基因克隆工具酶
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
基因工程-第二章--基因克隆所需的工具酶
一般酶的反应条件： 温度：37℃ PH：7.2 DNA酶切反应
（控制反应时间）
时间：2小时
完全消化
部分消化
1/14/2019
苏州科技学院生物系
叶亚新
影响限制酶消化DNA的若干因素
双酶消化
反应条件相同：同时加到反应管，同时反应 对温度要求不同：先低温消化，再高温消化 对盐浓度要求不同：先低盐酶消化，再高盐酶 消化
1/14/2019 苏州科技学院生物系 叶亚新
四．限制酶的特点
３）对称性—双对称 EcoRI 5’-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’ ４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外 ５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ 2. 末端种类 １）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸 Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA G-3’ 3’-GACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’ ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸 EcoRI 5’-GAATTC-3’ 5’-GOH PAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ 3’-CTTAAP HOG-5’
1/14/2019
苏州科技学院生物系
叶亚新
6、限制性内切酶的星号活性
在某些反应条件下，限制酶识别顺序的特 异性可能发生变化，结果一种限制酶酶 切同一种DNA片断会产生新的酶切位点， 得到不同的酶切片断，这就是限制酶的 星号活性（star activity） EcoR 1 GAATTC----AATT
1/14/2019 苏州科技学院生物系 叶亚新
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点 １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC Bam HI GGATCC；PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGG N’ N’N’N’N’ CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突起 ２）富含ＧＣ
基因工程基因工程工具酶
基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。
在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。
本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。
它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。
1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。
它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。
一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。
1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。
它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。
通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。
二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。
在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。
2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。
它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。
2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。
它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。
通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。
三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。
在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。
3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。
它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。
3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。
它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。
基因工程的工具酶
用衔接物分子连接平末端的DNA片段
衔接物：指用化学方法 合成的一段由若干个核 苷酸组成的、具有一个 或数个限制酶识别位点 的寡核苷酸片段
四、重组DNA实验的一般程序
a. 选用一种对载体DNA只具唯一限制识别位点的限制酶
（如EcoR I）作位点特异的切割，形成全长的具粘性 末端的线性DNA分子 b. 再将外源DNA片段也用同一种酶作相同的消化。 c. 混合，加入DNA连接酶。由于具有相同的（如EcoR I） 粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺口经 DNA连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种DNA分子。
核酸水解酶类
核酸内切酶 核酸外切酶
DNA聚合酶 RNA聚合酶 DNA连接酶 磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
程常用工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶
分子克隆最常用两个工具酶
“分子 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的 特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
④ 反应体积和甘油浓度：
商品化的限制性内切核酸酶均加50％甘油 作为保护剂，一般在-20℃保存。酶切反应时， 加酶的体积一般不超过总反应的10％，否则甘 油浓度过高，影响酶切反应
⑤ 反应时间：通常为1h；进行大量DNA酶切反 应时一般让酶解过夜
⑥ DNA纯度和结构 DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、
4. Taq DNA聚合酶
5. 逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶
6. RNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶I
以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到 双链DNA分子的 3’-OH 端而合成新的 DNA.
用途：DNA缺口平移中标记DNA探针
基因工程-工具酶
基因敲入
2
能。
利用工具酶将外源DNA片段整合到目标基
因中，实现新基因的表达。
3
基因编辑
通过工具酶修饰目标基因的特定碱基， 实现精确的基因改造。
农业、医药和工业领域的应用
农业
利用基因工程和工具酶，开发抗 虫、抗病、耐旱和高产的转基因 作物。
医药
工具酶在基因治疗中起着关键作 用，用于修复人类遗传病和癌症 等疾病的基因。
基因工程-工具酶
基因工程是利用DNA技术对生物体进行改造的科学，工具酶在基因工程中起 着至关重要的作用。
工具酶的作用
工具酶是基因工程中的重要工具，用于切割、连接和修饰DNA分子，使得科 学家能够精确操控基因。
常用的工具酶类型
限制酶
识别和切割DNA序列，用于定位和克隆特定基因。
连接酶
将不同DNA片段连接在一起，构建重组DNA分子。
修饰酶
对DNA分子进行修饰，如甲基化、去甲基化等。
造极酶
用于扩增DNA序列，如聚合酶链反应（PCR）中 的DNA聚合酶。
工具酶的工作原理
工具酶通过与DNA特定序列的互作用，识别并结合到目标序列上，然后以特 定的方式切割、连接或修饰DNA分子。
பைடு நூலகம்
基因修饰的方法
1
基因敲除
通过工具酶切割目标基因，使其失去功
工业
利用工具酶进行工业发酵，生产 各种化学品、药物和生物燃料。
挑战和限制
• 技术限制：某些DNA序列难以切割或修饰。 • 安全问题：基因修饰可能带来意想不到的风险和后果。 • 伦理考虑：对基因工程的道德和伦理问题需引起广泛关注。 • 法律和监管：基因工程面临严格的法律和监管要求。
分子克隆中常用的四种工具酶及其应用
分子克隆中常用的四种工具酶及其应用分子克隆是利用分子生物学技术对目标DNA进行扩增及克隆的过程。
在分子克隆的过程中，常常需要使用许多酶类工具来完成不同的任务。
以下介绍了分子克隆过程中最常用的四种酶类工具及其应用。
1. 限制性内切酶限制性内切酶（Restriction endonuclease）又称限制酶，是一类可特异性切割DNA特定序列的酶。
它可以在DNA的特定位置切割成不同的碎片，而不会破坏DNA的结构。
因此，限制酶被广泛应用于DNA的纯化、分析和重组等领域。
在分子克隆中，限制酶通常用于切割DNA的特定序列，以获得所需的DNA片段。
同时，也可以用于制备载体DNA的端部修饰，方便插入外来DNA片段。
此外，限制酶还可以用于分析DNA序列的变异和同源性等特征。
2. DNA连接酶DNA连接酶（DNA ligase）是一种催化DNA连结软帽酶，用于连接具有互补末端的DNA片段。
连接酶广泛应用于DNA重组、引物连接、克隆和测序等领域。
在分子克隆中，DNA连接酶通常使用于将外来DNA片段连接到载体 DNA 上。
此外，为了克隆具有完整DNA序列的目标基因，连接酶还可以用于连接PCR扩增出来的目标DNA序列。
3. PCR酶聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）是一种快速、有效、敏感的DNA扩增技术。
在PCR过程中，通过PCR酶催化下的DNA扩增反应，能够在很短的时间内扩增目标DNA的数量。
在分子克隆中，PCR酶通常用于扩增目标DNA片段。
利用PCR技术，可以选择性增加目标DNA的数量并在容易处理的基本DNA片段之间产生特定的限制酶切断部位，为后续分子克隆实验提供方便。
4. 接头酶接头酶（T4 DNA ligase）是一种针对DNA单链断裂或缺口进行修复和连接的酶。
在分子克隆中，接头酶主要用于将外来DNA片段和载体DNA粘到一起。
在分子克隆的过程中，外来DNA片段和载体DNA之间通常存在一些不兼容的末端或过于短的重叠部分。
基因工程工具酶及其应用
基因工程工具酶及其应用基因工程工具酶，顾名思义就是我们用来“操作”基因的那些“利器”，就像是高科技的“剪刀”和“胶水”，专门用来“修修补补”DNA的。
可能你会想，这个听起来是不是太复杂了？其实不然，别看它名字高大上，搞不好你每天吃的菜、喝的牛奶里就藏着它们的身影。
基因工程工具酶，乍一听让人觉得神秘，但它们实际上跟我们的生活息息相关，甚至在一些药品、疫苗的生产中，都少不了它们的身影。
说白了，它们就是为我们生活提供方便的小助手，做事不露声色，却能起到大作用。
要说的就是“限制性内切酶”，这个名字一听就让人觉得高深莫测，但它其实是个“拆家伙”。
它们的任务就是识别DNA中的特定序列，然后像个“小剪刀”一样，把DNA在特定的位置剪开。
这就好比你在家里找到了一个搞破坏的小偷偷偷把你家的锁给撬开了，不过呢，这种“撬锁”可不是什么坏事，它反而能帮我们更好地了解基因结构，还能帮我们在实验室里搞“基因拼图”。
比方说，如果你想从一个复杂的基因组里找到一个你感兴趣的基因，限制性内切酶就能把DNA剪成小片段，再通过其他技术把需要的部分“提取”出来，哎，这可是一项不小的技术活儿。
然后，得说说“连接酶”，你可以把它当作是“超级胶水”。
我们知道，DNA是由一段段的核苷酸组成的，断了的DNA片段就像是没接上的拼图。
这个时候，连接酶就登场了，它们可以把这些断裂的DNA片段粘合在一起。
想象一下，你买的拼图掉了一块，结果就拿来一瓶超级胶水，把它们完美粘合。
就这么简单。
它们的作用可不小哦，如果没有这些“胶水”，那些修补过的基因就根本没办法发挥作用。
很多时候，我们需要通过“拼接”不同的基因片段，来合成新的基因。
这个时候，连接酶就像是一个细心的工匠，把那些“零碎”的DNA拼接成一个完整的“作品”。
再来说说“聚合酶”，这也是我们生活中常见的一位“幕后英雄”。
如果你做过PCR实验，你一定听说过它。
聚合酶就像一个“复制工厂”，它能在一定条件下，把DNA分子一个接一个地“复制”出来。
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤植物基因的克隆08医用二班姚桂鹏0807508245简介克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。
通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。
本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。
关键词植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法Plant gene cloningIntroductionCloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes meansbased on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. KeywordsPlant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy一、植物基因的结构和功能基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。
分子克隆工具酶
同尾酶(Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如 BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等。
BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
Bgl Ⅱ 5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’
Bcl I 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’
完全同裂酶 识别位点和切点完全相同。 如Hind Ⅲ 和Hsu I。
Hind Ⅲ Hsu I
5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
不完全同裂酶
识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。
Xma I Sma I
5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
限制（Restriction）
限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA 切成小片断。
修饰（Modification）
细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修 饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别 切割。
① Dam甲基化酶 GATC腺嘌呤N6位置引入甲基。
② Dcm甲基化酶
CCAGG或CCTGG序列在第二个 C上C5位置上引入甲基。
ATP、Mg2+、 SAM GAGCC CAGCAG
距识别序列下游 24-26bp处
I型限制性内切酶
I型酶属复合功能酶，兼具限制、修饰两 种功能。核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和 DNA解旋酶4种活性。
显著特点：识别位点与切割位点不一致。 酶分子首先由M. Meselson和R. Yuan在 1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。 代表：EcoB和 EcoK。
分子克隆技术常用的工具酶
已分离到与许多Ⅱ类限制酶相对应的甲基化酶。其命名是在 对应II类限制酶名称前加一个M表示。
如M．EcoR I是能使EcoR I识别序列中(GAATTC)3’-端的A甲
基化(GAm6ATTC)的酶
识别序列中某些碱基甲基化对II类限制酶的影响至 少有3种：
①敏感的，甲基化后不能再切割；
DNA用的乙醇。
2）甲基化
识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。 限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，会 阻碍限制酶的酶解活性。 受甲基化影响的酶在商品说明书中都会有标示。
所用符号为：m4C表示N4-甲基化胞嘧啶，m5C为C5-甲基胞嘧啶。
3）底物性状
随底物的不同而活性发生改变
仅2003年1-4月份就有150余种新的酶被登录入网，至2003年 04月19日, REBASE (The Restriction Enzyme Database) 收集的 编号已有7096种；其中Ⅱ类酶有3845种．
根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等， 一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。
②不敏感的．甲基化后仍可切割；
③依赖于甲基化的，只有甲基化后才能切割。
一、大肠杆菌DNA聚合酶 I
1 三种酶活性 1 ）DNA聚合活性
5' A T
||| |
3' T A C G dTTTP
5'
5’ 5’
引物
2）核酸外切酶活性
5’ A G C T T C A G G A T A
(-) 放线菌素D (-)
DNA合成
RNA
DNA(前病毒)
RNA
逆转录酶的应用:
应用于基因工程
克隆酶的名词解释
克隆酶的名词解释克隆酶是一种重要的生物技术工具，被广泛应用于分子生物学领域。
它是一种特殊的酶，能够在DNA分子上切割、连接和复制特定的DNA序列。
克隆酶起到了“创造”和“复制”的作用，使科学家们能够操纵、研究和重组基因。
一、克隆酶的基本原理克隆酶主要通过切割、连接和修复DNA分子来实现其功能。
在DNA分子链中，克隆酶能够识别和切割具有特定序列的DNA，形成切点。
科学家们可以在这些切点上进行DNA分子的分离、重组和修复。
二、克隆酶的分类根据作用方式和切割特点，克隆酶可以被分为多个不同的类别。
常见的克隆酶包括限制性内切酶、连接酶、修复酶等。
1. 限制性内切酶限制性内切酶是一类能够切割DNA分子的特异性酶。
它们能够识别DNA中的特定序列，并在该序列的特定位点上切割DNA分子。
这种切割使原本连续的DNA链断裂，形成两端带有特定序列的切点。
限制酶不仅能够实现DNA的分离、复制和修复，还可以用于构建DNA文库、进行基因工程等。
2. 连接酶连接酶是一类能够将两个DNA分子连接在一起的酶。
它能够将DNA的两个切点通过酯键连接起来，形成一个新的DNA分子。
这种连接通常是可逆的，所以科学家们可以反复使用连接酶进行DNA的重组和修复。
3. 修复酶修复酶是一类能够修复DNA分子切割位点的酶。
当DNA链断裂时，修复酶能够识别切割位点，并进行DNA链复合，恢复原本连续的DNA结构。
这种修复对于维持DNA的完整性和稳定性至关重要。
三、克隆酶在生物技术中的应用克隆酶在分子生物学和生物技术领域具有广泛的应用。
它们被广泛应用于基因工程、基因组学、蛋白质工程等领域。
以下是一些典型的应用案例：1. 基因工程克隆酶可以将感兴趣的DNA序列插入到载体DNA上，构建重组DNA分子。
这些重组DNA分子可以用于转化、转染等基因工程技术，实现外源基因的表达和调控。
2. DNA文库构建利用克隆酶，科学家们可以将大量的DNA序列插入到载体DNA上，形成DNA文库。
分子克隆工具酶及其应用
命名
EcoR I
Escherichia coli RY13株
大肠杆菌 RY13株的第一种酶
属种 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
限制酶的特点
识别顺序和酶切位点 ---识别4~8个相连的核苷酸
限制酶的用途
• DNA重组 • 限制酶（物理）图谱绘制 • 突变分析（RFLP分析）
几个在分子克隆中应注意使用内切酶：
Dpn I:
CH3
GA TC CT AG
Sap I: GCTCTTCNNNN CGAGAAGNNNN
CH3
DNA 甲 基 化 酶
(DNA Methylase)
甲基化酶的种类与识别顺序
--切点大多数在识别顺序之内，也有例外
--限制酶切后产生两个末端: 5’-P和3’-OH
3’-端突起
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’
5’-端突起
EcoR I 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
5’-CTGCAOH 3’-GP
5’-GOH 3’-CTTAAP
识别序列* GG(A/T)CC(A/T)GG
TGATCA GATCGAT CC(A/T)GG GGTGATC
GATC GATCGCGA GGNCC(A/T)GG CC(A/T)GG AGGCCTGG
GATCGA TCTAGATC
甲基化酶 dcm dam dam dcm dam dam dam dcm dcm dcm
RE
RE
RE
CH3
用于cDNA的连接
RE 甲基 化酶
生物技术课件——基因工程常用工具酶
HO GCA…5’
5’…ACGAATTCGT…3’
T4DNA连接酶 Mg2＋，ATP
3’…TGCTTAAGCA…5
反应系统：ATP，Tris－HCl，MgCl2，DTE（二硫赤藓糖醇），ATP， pH7.5，4～15℃
h
28
也可以连接两条平起末端的DNA分子，但反 应速度较慢。
5’…CGAOH
DNA聚合酶在DNA复制时起关键作用。
DNA聚合酶主要有三类：聚合酶Ⅰ(polⅠ)、 聚合酶Ⅱ(polⅡ) ，聚合酶Ⅲ(polⅢ)。其 中聚合酶Ⅰ参与DNA修复，聚合酶Ⅲ参与DNA 复制。聚合酶Ⅰ是基因工程中的常用酶。
h
32
DNA聚合酶Ⅰ在DNh A复制过程中的作用 33
DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ的比较
h
7
2.1.1.2 R-M系统
细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构 成了寄主控制的限制—修饰系统(R-M Restrictionmodification system)。
R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的 限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可 以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则 会被降解。
2 基因工程常用工具酶
h
1
基因工程的重要特点之一是在体外实行DNA分子的切 割和重新连接。因此，工具酶是DNA体外操作必不可 少的工具。
取得编码某种药物的目的基因，大多需要工具酶－限 制性核酸内切酶
将目的基因与载体DNA连接在一起，也需要工具酶－ DNA连接酶。
目前，许多厂商都在生产各种优质工具酶，简化了分
感染
E.coli k
Phageλ（k）
B 限制 λ（不k感）染』
8-1-基因克隆的工具酶
9
2.1 DNA聚合酶Ⅰ (DNApolymerase I)
5ˊ→3ˊ聚合酶活性 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性 5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性
10
2.2 DNA聚合酶Ⅰ大片段
(large fragment of DNApolymerase I)
DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大 片段，这个片段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。 5ˊ→3ˊ聚合酶活性 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性 无5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性
限制性内切酶的命名
EcoR Ⅰ： E代表Escherichia属 co代表coli 种 R代表RY13株
7
限制性内切酶的识别和切割位点
通常是4～6个碱基对、具有回文序列（palindrom）的 DNA片段，大多数酶错位切割双链DNA，产生5ˊ或3ˊ黏性末 端（sticky end）。
8
2. 其他常用工具酶
第八章 基因克隆与体外表达
基因克隆的工具酶
1
。 Paul Berg：1926～ Stanley N. Cohen
自从1973年首次采用质粒与外源 DNA体外重组的方法克隆 DNA以来，重组DNA技术作为分子生物学的一项重要技术得到了迅速 发展，使科学家们分离、分析及操作基因的能力达到几乎无所不能的地步。
活性 识别特异碱基序列，切割DNA 催化DNA5ˊ-磷酸与3ˊ-羟基形成磷酸二酯键
DNA聚合酶 逆转录酶 碱性磷酸酶 末端脱氧核苷酸转移酶
以DNA为模板合成DNA 以RNA为模板合成cDNA 切除5端磷酸根 催化3端合成同聚尾
18
思考题：
简述限制性核酸内切酶等基因克隆 常用工具酶的异同点，并说说它们在基 因克隆操作中的重要性。
基因工程常用的工具酶
基因工程常用的工具酶常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系生物制药0911 刁亚军学号:2009423134引言:在基因工程的研究和发展过程当中，有许多必不可少的因素影响和制约着基因工程的进展。
本篇综述主要讲述的是基因工程常用的一些工具酶，他们包括限制性内切酶，DNA聚合酶，T4噬菌体DNA连接酶，T4多聚核苷酸激酶，碱性磷酸酶，核酸酶。
这些酶在基因工程中发挥着非常重要的作用。
限制性内切酶限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。
根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。
III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。
限制性内切酶的由来一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组限制性核酸内切酶成，第四个字母表示菌株(品系)。
例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。
限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。
Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。
别名Endodeoxyribonuclease简称限制酶酶反应限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。
它能识别外源DNA并将其降解。
单位定义在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
退火 4-7 ℃
OH P
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
P OH
nick缺口
PvuII等产生的平头末端
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’
酶是属于第三个限制修饰系统的酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
4. II 型限制性核酸内切酶的基本特性
(1)识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列
(2)识别序列呈典型的旋转对称型回文结构
(3)大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧
EcoR I的切割位点
H i n d III H i n d III
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
3.限制性核酸内切酶的命名
• H：细菌属名的头一个字母 • in：细菌种名的头两个字母 • Hin：表示了该菌的物种名称，用斜体 • d：代表该菌菌株名称 • III：表示该菌具有几个不同的限制与修饰体系，Ⅲ表示该
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能
• 生物学意义：限制性核酸内切酶，可以帮助细菌限制外来 DNA的入侵
• 细菌中的防卫系统：限制与修饰现象 （1）细菌在其感受态的生理条件下，很容易吸收外源 DNA进入体内。这种感受态可以是人为的，也可以是在自 然条件下发生的。如果细菌不加限制地接受所有的外源 DNA，细菌本身就会很快发生遗传变异甚至死亡。 （2）限制性核酸内切酶 （3）甲基化酶：对该特异位点的腺嘌呤A进行甲基化修饰， 被修饰的DNA就不再被相应的限制酶切割了。 （4）细菌自身的DNA——受到甲基化修饰，得以保存
• 功能：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链。 限制性核酸内切酶的发现与应用导致了体外重组DNA技术 的发展，使人们有可能将很大的DNA分子定向性地切割成 较小的DNA片段，然后运用各种技术手段对其进行分析， 从而能对生物体的基因结构、组织表达及进化问题进行深 入的研究
• 来源：主要是从原核生物中分离纯化得到。到目前为止， 已经从近300种不同的微生物中分离出约500种限制性核 酸内切酶
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
EcoRI等产生的5’粘性末端
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’
PvuII 37 ℃ 磷酸二酯键发生水解
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH 3‘ … C-G-A-G-T-C-P
P-C-T-G-G-A-G … 3’ OH-G-A-C-C-T-C … 5’
• 限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不带有种的特征， 对各种DNA都普遍适用。因此，甲种生物的DNA与乙种生 物的DNA用同一种限制酶作用后，所形成的限制片段带有 同样的末端，能够通过碱基的互补配对而连接起来。这是 重组DNA技术的重要基础之一。根据这一特性，可以将不 同来源的DNA重组成一种新的重组体分子。
（5）外源入侵的DNA——未来得及甲基化，被降解
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能
• 作为分子克隆宿主菌的大肠杆菌（例如DH5α），必须是 （1）rec基因缺陷型的突变体 保证必须不与同外来DNA分子发生遗传重组 （2）限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株
保证外来DNA分子不会受其限制酶的降解
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
2.限制性核酸内切酶的类型
主要特性
I型
II 型
III 型
限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列
多功能 异源三聚体 ATP Mg22++SAM TGAN8TGCT AACN6GTGC
单功能 同源二聚体
• 限制性核酸内切酶 • DNA连接酶 • DNA聚合酶 • 核酸酶 • 核酸修饰酶
NMP NTP dNMP dNTP
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能
• 发现：1970年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分 离出HindII和HindIII
EcoRI 37 ℃
5‘ … G-C-T-G-OH 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
磷酸二酯键发生水解
P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ OH-G-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
OH P
5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’
Mg22++ 旋转对称序列
双功能 异源二聚体 ATP Mg22++SAM
GAGCC CAGCAG
切割位点 距识别序列1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游
随机性切割
特异性切割
24-26bp处
SAM：S-腺苷蛋氨酸
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
2.限制性核酸内切酶的类型
• Ⅱ型酶的作用方式在基因工程中具有十分重要的价值，是 基因工程中常用的工具酶。
• Ⅰ型酶、Ⅲ型酶的使用不如Ⅱ型酶方便，切割方式不如Ⅱ 型酶那样令人满意，在基因克隆中实用价值不大。
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
3.限制性核酸内切酶的命名
属名种名 ຫໍສະໝຸດ 名Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株
P OH
nick缺口
PstI等产生的3’粘性末端
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
PstI 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH 3‘ … C-G-A-G-P
磷酸二酯键发生水解
P-G-G-A-G … 3’ OH-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’