ~20 °C ，3~5天）
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2、培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子 培养基应该是有利于孢子的生长。
在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较 小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都 比较精细。
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2、培养基选择的原则
目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应 首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所 以营养要比发酵培养基丰富。
在原料方面： 不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养
基，这有两个方面的原因: 一是成本、二是驯化。
接种量的确定及对发酵的影响；影响种子质量的因素 及其控制措施。
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内容速览
种子的 扩大培养
4.1目的 与要求
4.2种子制 4.3种子制备 备技术概要 过程举例
1制备 过程
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2实验室 阶段
3生产车 间阶段
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◆ 培养时间：需要5～10天。
② 霉菌孢子的制备
◇ 一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产 品为培养基。
◇ 培养的温度：一般为25～28˚C。 ◇ 培养时间：4～14天。
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③ 放线菌孢子的制备
◆ 一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适 合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白 胨和一些无机盐等，C、N不要太丰富（碳源约为 1%，氮源不超过0.5%） 。
➢ 获得一定数量和质量的菌丝体：
对于产孢子能力不 强及孢子发芽慢的菌种，可以采用 摇瓶液体培养法，经恒温振荡培养获得菌丝体。
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孢子的制备
① 细菌孢子的制备
◆ 斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。 ◆ 培养温度：一般为37˚C，少数28˚C 。
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二、实验室阶段
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验 室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成， 因此形象地将这些培养过程称为实验室阶段。
1、培养物选择的原则
目的：种子扩培到一定的量和质。
根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：
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发酵工程 课件
Fermentation Engi欢ne迎ering
光临 第四章 种子的扩大培养
主讲人：夏帆
第四章 种子的扩大培养（2学时）
教学目的：了解种子扩大培养的目的和制备过程；
掌握优良种子应具备的条件；掌握种子制备技术；了 解谷氨酸和青霉素生产的种子制备。
教学重点、难点：发酵级数的确定及对发酵的影响；
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长江大学生lutamic acid-producer：（谷氨酸生产菌） 原始菌种（出发菌种） 固体试管斜面（32 °C ，18~24小时）
三角瓶培养（摇床）(flask culture)
种子罐培养
e.g. yeast：
原始菌种（出发菌种） 10ml 麦汁试管 250ml 三角瓶培养
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对于不产孢子的赤霉素生产菌 （Gibberelline fujikuroi），也可用大米 固体培养基在茄子瓶中培养菌丝体，用作种 子罐种子。
不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆 菌（Corynebacterium）、短杆菌 （Brevibacterium），生产上一般采用斜 面营养细胞进行扩培，再转入液体摇瓶培养， 获得细胞悬液再接种。
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三、生产车间阶段
生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，在工厂一般归 为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间 阶段。
1、培养物的选择原则
在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。
菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果