临床微生物学和微生物学检验
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抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该 药对测试菌的最低抑制浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小 。
•
•含药纸 片 •抑菌圈
•
方法：
菌液制备：挑取孵育16-24h的血平板上数个菌落置于 生理盐水管中，校正浓度至0.5麦氏标准；
了解稀释法的质量控制。
•
实验内容
常用抗菌药物敏感性试验与耐药检测 方法介绍。
纸片扩散法。 肉汤稀释法。
•
一、常用抗菌药物敏感性试验与耐药 检测方法介绍
纸片扩散法（Kirby-Bauer test） 稀释法（dilution test） E试验法（E test） 联合药物敏感试验 特殊耐药菌及耐药酶的表型检测
11～12
≥13
—
≥15
13～14
≥15
14～22
≥23
15～20
≥21
11～15
≥16
wenku.baidu.com
相应MIC值 (μg/ml)
耐药
敏感
β-内酰胺酶 ≤0.12
≥4
≤2
—
≤4
≥8
≤4
≥8
≤0.5
≥4
≤0.5
≥8/152 ≤2/38
•
三、肉汤稀释法
原理：
以水解酪蛋白（MH）液体培养基将抗生素 做不同浓度的稀释，然后种入待检细菌，定 量测定抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓度（ MIC）或最低杀菌浓度（MBC）。
临床微生物学和微生物 学检验
2020年5月29日星期五
教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生 实验课时：4学时 课程类型：专业实验课 课程要求：必修 每组人数：2人
•
实验目的和要求
掌握纸片扩散法（K－B法）的原理、操作 方法等、结果判断、意义及质量控制；
熟悉肉汤稀释法抗生素敏感性试验的原理 、操作方法、结果判断及意义等；
耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的检测 β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶检测等
•
二、纸片扩散法（K-B法）
原理：
含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上 ，纸片所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断向纸片 周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓 度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
•
方法：
菌液制备：生理盐水校正测试菌和质控菌至 0.5麦氏比浊标准，再用MH肉汤稀释到 107CFU/ml；
加菌液：用微量加样器取0.1ml稀释菌液由低 到高加于各排试管中，其最终的接种量为 5×105 CFU/ml。测试菌排、测试菌生长对照 管加测试菌液；质控菌排、质控菌生长对照 管加质控菌液。
涂布接种：无菌棉拭蘸取菌液，在试管壁旋转挤去多 余菌液后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转 平板60º，最后沿平板内缘涂抹1周；
贴含药纸片：平板在室温下干燥3-5min，用无菌镊子 将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心相距应大于 24mm，纸片距平板内缘应大于15mm；
孵育：35ºC 16-18h，量取抑菌圈直径。
•
结果判读：
用刻度尺量取抑菌圈直径，根据CLSI（ Clinical and Laboratory Standards Institute ）标准判读结果；
报告：细菌对该抗生素是 敏感（susceptible，S）； 耐药（resistant，R）； 还是中介（intermediate，I）。
•
方法：
试管编号：取26只试管排成两排（测试菌排， 质控菌排）每排13支编号。另取3支试管，分别 标记上“肉汤对照”、“测试菌生长对照”和“质控 菌生长对照”等对照。
抗菌药物稀释：用MH肉汤倍比稀释抗菌药物至 13管，稀释后使每管含抗菌药物稀释液2ml。
肉汤对照、测试菌生长对照、质控菌生长对照 管：分别加入MH肉汤2ml。
•
•
•表1 金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验评价结果
抗菌药物
青霉素 苯唑西林 万古霉素 庆大霉素 红霉素 克林霉素 磺胺药
纸片含药量
10U 1μg 30μg 10μg 15μg 2μg 1.25/23.75μg
耐药 ≤28 ≤10 — ≤12 ≤13 ≤14 ≤10
抑菌圈直径(mm)
中介
敏感
—
≥29
孵育：35ºC 24h观察结果。
•
结果：
测试菌（或质控菌）不出现肉眼可见生长的 最低药物浓度为该药对测试菌（质控菌）的 MIC。
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•含药纸 片 •抑菌圈
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方法：
菌液制备：挑取孵育16-24h的血平板上数个菌落置于 生理盐水管中，校正浓度至0.5麦氏标准；
了解稀释法的质量控制。
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实验内容
常用抗菌药物敏感性试验与耐药检测 方法介绍。
纸片扩散法。 肉汤稀释法。
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一、常用抗菌药物敏感性试验与耐药 检测方法介绍
纸片扩散法（Kirby-Bauer test） 稀释法（dilution test） E试验法（E test） 联合药物敏感试验 特殊耐药菌及耐药酶的表型检测
11～12
≥13
—
≥15
13～14
≥15
14～22
≥23
15～20
≥21
11～15
≥16
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相应MIC值 (μg/ml)
耐药
敏感
β-内酰胺酶 ≤0.12
≥4
≤2
—
≤4
≥8
≤4
≥8
≤0.5
≥4
≤0.5
≥8/152 ≤2/38
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三、肉汤稀释法
原理：
以水解酪蛋白（MH）液体培养基将抗生素 做不同浓度的稀释，然后种入待检细菌，定 量测定抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓度（ MIC）或最低杀菌浓度（MBC）。
临床微生物学和微生物 学检验
2020年5月29日星期五
教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生 实验课时：4学时 课程类型：专业实验课 课程要求：必修 每组人数：2人
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实验目的和要求
掌握纸片扩散法（K－B法）的原理、操作 方法等、结果判断、意义及质量控制；
熟悉肉汤稀释法抗生素敏感性试验的原理 、操作方法、结果判断及意义等；
耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的检测 β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶检测等
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二、纸片扩散法（K-B法）
原理：
含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上 ，纸片所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断向纸片 周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓 度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
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方法：
菌液制备：生理盐水校正测试菌和质控菌至 0.5麦氏比浊标准，再用MH肉汤稀释到 107CFU/ml；
加菌液：用微量加样器取0.1ml稀释菌液由低 到高加于各排试管中，其最终的接种量为 5×105 CFU/ml。测试菌排、测试菌生长对照 管加测试菌液；质控菌排、质控菌生长对照 管加质控菌液。
涂布接种：无菌棉拭蘸取菌液，在试管壁旋转挤去多 余菌液后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转 平板60º，最后沿平板内缘涂抹1周；
贴含药纸片：平板在室温下干燥3-5min，用无菌镊子 将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心相距应大于 24mm，纸片距平板内缘应大于15mm；
孵育：35ºC 16-18h，量取抑菌圈直径。
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结果判读：
用刻度尺量取抑菌圈直径，根据CLSI（ Clinical and Laboratory Standards Institute ）标准判读结果；
报告：细菌对该抗生素是 敏感（susceptible，S）； 耐药（resistant，R）； 还是中介（intermediate，I）。
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方法：
试管编号：取26只试管排成两排（测试菌排， 质控菌排）每排13支编号。另取3支试管，分别 标记上“肉汤对照”、“测试菌生长对照”和“质控 菌生长对照”等对照。
抗菌药物稀释：用MH肉汤倍比稀释抗菌药物至 13管，稀释后使每管含抗菌药物稀释液2ml。
肉汤对照、测试菌生长对照、质控菌生长对照 管：分别加入MH肉汤2ml。
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•表1 金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验评价结果
抗菌药物
青霉素 苯唑西林 万古霉素 庆大霉素 红霉素 克林霉素 磺胺药
纸片含药量
10U 1μg 30μg 10μg 15μg 2μg 1.25/23.75μg
耐药 ≤28 ≤10 — ≤12 ≤13 ≤14 ≤10
抑菌圈直径(mm)
中介
敏感
—
≥29
孵育：35ºC 24h观察结果。
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结果：
测试菌（或质控菌）不出现肉眼可见生长的 最低药物浓度为该药对测试菌（质控菌）的 MIC。
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