(完整版)第六章_固定化酶、固定化细胞案例
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酶工程 第六章酶与细胞固定化 第二节酶和菌体固定化
第二节 酶和菌体固定化
半透膜包埋法制成的固定化酶小球，直径—般只有几 ㎛至几百㎛，称为微胶囊。制备时，—般是将酶液分散在 与水互不相溶的有机溶剂中，再在酶液滴表面形成半透膜， 将酶包埋在微胶囊之中。例如：将欲固定化的酶及亲水性 单体(如已二胺等)溶于水制成水溶液，另外将疏水性单体 (如癸二酰氯等)溶于与水不相混溶的有机溶剂中，然后将 这两种互不相溶的液体混和在一起，加入乳化剂（如司盘 -85等）进行乳化，使酶液分散成小液滴，此时亲水性的 已二胺与疏水住的癸二酰氯就在两相的界面上聚合成半透 膜，将酶包理在小球之内。再加进吐温-20(Tween-20)， 使乳化破坏，用离心分离即可得到用半透膜包埋的微胶囊 型的固定化酶。
第二节 酶和菌体固定化
用离子键结合法进行酶固定化，条件温和，操作简便。 只需在一定的pH值、温度和离子强度等条件下，将酶液 与载体混合搅拌几个小时，或者将酶液缓慢地流过处理好 的离于交换柱，就可使酶结合在离于交换剂上，制备得到 固定化酶。例如：将处理成-OH型的DEAE-葡聚糖凝胶加 至含有氨基酰化酶的0.1mo1/L的pH7.0磷酸缓冲液中，于 37℃条件下，搅拌5h，氨基酰化酶就可与DEAE-葡聚糖 凝胶通过离子键结合，制成固定化氨基酰化酶。或者将处 理过的DEAE-葡聚糖凝胶装进离子交换柱，用氢氧化钠处 理，使之成为-OH型，用无离子水冲洗，再用pH 7.0的 0.1mo1/L磷酸缓冲液平衡备用。另将一定量的氨基酰化酶 溶于pH7.0的0.1mol／L磷酸缓冲液中配成一定浓度的酶液， 在37℃的条件下，让酶液慢慢流过离子交换柱，就可制备 成固定化氨基酰化酶。用于拆分乙酰—DL—氨基酸，生 产L—氨基酸
酶工程
第六章 酶与细胞固定化
第二节 酶和菌体固定化
将酶与水不溶性的载体结合，制备固定化酶的过程称 为酶的固定化。
酶和细胞的固定化
交联法
交联法是利用双功能或多功能交联试剂，在酶 分子和交联试剂之间形成共价键的酶的固定化 方法。采用不同的交联条件和在交联体系中添 加不同的材料，可以产生物理性质各异的固定 化酶。
交联法与共价结合法一样也是利用共价键固定 酶，所不同的是它不使用载体。交联法制备较 难，酶活损失较大，一般作为其他固定化方法 的辅助手段。常用的双功能试剂有戊二醛、己 二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等，其中应用 最广泛的是戊二醛。
共价结合法是酶以共价键结合于载体上的固定 化方法，即将酶分子上非活性部位功能团与载 体表面反应基团进行共价结合的方法。一般先 用化学方法将载体活化，再与酶分子表面的某 些基团如羧基、氨基、羟基等反应，形成共价 键。
共价结合法的优缺点
共价结合法所得的固定化酶与载体结合比较牢 固，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前 研究最为活跃的一类酶固定化方法。但该法较 其他固定方法反应剧烈，固定化酶活性损失更 加严重。
缺点：但酶和载体之间结合力弱，pH、温度、 离子强度等条件的变化都易使酶从载体脱落， 并且污染催化反应产物。
离子结合法
离子结合法是酶通过离子键结合于具有离子交 换基的水不性载体上的固定化方法。此法的载 体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换 树脂，如DEAE-纤维素 、AmberliteCG-50 、 XE-97和Dowex-50等。
物理吸附法：是利用酶和载体间的非特异性物 理吸附作用将酶固定在载体表面，这些物理吸 附作用包括范德华力、氢键、疏水作用、静电 作用等。
物理吸附法的优缺点
优点：条件温和，工艺简便，载体选择范围很 大，吸附时既可实现酶的固定化又可以达到纯 化的目的，吸附后酶的构象变化较小或基本不 变，因此对酶的催化活性影响小。
如光偶联法是以光敏性单体聚合物包埋固定化 酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶，由于 条件温和，可获得酶活力较高的固定化酶。
酵母细胞的固定化
酵母细胞的固定化一、固定化酶与固定化细胞及应用实例1、固定化酶（1）含义：将酶固定在不溶于水的载体上。
（2）实例：利用固定化酶技术生产“高果糖浆”。
（3）优点：酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。
（4）缺点：一种酶只能催化一种化学反应，而在实际生产中，很多产物的形成是通过一系列的酶促反应才能得到。
（5）应用实例：生产高果糖浆①原料：葡萄糖②原理：葡萄糖果糖③生产过程及示意图：a.反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本。
b.提高了果糖的产量和品质。
2、固定化细胞（1）含义：将细胞固定在一定空间内的技术。
（2）优点：成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收（3）缺点：固定后的细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降，由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制。
二、固定化酶或固定化细胞技术的常用方法1、固定化酶或固定化细胞：指利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
2、方法：①物理吸附法 ：将酶（或细胞）吸附在载体表面上②包埋法：将酶（或细胞）包埋在细微网格里③化学结合法：将酶（或细胞）相互结合，或将其结合到载体上。
葡萄糖异构酶三、固定化酵母细胞的制备与发酵（一）制备固定化酵母细胞1、酵母细胞的活化：1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。
〖思考〗活化是指什么？在缺水状态下，微生物处于休眠状态。
活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。
2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液：0.83gCaCl2＋150mL蒸馏水→200mL烧杯→溶解备用3、配制海藻酸钠溶液0.7g海藻酸钠＋10mL水→50mL烧杯→酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化→蒸馏水定容到10mL。
注：加热时要用小火，或者间断加热，并搅拌，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中注：1、海藻酸钠溶液必须冷却至室温，搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。
固定化酶与固定化细胞
固定化多酶反应
生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的, 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的,结构 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径. 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径.
固定化细胞
直接把微生物细胞固定化
包埋法是制备固定化细胞最常用的方法. 包埋法是制备固定化细胞最常用的方法.将 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶, 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶,琼脂糖 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶, 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶,二和三醋酸纤 胶原,明胶和戊二醛等包埋起来, 维,胶原,明胶和戊二醛等包埋起来,发挥酶 或酶系的作用. 或酶系的作用. 例如: 3m1细胞悬浮液加人到 例如:海藻酸包埋 3m1细胞悬浮液加人到 2% 溶液中,置冰箱10h 10h, 20ml 2%CaCl2溶液中,置冰箱10h,用 100ml生理盐水洗二次 生理盐水洗二次. 100ml生理盐水洗二次. 注意:如果反复使用固定化细胞,需要避免 注意:如果反复使用固定化细胞, 其他微生物的污染, 其他微生物的污染,在工业生产中细胞的固 定化是在严格无菌条件下进行. 定化是在严格无菌条件下进行.
酶分子被结合到水不溶性 载体上共价结合形成水不 溶性的固定化酶
交联法
使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互 交联呈网状结构的固定化方法. 交联呈网状结构的固定化方法. 最常用的双功能试剂有戊二醛, 最常用的双功能试剂有戊二醛,顺丁稀二酸 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基, 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基,酚 咪唑基及巯基均可参与交联反应. 基,咪唑基及巯基均可参与交联反应. 双功能试剂: 双功能试剂: 常用的是戊二醛 常用的是戊二醛 O O
生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的, 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的,结构 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径. 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径.
固定化细胞
直接把微生物细胞固定化
包埋法是制备固定化细胞最常用的方法. 包埋法是制备固定化细胞最常用的方法.将 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶, 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶,琼脂糖 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶, 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶,二和三醋酸纤 胶原,明胶和戊二醛等包埋起来, 维,胶原,明胶和戊二醛等包埋起来,发挥酶 或酶系的作用. 或酶系的作用. 例如: 3m1细胞悬浮液加人到 例如:海藻酸包埋 3m1细胞悬浮液加人到 2% 溶液中,置冰箱10h 10h, 20ml 2%CaCl2溶液中,置冰箱10h,用 100ml生理盐水洗二次 生理盐水洗二次. 100ml生理盐水洗二次. 注意:如果反复使用固定化细胞,需要避免 注意:如果反复使用固定化细胞, 其他微生物的污染, 其他微生物的污染,在工业生产中细胞的固 定化是在严格无菌条件下进行. 定化是在严格无菌条件下进行.
酶分子被结合到水不溶性 载体上共价结合形成水不 溶性的固定化酶
交联法
使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互 交联呈网状结构的固定化方法. 交联呈网状结构的固定化方法. 最常用的双功能试剂有戊二醛, 最常用的双功能试剂有戊二醛,顺丁稀二酸 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基, 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基,酚 咪唑基及巯基均可参与交联反应. 基,咪唑基及巯基均可参与交联反应. 双功能试剂: 双功能试剂: 常用的是戊二醛 常用的是戊二醛 O O
固定化细胞制备及应用事例
固定化细胞制备及应用事例固定化细胞是将活细胞固定在材料上，以实现其在生物反应或工业生产中的应用。
利用固定化细胞可以提高细胞的稳定性和生物活性，延长其寿命，并简化细胞分离和生产过程。
下面将介绍固定化细胞制备及应用的一些事例。
一、酶固定化1. 葡萄糖异构酶固定化：葡萄糖异构酶（GI）是一种重要的酶，用于将葡萄糖转化为果糖。
将GI固定在聚丙烯酸酯(PVA)凝胶中，可以实现连续和稳定的果糖生产。
此外，还可以将GI固定在金属氧化物纳米粒子上，以提高反应速率和酶稳定性。
2. 乳酸脱氢酶固定化：乳酸脱氢酶（LDH）是一种用于乳酸生产的重要酶。
将LDH固定在Ca2+交换树脂上，可以实现连续乳酸生产。
固定化LDH不仅具有较高的稳定性和重复使用性，还可以避免产物污染。
二、生物传感器1. 葡萄酒品质传感器：利用固定化酵母细胞制备的生物传感器，可以检测葡萄酒中的氨基酸和糖分等物质，以评估葡萄酒的品质。
固定化酵母细胞可以提高传感器的灵敏度和稳定性。
2. 环境污染物传感器：将大肠杆菌等细菌固定在传感器的电极表面上，可以实现对环境中污染物的实时监测。
固定化细菌可以与特定的污染物发生反应，并产生电流信号，从而实现环境污染物的快速检测。
三、药物传递系统1. 肿瘤靶向治疗：将抗癌药物固定在载体上，并加上靶向配体，可以实现对肿瘤细胞的选择性靶向治疗。
固定化药物可以提高药物的稳定性和生物利用率，减少药物对正常组织的毒性。
2. 糖尿病治疗：将胰岛素固定化在高分子材料上，并用于制备胰岛素缓释系统，可以实现糖尿病的长期治疗。
固定化胰岛素可以延长药物的作用时间，减少频繁注射的需要。
四、废水处理1. 有机废水处理：将具有降解有机物能力的细菌固定在废水处理装置中，可以高效降解废水中的有机物。
固定化细菌可以在较宽的温度和pH范围内工作，减少对环境的影响。
2. 污水氨氮去除：将氨氧化细菌固定在生物反应器中，可以实现对污水中氨氮的高效去除。
固定化细菌可以提高氨氮去除速率和稳定性，减少传统处理方法所需的空间和时间。
固定化酶与固定化细胞(第六章)
固定化催化剂的特殊应用（ 固定化催化剂的特殊应用（三） 特殊应用 药物控释载体9
药物释放要求： 定点（靶向性）； 定量（太高太低均有害）； 避免被（胃酸、蛋白酶）破坏； 避免引起免疫反应。 措施：聚合物修饰；凝胶包埋；制成微球 制剂或脂质体、具有导向性的药物等。
固定化催化剂的特殊应用（ 固定化催化剂的特殊应用（四） 特殊应用 －－生物传感器
第六章 固定化酶与固定化细胞
固定化酶定义的形成以及扩展
固定化酶是20世纪50年代发展起来的一项新技术， 最初称“ 水不溶性酶 ”（water insoluble enzyme） 和 “ 固相酶 ” （solid phase enzyme),是将水溶性的酶 与不溶性的载体结合起来。 后来，人们发现可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装 置中，高分子底物与酶在超滤膜的一边，反应产物可以 透过膜逸出。这种情况下，酶本身仍处于溶解状态，只 不过是被固定在一个有效的空间内。再用上面的名字已 不合适。 1971年第一次国际酶工程会议上统一称为“ 固定化 酶”。（immobilized enzyme ）是指在一定空间内成闭索 状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后酶可以回收 利用。 “ 固定化的生物催化剂” 包含酶、含酶细胞及微生物 的固定化。1
固定化酶半衰期（T 固定化酶半衰期（T1/2）的测定
测定半衰期的意义：评价固定化方法；生 产上决定更换酶的时机。 定义：从开始到活力只剩一半时所经历的 时间。有使用半衰期，贮藏半衰期等。 方法：直接法测既费时、费力，有时还不 可行（如半衰期很长）。 参考测定放射性元素半衰期的做法，间接 测定。
间接法测定固定化酶半衰期T 间接法测定固定化酶半衰期T1/2
生物催化剂固定化的优点
o 某些酶回到了它在体内的原始状态。 o 可以重复使用，节约了成本。 o 使用时方便得多，对产物抑制型反应既有 利又方便。 o 催化剂易和产物分离，有利于提高产品质 量（如生产针剂药品，最后不能含蛋白 质）。 o 大多数情况下催化剂固定化后稳定性提高。 o 酶反应过程可以控制。 o 较游离酶更适合于多酶体系反应。
第六章酶反应器案例
固定化酶膜式应器
（4）中空纤维膜反应器
4 ❖特点：可承受较高的操作压力，表面积
膜
大，但易发生浓度极化或孔堵塞。
反
应
器
❖中空纤维酶膜反应器连续制备异麦芽低聚糖
❖ 以淀粉为原料（木薯淀粉或玉米淀粉）。采用中空纤维酶 膜反应器,
❖ 先用α－淀粉酶和异淀粉酶糖化制备麦芽低聚糖; ❖ 后用α－葡萄糖苷酸和真菌淀粉酶转苷制得异麦芽低聚糖。 ❖ 本发明大大缩短糖化、转苷的反应周期,酶用量省,产品质量
器 ❖ 操作：游离酶、固定化酶放入反应器内，底物与气体从底部
的 类
通入。气体经过分散板得到充分分散，气泡提供混合作用。
型 ❖ 优点：适用于有气体吸收的生物反应。
及
特
点
❖啤酒连续发酵塔型固定化活菌体反应器
5.喷射式反应器
❖特点：利用高压蒸汽的喷射作用，实现酶与底物的混
合，进行高温短时催化反应的反应器。 ❖ 催化反应速度快，效率高，可在短时间完成催化反应。
特
下一批反应。
点
连续流式搅拌罐式反应器：
向反应器中投入固定化酶和底物溶液，不断 搅拌，反应平衡后，以恒定流速连续流入底物， 以相同流速输出产物。
1、搅拌罐式反应器
6.1 ❖优点：结构简单，易操作；酶与底物混合充分均
酶 匀；传质速度快，反应能迅速达到稳态；能处理
反 应
胶体状底物、不溶性底物。
器 的
❖ 缺点：反应效率低，搅拌动力消耗；由于搅拌剪
固定化酶膜式反应器
（4）中空纤维酶膜反应器
4 ❖结构：由外壳和数以千计的醋酸纤
膜
维制成的中空纤维组成。中空纤维：
反
内层紧密、光滑，可截留大分子物
应
6 酶学与酶工程 第六章 酶的固定化
2．蛋白总量 (1)双辛可宁酸法(BCA法) (2)考马斯亮蓝法 3．偶联率及相对活力 偶联率＝(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)／加入 蛋白活力X100％ 活力回收＝固定化酶总活力／加入酶的总活力 ×100％ 相对活力＝固定化酶总活力／(加入酶的总活 力一上清液中未偶联酶活力)X100％
物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅 藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。
操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉 价易得，而且可反复使用
于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢
固而容易脱落，
2.包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方
法称为包埋法。
包埋法可分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法（半透膜法） 将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微网格中的称为凝胶包 埋法；
将酶或微生物包埋在高分子半透膜中的称为微胶囊法。包
埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，因 此可以应用于许多酶、微生物的固定化。
1）凝胶包埋法 凝胶包埋法是应用最广泛的固定化方法 主要用包埋载体： 琼脂凝胶， 海藻酸钙凝胶， 角叉菜胶， 明胶， 聚丙烯酰胺凝胶
固定化酶颗粒的扩散阻力会使反应速率下降；
只能用于可溶性底物和小分子底物，对大分子底物不适
宜。
必须注意维持酶的催化活性及专一性 应该有利于生产自动化、连续化
应有最小的空间位阻
酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮存，利 于反复使用
固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物，产物或 反应液发生化学反应
酶工程 第六章酶与细胞固定化 第四节 原生质体固定化
1987年后，前苏联和印度等先后用固定化原生质体进 行生产纤维酶素、β-葡聚糖酶和β-糖苷酶的研究，取得 可喜成果。
第四节 原生质体固定化
3.生物碱的生产 1985年，Kome等人进行固定化麦角菌原生质体生产麦 角碱的研究，虽然产率不高，但显示出较好的操作稳定性， 可连续使用15天。 4.甾体转化 1985年，Linsefors等人用固定化胡萝卜原生质体进 行甾体转化的研究，可以催化毛地黄毒苦进行5β-羟基化 反应，生成杠柳毒苷。 5.木质素降解 1988年，Boettcher等人用固定化白腐真菌原生质体 进行降解木质素的研究，其降解能力比游离细胞显著提高。 从上述例子可见，固定化原生质体技术虽然研究历史 不长，但已在多个领域的研究中显示出其优越性，具有广 阔的应用前景。
第四节 原生质体固定化
2.胞内酶的生产
1986年，华南理工大学生物工程研究所用固定化枯草 杆菌原生质体生产碱性磷酸酶，使原来存在于细胞间质中 的碱性磷酸酶，全部分泌到发酵液中，提高产率36％，可 连续使用37天；用固定化黑曲霉原生质体生产葡萄糖氧化 酶，使细胞内的葡萄糖氧化酶，90％以上分泌到发酵液中； 用固定化谷氨酸棒杆菌原生质体生产谷氨酸脱氢酶，分泌 到发酵液中的谷氨酸脱氢酶占该酶总量的62％。
第四节 原生质体固定化
三、固定化原生质体的应用
固定化原生质体一方面保持了细胞原有的新陈代谢特 性，可以照常产生原来在细胞内生产的各种代谢产物，另 一方面又去除了细胞壁这一扩散屏障，有利于胞内产物不 断地分泌到胞外，这样就可以不经过细胞破碎和提取工艺 而在发酵液中获得所需的发解产物，为胞内物质的工业化 生产开辟了新途径。
固定化原生质体的制备主要包括原生质体的制备和原 生质体固定化两个阶段。
一、原生质体的制备
第四节 原生质体固定化
3.生物碱的生产 1985年，Kome等人进行固定化麦角菌原生质体生产麦 角碱的研究，虽然产率不高，但显示出较好的操作稳定性， 可连续使用15天。 4.甾体转化 1985年，Linsefors等人用固定化胡萝卜原生质体进 行甾体转化的研究，可以催化毛地黄毒苦进行5β-羟基化 反应，生成杠柳毒苷。 5.木质素降解 1988年，Boettcher等人用固定化白腐真菌原生质体 进行降解木质素的研究，其降解能力比游离细胞显著提高。 从上述例子可见，固定化原生质体技术虽然研究历史 不长，但已在多个领域的研究中显示出其优越性，具有广 阔的应用前景。
第四节 原生质体固定化
2.胞内酶的生产
1986年，华南理工大学生物工程研究所用固定化枯草 杆菌原生质体生产碱性磷酸酶，使原来存在于细胞间质中 的碱性磷酸酶，全部分泌到发酵液中，提高产率36％，可 连续使用37天；用固定化黑曲霉原生质体生产葡萄糖氧化 酶，使细胞内的葡萄糖氧化酶，90％以上分泌到发酵液中； 用固定化谷氨酸棒杆菌原生质体生产谷氨酸脱氢酶，分泌 到发酵液中的谷氨酸脱氢酶占该酶总量的62％。
第四节 原生质体固定化
三、固定化原生质体的应用
固定化原生质体一方面保持了细胞原有的新陈代谢特 性，可以照常产生原来在细胞内生产的各种代谢产物，另 一方面又去除了细胞壁这一扩散屏障，有利于胞内产物不 断地分泌到胞外，这样就可以不经过细胞破碎和提取工艺 而在发酵液中获得所需的发解产物，为胞内物质的工业化 生产开辟了新途径。
固定化原生质体的制备主要包括原生质体的制备和原 生质体固定化两个阶段。
一、原生质体的制备
酶工程 第六章 酶的固定化 (2)
（2）载体的因素 • 空间效应：构象效应、位阻效应 • 分配效应 • 扩散阻碍效应
13
2、影响固定化酶性质的因素
（2）载体的因素
• 空间效应：
构象效应：由于酶与载体间的共价键作用，引
起酶活性部位发生扭曲和变形，改变活性部位
的三维结构，导致酶活力下降。
位阻效应：载体结构上的某些不良特征致使酶
18
载体内部固定化酶的传质过程
• 步骤1：底物从液相主体穿过液膜扩散到 载体（胶囊）的外表面 • 步骤 2：底物穿过胶囊微孔，进入胶囊内 部，与酶分子接触 • 步骤 3：底物在胶囊内被酶分子催化发生 反应，生成产物 • 步骤 4：产物穿过胶囊微孔，排出胶囊 • 步骤 5：产物穿过液膜，从胶囊外表面扩 散进入液相主体 • 存在外扩散阻碍和内扩散阻碍
49
• 生物传感器的应用
50
• 例：葡萄糖氧化酶电极
用的酶膜，再 与氧电极及聚四氟乙烯高分子薄膜紧 密结合，组成葡萄糖氧化酶电极
使用时，使酶电极进入样品溶液中，
样品中的葡萄糖扩散到酶膜中，在氧 气的存在下被酶催化氧化生成葡萄糖 酸，根据氧电极测得的氧浓度的变化， 可得知葡萄糖的浓度
41
1、固定化酶在工业生产中的应用
（2）固定化葡萄糖异构酶生产果葡糖浆
耐热性淀粉酶 糖化酶 葡萄糖异构酶
淀粉
pH6.0~6.5 96~100℃ 30min
糊精
葡萄糖
pH3.8~4.5 60℃ 48~72h pH7.8~8.2 61℃
果葡糖浆
含果糖42％，葡萄糖52％
•生产果葡糖浆是酶工程在工业生产中最成功、规模最大的应用。
3、固定化酶的性质：酶活力、稳定性、最适温度、 4、评价固定化酶的指标：固定化酶的比活、半
13
2、影响固定化酶性质的因素
（2）载体的因素
• 空间效应：
构象效应：由于酶与载体间的共价键作用，引
起酶活性部位发生扭曲和变形，改变活性部位
的三维结构，导致酶活力下降。
位阻效应：载体结构上的某些不良特征致使酶
18
载体内部固定化酶的传质过程
• 步骤1：底物从液相主体穿过液膜扩散到 载体（胶囊）的外表面 • 步骤 2：底物穿过胶囊微孔，进入胶囊内 部，与酶分子接触 • 步骤 3：底物在胶囊内被酶分子催化发生 反应，生成产物 • 步骤 4：产物穿过胶囊微孔，排出胶囊 • 步骤 5：产物穿过液膜，从胶囊外表面扩 散进入液相主体 • 存在外扩散阻碍和内扩散阻碍
49
• 生物传感器的应用
50
• 例：葡萄糖氧化酶电极
用的酶膜，再 与氧电极及聚四氟乙烯高分子薄膜紧 密结合，组成葡萄糖氧化酶电极
使用时，使酶电极进入样品溶液中，
样品中的葡萄糖扩散到酶膜中，在氧 气的存在下被酶催化氧化生成葡萄糖 酸，根据氧电极测得的氧浓度的变化， 可得知葡萄糖的浓度
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1、固定化酶在工业生产中的应用
（2）固定化葡萄糖异构酶生产果葡糖浆
耐热性淀粉酶 糖化酶 葡萄糖异构酶
淀粉
pH6.0~6.5 96~100℃ 30min
糊精
葡萄糖
pH3.8~4.5 60℃ 48~72h pH7.8~8.2 61℃
果葡糖浆
含果糖42％，葡萄糖52％
•生产果葡糖浆是酶工程在工业生产中最成功、规模最大的应用。
3、固定化酶的性质：酶活力、稳定性、最适温度、 4、评价固定化酶的指标：固定化酶的比活、半
酶工程第六章 固定化酶
酶的固定化方法主要可分为四类：吸附法、包埋法、共价键结合 法和交联法等。吸附法和共价键结合法又可统称为载体结合法。
6.3.1吸附法
吸附法（adsorption）是通过载体表面和酶 分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的 方法，是固定化中最简单的方法。 酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相 互作用、离子键和氢键等。 吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。
（1）重氮法 重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基
团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用
最多的一种。
常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共
聚体和聚丙烯化生成叠氮化合物，再与酶分子上
的相应基团偶联成固定化酶。含有羟基、羧基、羧甲基等
其新的功能和新的应用正在迅速不断地扩展，是一项
研究领域宽广、应用前景极为引人瞩目的新研究领域和新 技术。
6.1 固定化酶的定义与优点
所谓固定化酶(immobilized enzyme)， 是指在一定的空间范围内起催化作用，并 能反复和连续使用的酶。
固定化酶的优点：
（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用； （2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同 时也省去了热处理使酶失活的步骤； （3）稳定性显著提高； （4）可长期使用，并可预测衰变的速度； （5）提供了研究酶动力学的良好模型。
（1）物理吸附法
物理吸附法(physical adsorption)是通过物理方法将酶
直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。
是制备固定化酶最早采用的方法。
如α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用过此
法进行固定化。物理吸附法常用的有机载体如纤维素、胶 原、淀粉及面筋等；无机载体如活性炭、氧化铝、皂土、 多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。
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细
胞
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生
化 发展历史
工
程 1953年，德国，Grubhofer、Schleith，聚氨基
第 七 章
苯乙烯树脂为载体，重氮法； 1969年，日本，千畑一郎，固定化氨基酰化
固 酶，从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，首次
定 工业规模应用固定化酶，促使酶工程作为一
化 酶 固
个独立的学科从发酵工程中脱离出来； 1971年，第一次国际酶工程会议确定固定化
第一节 酶、细胞的固定化方法及固定化后的 性质
第 七
一、固定化的原则和方法
章 酶催化作用依靠它的高级结构及活性中心。
固 固定化时，活性中心的必需基团应避免参加反
定 化
应；避免高温、强碱、有机溶剂以及高浓度盐
酶 的处理，保护靠氢键、离子键、疏水键等弱键
固 维系的酶蛋白质的高级结构。尽可能在温和条
定 化
定 酶统一英文名称为Immobilized Enzyme。
化
细
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生
化 工
1973年，日本首次在工业上成功应用固定化
程 大肠杆菌菌体中天门冬氨酸酶，由反丁烯二
第 酸连续生产L-天门冬氨酸。
七 章 固 定
1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤 酒和酒精；
1978年，日本用固定化枯草杆菌细胞生产淀
化
酶
固 定 化 细 胞
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生 化
原因可能是：载体间的静电作用，以及扩散
工 效应。如果固定化酶区域的底物浓度比外部
程 第 七
液相主体溶液高，Km(app)下降。相反，用包 埋法的固定化酶的Km(app)值，可较游离酶多
水不溶性酶
固 定
（固定化酶）
化
细
胞
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生 化
固定化酶生物反应器
工 程 第 七
实际应用中，固定化酶可以装在反应器中， 连续生产有利于生产的自动化，提高生产率。
鉴于此，70年代以来，该技术受到各国学者
章 的瞩目，纷纷开展固定化酶的研究。
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固 定 化 细 胞
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生
化 工 程
第七章 固定化酶、固定化细胞
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生
化 工
概述
程 酶催化剂的优点：
第 七 章
专一性强，反应条件温和，反应速度较快。 弱点：
固 溶液酶在反应后，分离困难，重复利用困难；
定 溶液酶稳定性差，易失活。
化
酶 1969出现了固定化酶技术。
固 固定化酶就是把原来游离的水溶性酶，固定于
定 化
某一局部的空间或者固定于载体上。
化 粉酶，开始了固定化细胞产酶的先例。
酶 固 定
1979年，固定化毛地黄细胞和长春花细胞成 功；
化 1982年，日本首次研究用固定化原生质体生
细 胞
产谷氨酸。
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生 化
固定化酶：
工 程 第
酶的固定化：将酶和菌体与不溶性载体结合 的过程；
七 固定化酶：在一定空间内呈闭锁状态存在的
章 酶，能连续进行反应，反应后的酶可回收重
（如：戊二醛）进行反应，应用化学键把酶 固定。
化
细
胞
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生
化 包埋法：将酶包在凝胶微小格子内，或是将
工 酶包裹在半透性聚合物膜内的固定化方法。
程 第 七
常用的凝胶为聚丙烯酰胺、海藻酸钙、胶原、 卡拉胶等。
章 包埋法简单，可适用于大多数酶。
固 定 化 酶
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件下进行固定化反应。
细
胞
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固定化方法：
工 载体结合法；交联法；包埋法；其他方法；
程
第 载体结合法：将酶（细胞）固定在不溶性载
七 体上。靠共价结合、离子结合、和物理吸附。
章 常用的载体：纤维素、葡聚糖、琼脂糖等多
固 定
糖衍生物颗粒或多孔玻璃等。
化 酶 固 定
交联法：使酶与具有两个以上官能团的试剂
具有生物催化剂的功能，又有固相催化剂的 功能。
①可多次使用；
章 ②反应后，酶底物产物易分开，产物中无残
固 定 化
留酶，易纯化，产品质量高； ③反应条件易控制；
酶 ④酶的利用效率高；
固 ⑤比水溶性酶更适合于多酶反应；
定 化 细 胞
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化
章
固
固定化技术
定
化 酶
固 定 化
复使用； 概念发展
酶 “水不溶酶”（water insoluble enzyme)
固 定 化
“固相酶”（solid phase enzyme) 1971年第一届国际酶工程会议正式采用“固
细 定化酶（immobilized enzyme)”
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生
化 固定化酶的特点
工 程 第 七
酶 固 定
b. 由于载体的存在，有空间位阻，影响底物 和酶接触，酶的活性得不到全部表达。
化 细胞固定化后，一般酶活力不下降。细胞内
细 胞
酶受细胞膜、壁的保护。
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生
化 固定化酶结构的改变
工 程
第 七 章
固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
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化 2、稳定性
工 程 第
酶或细胞被固定化后，由于载体的存在，酶 分子的结构或细胞被约束，对外部恶劣环境
化 酶 固 定
⑵纤维状固定化酶； ⑶膜状固定化酶； ⑷管状固定化酶；
化
细
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二、 固定化酶、细胞的性质
工 程
1、固定化后的活性
第 酶经固定化后，活力降低。
七 章 固 定
原因是：
a. 酶和载体结合时，活性中心的氨基酸也或 多或少地参与了结合 ，使得酶的结构发生部
化 分变化，酶活力有一部分丧失。
化 有的不变化，有的向pH小的方向移动，有的
酶 固
向pH大的方向移动。
定
化
细
胞
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生 化
c.反应的最适温度
工 固定化酶、细胞的最适温度往往升高，升
程 高的幅度不同，2~15 ℃不等。
第
七 d.动力学常数
章 固 定
固定化酶的表观Km(app)与游离酶的Km相比 有些不变，有的 变化很大。
生 化 工 程
第 七 章
固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
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生 化 工 程
第 七 章
固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
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生 化
固定化方法与载体的选择依据
工 ⑴固定化酶应用的安全性；
程 ⑵固定化酶在操作中的稳定性；
第 七
⑶固定化的成本；
章 固
固定化酶的形状
定 ⑴颗粒状固定化酶；
七 的敏感性下降，使其稳定性增加（对热、对
章 各种化学试剂等）。而且有时稳定性增加的
固 定
幅度比较大。
化
酶
固 定 化 细 胞
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生 化
3、催化特征
工 程
a.底物专一性：当底物为大分子时，酶或细胞
第 对底物专一性下降；当底物为小分子时，酶
七 或细胞对底物专一性变化不大。
章 固 定
b.最适pH：依固定化载体与酶分子、细胞上 所分布电荷的相互作用不同而异。有的变化，