基因克隆工具酶
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酶是属于第三个限制修饰系统的酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
4. II 型限制性核酸内切酶的基本特性
(1)识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列
(2)识别序列呈典型的旋转对称型回文结构
(3)大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧
EcoR I的切割位点
EcoRI 37 ℃
5‘ … G-C-T-G-OH 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
磷酸二酯键发生水解
P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ OH-G-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
OH P
5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
OH P
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
P OH
nick缺口
PvuII等产生的平头末端
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’
H i n d III H i n d III
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
3.限制性核酸内切酶的命名
• H：细菌属名的头一个字母 • in：细菌种名的头两个字母 • Hin：表示了该菌的物种名称，用斜体 • d：代表该菌菌株名称 • III：表示该菌具有几个不同的限制与修饰体系，Ⅲ表示该
保证外来DNA分子不会受其限制酶的降解
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
2.限制性核酸内切酶的类型
主要特性
I型
II 型
III 型
限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列
多功能 异源三聚体 ATP Mg22++SAM TGAN8TGCT AACN6GTGC
单功能 同源二聚体
Mg22++ 旋转对称序列
双功能 异源二聚体 ATP Mg22++SAM
GAGCC CAGCAG
切割位点 距识别序列1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游
随机性切割
特异性切割
24-26bp处
SAM：S-腺苷蛋氨酸
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
2.限制性核酸内切酶的类型
PvuII 37 ℃ 磷酸二酯键发生水解
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH 3‘ … C-G-A-G-T-C-P
P-C-T-G-G-A-G … 3’ OH-G-A-C-C-T-C … 5’
• 限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不带有种的特征， 对各种DNA都普遍适用。因此，甲种生物的DNA与乙种生 物的DNA用同一种限制酶作用后，所形成的限制片段带有 同样的末端，能够通过碱基的互补配对而连接起来。这是 重组DNA技术的重要基础之一。根据这一特性，可以将不 同来源的DNA重组成一种新的重组体分子。
• 功能：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链。 限制性核酸内切酶的发现与应用导致了体外重组DNA技术 的发展，使人们有可能将很大的DNA分子定向性地切割成 较小的DNA片段，然后运用各种技术手段对其进行分析， 从而能对生物体的基因结构、组织表达及进化问题进行深 入的研究
• 来源：主要是从原核生物中分离纯化得到。到目前为止， 已经从近300种不同的微生物中分离出约500种限制性核 酸内切酶
• 限制性核酸内切酶 • DNA连接酶 • DNA聚合酶 • 核酸酶 • 核酸修饰酶
NMP NTP dNMP dNTP
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能
• 发现：1970年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分 离出HindII和HindIII
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
EcoRI等产生的5’粘性末端
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’
• Ⅱ型酶的作用方式在基因工程中具有十分重要的价值，是 基因工程中常用的工具酶。
• Ⅰ型酶、Ⅲ型酶的使用不如Ⅱ型酶方便，切割方式不如Ⅱ 型酶那样令人满意，在基因克隆中实用价值不大。
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
3.限制性核酸内切酶的命名
属名
种名 株名
Haemophilus infFra Baidu bibliotekuenzae d 嗜血流感杆菌d株
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能
• 生物学意义：限制性核酸内切酶，可以帮助细菌限制外来 DNA的入侵
• 细菌中的防卫系统：限制与修饰现象 （1）细菌在其感受态的生理条件下，很容易吸收外源 DNA进入体内。这种感受态可以是人为的，也可以是在自 然条件下发生的。如果细菌不加限制地接受所有的外源 DNA，细菌本身就会很快发生遗传变异甚至死亡。 （2）限制性核酸内切酶 （3）甲基化酶：对该特异位点的腺嘌呤A进行甲基化修饰， 被修饰的DNA就不再被相应的限制酶切割了。 （4）细菌自身的DNA——受到甲基化修饰，得以保存
（5）外源入侵的DNA——未来得及甲基化，被降解
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能
• 作为分子克隆宿主菌的大肠杆菌（例如DH5α），必须是 （1）rec基因缺陷型的突变体 保证必须不与同外来DNA分子发生遗传重组 （2）限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株
P OH
nick缺口
PstI等产生的3’粘性末端
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
PstI 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH 3‘ … C-G-A-G-P
磷酸二酯键发生水解
P-G-G-A-G … 3’ OH-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
4. II 型限制性核酸内切酶的基本特性
(1)识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列
(2)识别序列呈典型的旋转对称型回文结构
(3)大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧
EcoR I的切割位点
EcoRI 37 ℃
5‘ … G-C-T-G-OH 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
磷酸二酯键发生水解
P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ OH-G-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
OH P
5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
OH P
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
P OH
nick缺口
PvuII等产生的平头末端
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’
H i n d III H i n d III
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
3.限制性核酸内切酶的命名
• H：细菌属名的头一个字母 • in：细菌种名的头两个字母 • Hin：表示了该菌的物种名称，用斜体 • d：代表该菌菌株名称 • III：表示该菌具有几个不同的限制与修饰体系，Ⅲ表示该
保证外来DNA分子不会受其限制酶的降解
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
2.限制性核酸内切酶的类型
主要特性
I型
II 型
III 型
限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列
多功能 异源三聚体 ATP Mg22++SAM TGAN8TGCT AACN6GTGC
单功能 同源二聚体
Mg22++ 旋转对称序列
双功能 异源二聚体 ATP Mg22++SAM
GAGCC CAGCAG
切割位点 距识别序列1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游
随机性切割
特异性切割
24-26bp处
SAM：S-腺苷蛋氨酸
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
2.限制性核酸内切酶的类型
PvuII 37 ℃ 磷酸二酯键发生水解
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH 3‘ … C-G-A-G-T-C-P
P-C-T-G-G-A-G … 3’ OH-G-A-C-C-T-C … 5’
• 限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不带有种的特征， 对各种DNA都普遍适用。因此，甲种生物的DNA与乙种生 物的DNA用同一种限制酶作用后，所形成的限制片段带有 同样的末端，能够通过碱基的互补配对而连接起来。这是 重组DNA技术的重要基础之一。根据这一特性，可以将不 同来源的DNA重组成一种新的重组体分子。
• 功能：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链。 限制性核酸内切酶的发现与应用导致了体外重组DNA技术 的发展，使人们有可能将很大的DNA分子定向性地切割成 较小的DNA片段，然后运用各种技术手段对其进行分析， 从而能对生物体的基因结构、组织表达及进化问题进行深 入的研究
• 来源：主要是从原核生物中分离纯化得到。到目前为止， 已经从近300种不同的微生物中分离出约500种限制性核 酸内切酶
• 限制性核酸内切酶 • DNA连接酶 • DNA聚合酶 • 核酸酶 • 核酸修饰酶
NMP NTP dNMP dNTP
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能
• 发现：1970年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分 离出HindII和HindIII
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
EcoRI等产生的5’粘性末端
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’
• Ⅱ型酶的作用方式在基因工程中具有十分重要的价值，是 基因工程中常用的工具酶。
• Ⅰ型酶、Ⅲ型酶的使用不如Ⅱ型酶方便，切割方式不如Ⅱ 型酶那样令人满意，在基因克隆中实用价值不大。
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
3.限制性核酸内切酶的命名
属名
种名 株名
Haemophilus infFra Baidu bibliotekuenzae d 嗜血流感杆菌d株
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能
• 生物学意义：限制性核酸内切酶，可以帮助细菌限制外来 DNA的入侵
• 细菌中的防卫系统：限制与修饰现象 （1）细菌在其感受态的生理条件下，很容易吸收外源 DNA进入体内。这种感受态可以是人为的，也可以是在自 然条件下发生的。如果细菌不加限制地接受所有的外源 DNA，细菌本身就会很快发生遗传变异甚至死亡。 （2）限制性核酸内切酶 （3）甲基化酶：对该特异位点的腺嘌呤A进行甲基化修饰， 被修饰的DNA就不再被相应的限制酶切割了。 （4）细菌自身的DNA——受到甲基化修饰，得以保存
（5）外源入侵的DNA——未来得及甲基化，被降解
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能
• 作为分子克隆宿主菌的大肠杆菌（例如DH5α），必须是 （1）rec基因缺陷型的突变体 保证必须不与同外来DNA分子发生遗传重组 （2）限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株
P OH
nick缺口
PstI等产生的3’粘性末端
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
PstI 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH 3‘ … C-G-A-G-P
磷酸二酯键发生水解
P-G-G-A-G … 3’ OH-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’