原生质体制备
一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究
一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究
材料准备：
内生真菌菌株
无菌工作台和器具（如培养皿、显微镜片、移液器等）无菌培养基（如琼脂、乳糖酸钠琼脂培养基等）
无菌培养液（如培养基溶液）
去离子水或无菌PBS缓冲液
培养基制备：
根据内生真菌的要求配制适宜的无菌培养基。
煮沸溶液中加入琼脂，并搅拌至溶解。
转移至培养器并加盖，进行高压灭菌。
菌种处理：
在无菌条件下，将内生真菌分离出来。
用无菌培养液或去离子水洗涤菌株，去除杂质。
原生质体制备：
将清洗后的菌株转移到含有少量无菌培养液的培养皿中。
用显微镜检查，确保菌株没有受到污染。
在无菌条件下，用移液器将菌株转移到新的培养皿中。
将培养皿置于振荡器中，以帮助分离真菌的原生质体。
过一段时间后，观察原生质体的形成情况。
原生质体再生：
将形成的原生质体转移到含有适宜培养基的培养皿中。
在适宜的温度（一般为25-30摄氏度）下，进行培养。
定期观察并记录原生质体再生的过程。
根据需要，可以进行进一步的培养和分离。
原生质体的制备
原生质体的制备
目的要求
掌握植物原生质体的分离制备
技术，观察原生质体的形态。
实验原理
分离原生质体常采用酶解法。其原理是根据由
纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对
细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。 原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶 液的组成、以及原生质体收集方法有关。酶液通常 需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细
胞处于质壁分离状态，分离后不致膨胀破裂。渗透
剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。酶液中还 应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。游离出来
的原生质体可用过筛法收集。
实验用品
一、 材料
菠菜 二、器材
显微镜，擦镜纸，剪子，镊子，小平皿，吸管四 支，直式漏斗，300目尼龙网，10ml离心管，载 玻片，盖玻片。
三、试剂 1.洗涤液：甘露醇 0.6 M；CaCl2·2H2O 8 mM
NaH2PO4·H2O 2 Mm，pH 5.6
2.酶液：
实验方法
1、酶液的制备 2、材料准备 3、酶解
4、洗涤
观
察
纯 化 后 的 原 生 质 体
胚性愈伤组织亦是原生 质体分离的主要材料
思考题1、何为原生质体 Nhomakorabea2、分离得到的原生质体可有哪些用途？
3、为什么酶解材料时，酶解液要保持较 高的渗透压？
原生质体制备
原生质体的制备：1、选取3-4周长势良好的植株的展开叶片（通常选取第5~7片真叶）。
2、用新的锋利的刀子从叶片的中部切0.5-1 mm叶条，比较理想的情况下，每克新鲜叶片中大约含有107个原生质体（大约100-150个叶条在5-10 ml酶溶液中消化）。
对于常规实验，10-20个叶条消化在5-10 ml酶溶液中将得到0.5-1×106个原生质体，足够25-100个样品使用。
3、快速而温柔的转移叶条到准备好的酶溶液中（10-20叶条在5-10 ml酶液中），用平头镊子将叶条完全淹没。
4、用真空泵将叶条在黑暗中真空30 min。
5、室温下在黑暗中至少消化3 h（继续消化，不要摇晃）。
经过轻微转动后酶溶液应该变成绿色，这表明原生质体已经被释放。
6、用显微镜检查原生质体的释放（拟南芥叶肉的原生质体的大小大约为30-50μm）。
7、用等体积的W5溶液稀释酶溶液，通过过滤去除没有消化的叶片组织。
8、用水洗去75 μm尼龙过滤器中的酒精（通常浸泡在95%乙醇中）并去除过量的水，用W5溶液润洗过滤器后过滤原生质体。
9、将原生质体溶液转移到30 mL圆底离心管中，100×g离心5 min，尽可能的去除上清液。
10、用计数板进行细胞计数，每2×105个原生质体加入1 mL W5溶液，在冰，上静置30 min。
11、室温下沉降原生质体15 min，去除W5溶液，每2×105个原生质体加入1 mL MMG溶液重悬浮。
12、在2 mL离心管中分别加入10 mL DNA（5-10 kb的质粒DNA 10-20 mg）和100 mL原生质体（2×104个原生质体细胞），轻轻混匀。
13、加入110 mL PEG溶液，轻弹试管完全混匀。
14、室温下孵育转染混合物15 min（反应5 min足够）。
15、室温下，用400-440 mL W5溶液稀释转染混合物，轻轻摇动或倒置离心管混匀来停止转染过程。
原生质体的制备
原生质体的制备
稳渗剂：0.6 mol/L甘露醇，121 ℃高温高压灭菌20 min后备用。
2%溶壁酶：在无菌操作台中称取溶壁酶（广东省微生物研究所生产），加入灭菌过的稳渗剂（甘露醇0.6 mol/L），最终使酶液浓度达到2%，再用0.22 µm 滤膜过滤除菌待用。
（观察锁状联合）乳酸石炭酸棉蓝染色液：石炭酸10 g，棉蓝0.02 g，甘油20 mL，乳酸10 mL，蒸馏水10 mL，将石炭酸加入蒸馏水中加热融化，之后加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，溶解备用。
原生质体制备
(1)将杏鲍菇菌丝接种于固体PDA培养基中，25℃培养5-7 d。
(2)活化后的菌丝接入液体PDA培养基中，25℃，120 rmp摇床培养5-6 d。
(3)将菌丝球倒入50 mL离心管中，10000 rpm 离心10 min，倒去上清液，再用无菌水、甘露醇各离心清洗一次。
(4)用灭菌滤纸吸干菌丝水分，称取0.2 g 菌丝放入10 ml 离心管中，再加入2 mL 2％浓度的溶壁酶，30℃水浴2-2.5 h，每隔1 h镜检破壁情况。
(5) 加入6mL甘露醇混匀，终止酶解。
800 rpm离心5 min，用移液枪小心转移上清酶液至新的10毫升离心管，再用0.6 mol/L甘露醇离心离心清洗一次（4000 rpm，15 min），液体再生培养基离心清洗一次（4000 rpm，15 min）。
植物原生质体的制备原理
植物原生质体的制备原理
植物原生质体的制备原理是利用生物学方法将植物细胞的质膜和细胞壁打破，使得细胞质与细胞器分离，获得纯净的细胞质。
具体制备原理如下：
1. 选择新鲜的植物组织，例如嫩叶片、根尖等，并将其切碎。
2. 将切碎的组织置于适当的缓冲液中，缓冲液中含有维持细胞渗透压的某些成分，如蔗糖。
3. 经过一定时间的培养，细胞内的质膜和细胞壁会被渗透液逐渐分解，从而使细胞质暴露在外。
4. 使用过滤纸或细孔滤网将悬浊液过滤，以去除细胞壁碎片和其他杂质。
5. 对滤液进行离心，以分离更纯净的细胞质。
6. 最后，将分离得到的细胞质保存在低温条件下，或进行后续的实验操作。
通过上述步骤，就可以制备得到植物原生质体，供后续的生物学研究和实验使用。
细胞原生质体的制备
细胞原生质体的制备细胞原生质体的制备—植物原生质体分离和活性鉴定一、实验目的1.学习植物细胞原生质体分离纯化的方法。
2.了解原生质体活性鉴定的原理。
3.了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理及其过程二、实验原理去掉植物细胞壁的方法可以是机械的人工操作，也可以利用酶解法。
较早利用机械法制备原生质体的酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。
由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜，必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。
其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。
测定原生质体的活性有多种方法。
荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法，FAD 本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质膜。
一旦进入原生质体后，由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。
它不能自由出入原生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光，无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。
PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质体融合得以完成。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca 高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。
原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。
原生质体制备的原理
原生质体制备的原理原生质体啊，简单来说，就是把植物或者微生物细胞外面那层细胞壁给去掉之后剩下的部分。
那为啥要去掉细胞壁来制备原生质体呢？这就像给细胞做了个“脱壳手术”，让细胞变得更“赤裸裸”，这样就方便我们对细胞进行各种研究啦。
对于植物细胞来说，细胞壁是由纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的。
就像一个坚固的小房子，把细胞里的原生质给围在里面。
那怎么把这“小房子”拆掉呢？这就用到了一些特殊的酶。
比如说纤维素酶，它就像一个小小的拆迁队队员，专门针对细胞壁里的纤维素，把纤维素的化学键给切断。
还有果胶酶呢，它也没闲着，负责把果胶分解掉。
这俩酶就这么齐心协力，一点一点地把细胞壁给瓦解掉，原生质体就被释放出来啦。
微生物细胞也类似哦。
不过微生物的细胞壁成分和植物不太一样。
像细菌的细胞壁有肽聚糖，这时候就需要用溶菌酶这样的酶来对付它。
溶菌酶就像一个精准的小剪刀，找到肽聚糖里合适的地方，“咔嚓”一下剪断化学键，细胞壁就开始破掉啦。
原生质体的制备啊，还有很多小讲究呢。
比如说酶的浓度很重要。
如果酶的浓度太低，就像拆迁队的人手不够，拆细胞壁拆得慢吞吞的，效率特别低。
可要是酶的浓度太高呢，就有点像一群莽撞的工人，可能会对原生质体本身造成伤害，把原生质体里面的一些重要结构也给破坏掉了，这可就不好了。
温度也是个关键因素。
就像人干活的时候，温度合适干活才舒服。
对于酶来说也是一样的，不同的酶有它最适宜的工作温度。
在这个温度下，酶的活性最高，拆细胞壁的速度最快，效果也最好。
要是温度不合适，酶可能就会偷懒，不好好干活啦。
而且啊，制备原生质体的时候，还得注意渗透压。
细胞里面是有一定渗透压的，当把细胞壁去掉之后，如果外面的渗透压不合适，原生质体就会像一个被捏扁或者胀大的气球一样。
要是外面的溶液浓度太高，原生质体里的水就会被吸出去，原生质体就会皱缩起来；要是外面溶液浓度太低，水就会大量涌进原生质体，原生质体就可能会胀破。
所以得找到合适的渗透压条件，让原生质体能够舒舒服服地待着。
植物原生质体的制备及融合
显微镜、低速台式离心机、水浴锅；直式漏斗、离心管；眼科镊等
▪ 试剂
洗涤液 混合酶液 PEG溶液 高钙高pH溶液 20%蔗糖溶液等
原生质体的分离制备
▪ 取新鲜花瓣，以蒸馏水清洗，用吸水纸吸干多余水分。 ▪ 用尖头镊剥取材料的下表皮（带有红色的叶肉细胞），将
下表皮创面朝下浸在酶液中，27℃酶解1hr（振荡）。
▪ 所用小平皿、离心管、漏斗、小镊子等自来水 冲洗并以蒸馏水洗干净后，控干
▪ 托盘及其中的其他物品用自来水冲洗干净
▪ 实验中
植物原生质体的 制备及融合
背景
▪ 原生质体分离 ▪ 细胞融合
▪ 病毒诱导融合（动物细胞） ▪ PEG诱导融合 ▪ 电融合
背景
▪ 融合过程
▪ 细胞的接触 ▪ 细胞质膜的融合 ▪ 细胞质的融合 ▪ 遗传物质的选择（异核体的核融合）
应用
▪ 杂交育种
▪ 单克隆抗体技术
实验器材、试剂等
▪ 材料
剑兰（唐菖蒲）花瓣
原生质体的分离制备
镜检，0 μm
50 μm
原生质体的分离制备
▪ 过滤，以去除大块组织。 ▪ 700rpm离心5分钟，弃上清。 ▪ 加入3mL洗涤液吹打均匀，700rpm离心5分钟，弃上清。 ▪ 加入少量洗涤液（一两百微升即可或由原生质体的量来决
定），悬浮原生质体。 ▪ 镜检，如果碎片较多，可采取蔗糖漂浮方法去除碎片。
▪ 比较分析实验组与对照组之间的差异及 原因
▪ 思考：原生质体制备和融合过程中各种 试剂的渗透压？
提醒
▪ 蔗糖漂浮
▪ 务必留下足够进行融合的细胞悬液 ▪ 使用5ml离心管 ▪ 配平
▪ 35mm dish用于酶解，60mm dish用于融合观察
植物细胞原生质体的制备与融合
植物细胞原生质体的制备与融合。
1、相关概念：（1）原生质体：是指那些已去除全部细胞壁的细胞。
细胞外仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定。
此外，在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体称为原生质球或球状体。
（2）原生质体融合：即体细胞杂交。
用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植株的整个过程。
若取材为体细胞，则成为体细胞杂交。
2、原生质体的制备：在植物组织里，原生质体被坚硬的细胞壁包裹着，而且由于果胶质等使细胞相互紧紧粘连在一起。
在愈伤组织中，这种粘连相对松些；在细胞悬浮培养物中，只有存在细胞团的情况下，有轻度的粘连。
如果破除这种粘连作用，即可使细胞分离开来，进一步去除细胞壁，就能使裸露的原生质体游离出来。
游离效率的高低主要与植物材料和酶混合浓的组成有关。
基本程序如下：取材→除菌→酶解（加酶、渗透压稳定剂）→原生质体的收集与纯化→洗涤→原生质体活力的测定。
（1）取材与除菌：原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。
但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣。
因为，由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。
常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。
对外植体的除菌要因材而异，悬浮培养细胞一般无需除菌。
对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗2-3次，然后浸入70%酒精消毒后，再放进3%次氯酸钠处理。
最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。
（2）酶解：现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。
①配制酶解反应液:反应液应是一种pH值在5.5-5.8的缓冲液，内含纤维素酶0.3%-3.0%以及渗透压稳定剂，细胞膜保护剂和表面活性剂等。
③酶解：除菌绿。
反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。
经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。
真菌原生质体制备技术
真菌原生质体制备技术
1．灭菌物品：
（1）大滤纸:
（2）灭菌针筒（含脱脂棉和玻璃钎维）
（3）脱脂棉
（4）离心管
（5）无菌ddH2O
（6） 0.6M MgSO4
（7）培养基：
A. 等渗培养基（RCM）：麦芽汁1%，酵母膏1%，蛋白胨0.4%，葡萄糖0.4%，pH自然，用0.6M蔗糖配制。
B. 破膜培养基：麦芽汁1%，酵母膏1%，蛋白胨0.4%，葡萄糖0.4%，pH自然，用水配制。
也可以采用含有0.6M蔗糖的PDA作为等渗培养基，破膜培养基不加0.6M蔗糖即可。
（8）溶壁酶酶液：1.5%，用0.6MMgSO4配制，过滤除菌；
（9）培养皿：根据样品个数
2．制备方法：
（1）称取离心管重量并记录；
（2）用接种针挑出菌丝，并用灭菌双蒸水冲洗一次，然后用无菌的0.6M MgSO4冲洗两次，用灭菌的滤纸吸干，放入已知重量的离心管，称重并记录；
（3）计算得到菌丝重量，按0.2（g）：1(mL)加入灭菌酶液，震荡均匀；
（4） 28℃，3~4小时，摇床震荡（轻微），酶解，同时每30min镜检观察原生质体数量；
（5）灭菌注射器（含脱脂棉和玻璃钎维）过滤；
（6）离心：2500rpm,2min
（7）用0.6M MgSO4洗涤沉淀3次；
（8）用用0.6M MgSO4定容至最初的加酶量；
（9）镜检计数；记录；
（10）涂板后再生培养，第7天后每隔1天计数一次。
原生质体制备和转化
将制备好的原生质体溶液3200r/min，4℃离 心10min；
经四层无菌镜头纸过滤，制成孢子浓度约为107个/mL的单 孢子悬浮液
将上述制得的孢子悬浮液每1mL接种于一瓶盛有50mL菌丝 培养基的三角瓶中，于30℃静止培养23~25h
6000r/min，离心10min收集幼嫩的菌丝体 用无菌水洗涤菌丝体，4000r/min，离心5min收集菌丝体
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弃上清，沉淀重悬于预冷的STC溶液中，将原 生质体浓度调整为5×106 ~ 5×107个细胞 /mL；
将约2~5µg质粒DNA(体积不超过10µL)与 100µL米曲霉原生质体置冰上轻轻混匀；
加入25µL PTC溶液，冰浴20min；
加入1 mL PTC溶液，室温放置15min；
最后加入2mL STC溶液，混匀。
文献汇报
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汇报人姓名
培养基成分 高渗溶液（有机/无机）
缓冲液的pH（5.8-7.4） 酶解条件（时间/各种酶的比例）
酶液用高盐还是高渗缓冲液配 擦镜纸收集菌丝体or离心收集菌丝体
双层or单层培养基
高渗缓冲液：
《微生物学实验教程》 周德庆（酵母）
1、接种于液体培养基上培养。
高渗缓冲液：
蔗糖0.5mol/L, MgCl2 10mmol/L,Tris-HCl(pH 7.4) 10mmol/L
2、取培养液10ml，4000r/min离心5min, 弃上清液，用TrisHCl(pH 7.4)、0.5mol/LEDTA、高渗缓冲液各洗涤一次。
2 植物原生质体制备
实验二、植物原生质体制备
实验二、植物原生质体制备
1 材料与方法
1.1 材料
前一周培养的海藻籽发芽嫩叶及实验室准备的百合或者大花萱草花瓣。
实验在北京市北京科技大学理化楼120进行。
1.2 方法
1.2.1 试剂配制
将0.6mM 甘露醇、8m MCaCl2、7mM NaH2PO4•H2O、3mM MES加于干净的锥形瓶中，调节pH至5.6，配制成原生质体分离的母液。
在对实验材料进行酶解前，加入1.0%纤维素酶及0.6%离析酶。
去离子水处理材料作为对照。
1.2.2 材料酶解及观察
先将幼嫩的海藻叶片取下至小培养皿中，并尽量剪碎；用镊子尖头撕去花瓣表皮，另一小培养皿中尽量剪碎花肉。
取1ml加入酶的母液于离心管中，取少许剪碎的实验材料在室温下摇床振荡（40rpm）酶解2小时，每隔30min取少许溶液制片，显微镜观察原生质体的细胞形态并拍照（要注明放大倍数，以目镜×物镜倍数表示，如10×40）。
同时进行对照的观察，注意与对照进行比较。
2 结果与讨论
1。
酶解法制备植物原生质体
实验题目：酶解法制备植物原生质体1、摘要：植物原生质体：是指脱去细胞壁只留细胞膜包裹的细胞。
因其无细胞壁障碍，是进行细胞工程遗传操作和植物育种的良好材料。
原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的原生质体，它保持原细胞的一切活性。
2、实验原理：植物细胞壁的主要成分为纤维素，细胞间质则主要为果胶质。
因此，用含有相关酶的复合酶液处理植物组织，可破坏植物细胞之间的果胶质使细胞从组织中游离，并破坏细胞壁使原生质体得以释放。
因游离原生质体和其他组织成分存在密度差异，可利用蔗糖等密度介质对其进一步纯化。
3、实验材料和用品：新鲜青菜或水培一周的绿豆幼苗；9cm 平皿；镊子；解剖刀；10mL 刻度离心管；载玻片；托盘天平；40mL 小烧杯；吸管；200 目细胞过滤器；1mL 枪及枪头；70%乙醇；3%次氯酸钠；复合酶液；原生质体洗液；原生质体漂浮液；10µg/mL 荧光素二醋酸酯（FDA）（棕色瓶）；恒温摇床；离心机。
4、实验操作：取材——材料消毒——材料分割——酶解——收集细胞——漂浮法纯化原生质体——洗涤原生质体——制片检查纯化效果——FDA 染色检测原生质体活力具体操作细节如下：（1）取材：分别称取 1g 青菜叶柄、青菜叶和绿豆茎放入9cm 平皿内，用酒精棉球消毒平皿外部后将其转入超净工作台。
（2）材料消毒：先放入75%酒精中消毒 30 秒；无菌水洗 3 次；再放入次氯酸钠溶液中消毒 15min；无菌水洗 3 次。
（3）材料分割：将材料转入预先放有消毒载玻片的灭菌 9cm 平皿中，用消毒解剖刀将材料划切成0.5~1mm 宽的细条。
（4）酶解：取出载玻片，加入 20~25mL 复合酶液覆盖材料；将平皿转入恒温摇床；设定摇床温度为 25℃、转速为60r/min；启动酶解。
（5）检查酶解效果：酶解 2 h 后，每隔 1h 将平皿移入超净台，用吸管反复吹打酶解液使细胞脱落；制备装片显微观察酶解效果，可看到大量带有细胞壁、形态不规则的完整细胞和一些无细胞壁、基本呈圆球形的原生质体；至有较多原生质体游离出来，并随酶解时间延长不再明显增加时，终止酶解。
原生质体制备试剂
原生质体制备试剂原生质体是一种无细胞壁的细胞结构，广泛存在于植物和动物细胞中。
由于其具有高度可溶性和膜通透性的特性，原生质体常被用于制备各种试剂。
本文将介绍原生质体制备试剂的方法和应用。
一、原生质体制备方法1. 细胞裂解法：将植物或动物组织加入裂解缓冲液中，通过机械方法（如超声波破碎、搅拌等）或化学方法（如酶解、酸碱处理等）使细胞壁破裂，释放出原生质体。
2. 离心法：将植物或动物组织进行离心分离，分离出含有原生质体的上清液。
3. 渗透法：通过调节渗透压使细胞膜溶胀，从而释放出原生质体。
4. 超滤法：利用超滤膜对细胞组织进行过滤，将原生质体截留在滤液中。
5. 分离培养法：通过细胞培养技术，将细胞分离培养，使原生质体在培养基中自由生长。
1. 酶活性测定：原生质体中含有多种酶，可以用于测定酶的活性。
例如，通过测定原生质体中过氧化物酶的活性，可以评估细胞氧化应激水平。
2. 蛋白质分析：原生质体中富含蛋白质，可以用于蛋白质的纯化和分析。
例如，可以通过原生质体制备试剂提取植物叶片中的叶绿素结合蛋白。
3. 药物筛选：原生质体可以用于药物的筛选和评估。
例如，通过测定原生质体对某种药物的敏感性，可以评估药物的毒性和疗效。
4. 细胞生物学研究：原生质体可以用于细胞生物学研究中的多个方面，如细胞分裂、细胞运动等。
例如，通过观察原生质体在不同条件下的形态变化，可以研究细胞的运动机制。
5. 基因工程：原生质体可以用于基因工程中的多个方面，如基因转染、基因表达等。
例如，可以利用原生质体制备试剂将外源基因导入植物细胞，实现基因的转染。
三、原生质体制备试剂的优势1. 高度可溶性：原生质体中的物质具有高度可溶性，便于提取和分析。
2. 膜通透性：原生质体的细胞膜具有较好的通透性，便于物质的进出。
3. 多功能性：原生质体中含有多种生物大分子，如蛋白质、核酸等，适用于多个领域的研究。
4. 细胞完整性：原生质体制备试剂可以保持细胞的完整性，不会破坏细胞内部结构。
BY-2原生质体制备及转染
BY-2细胞原生质体的制备1、继代培养3天的BY-2细胞悬浮液100ml2、分装在两个50ml的离心管中3、放置在冰上至细胞沉淀到离心管底部4、将上清液移除5、分别向两离心管中加入50ml细胞壁裂解酶液6、将混合液移入145/20mm的大培养皿中7、30℃, 60rpm旋转暗培养3h8、将溶液分别转移到两个50ml的离心管中9、145g离心4min10、移去上清11、加入20ml洗涤液12、重复9-11，洗涤三次13、将沉淀悬浮在20mlMaMg溶液中。
试剂配方：1、细胞壁裂解酶液：1%纤维素酶，0.1%果胶酶，0.4M甘露醇，5mM MES PH 5.7 ，过滤灭菌。
2、洗涤液：0.4M甘露醇，2.5mM CaCl2,1mM MES PH 5.73、MaMg：0.4M甘露醇，15mM MgCl2，5mM MES PH 5.7PEG介导BY-2的转染方法1、所有操作在23℃环境完成2、向离心管中加入10μl DNA（10-20μg质粒DNA）3、加入100μl原生质体（2×104原生质体）轻轻混匀4、加入110μl PEG/Ca混合液，混匀5、23℃孵育5—30min (根据实验情况自己掌握确定)6、加入0.44mlW5混合液，轻轻混匀7、医用离心机#3档（大约800rmp）离心1min，移去PEG8、轻轻悬浮起原生质体，混匀成100μl ，加入1ml W1或W5（六孔板加W5）9、用于蛋白表达标记需培养2—16h 原生质体量在104-105，转染效率在50-90%10、成熟的原生质体可以100g离心2min，移去上清，冻凝后放-80℃待用。
试剂配方：○1、PEG Solution (40% V/V)4g PEG4000(Pluka #81240) ,3ml H2O,2.5ml 0.8M甘露醇，1ml 1M Ca(NO3)2或CaCl2○2、W1：0.5M 甘露醇，4mM MES PH 5.7,20mM KCl○3、W5:154mM NaCl 125mM CaCl2 , 5mM KCl , 2mM MES PH 5.7不含糖。
细菌原生质体的制备
细菌原生质体的制备要求：1、写出完整的原生质体的制备的实验操作步骤2、写出分离培养基及相关试剂所需的量、仪器和器皿所需的数量。
说明：通过实验一获得出发菌（细菌）之后，第二周再对该菌进行诱变，第三周再进行该菌的碳源谱、及抗药性测定（链霉素或青霉素），第四周再制备原生质体。
培养基与试剂(1) 分离培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中再加入15g琼脂粉pH调至7.2121℃灭菌15min待冷却至50℃左右时于超净工作台倒平板。
注:先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状再加到溶化好的培养基中调匀; (2) 分离培养基液体培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉,即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中pH调至7.2,121℃灭菌15min。
(3) 检测试剂,路戈氏碘液,碘片1g,碘化钾2g,蒸馏水300mL。
配制方法:先用少量35mL蒸馏水溶解碘化钾,再加入碘片,待碘片完全溶解后,加水稀释至300mL于棕色瓶内备用.实验方法: 1. 微生物的分离; 用梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌。
取所采的土样5g加入到三角瓶中,加入无菌水45mL,30℃摇床振荡30min制成土壤悬液,此时的稀释度为10-1。
另取7支试管分别记作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8个梯度每支试管内加入9mL无菌水。
用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液加入到10-2试管中混匀,再从此试管中吸取1mL加入到10-2试管中,依此类推直至10-7试管。
分别从10-6、10-7、10-8三个稀释度的试管中吸取100uL悬液,均匀涂布于分离培养基平板上,于30℃培养36h等长出菌落后,将检测试剂卢戈氏碘液加入到平板中,菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株,因淀粉遇碘变蓝色,如菌落周围有无色圈说明该菌能分解淀粉。
《原生质体的制备》课件
选取动物组织
选择健康的动物组织作为制备 原生质体的材料。
酶解消化
将动物组织放入酶液中，在适 宜的温度和pH条件下进行酶 解消化。
洗涤和保存
清洗原生质体去除残留的酶液 和其他杂质，然后进行保存备 用。
微生物原生质体制备的步骤
选取微生物菌株
选择生长旺盛、无污 染的微生物菌株作为 制备原生质体的材料 。
成功案例2
在蓝细菌原生质体制备实验中，通过选择合适的酶种类和浓度，以及优化酶解和再生过程，成功制备 出可用于遗传转化实验的原生质体。
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实验过程中的注意事项
1 操作规范
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
2 酶液处理
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
3 离心条件
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
4 温度控制
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
实验后的处理事项
02
原生质体制备的实验材料
植物细胞原生质体制备所需的材料
酶
用于分解细胞壁，常用的酶包括 纤维素酶、果胶酶和离析酶等。
渗透压稳定剂
用于保持原生质体的稳定形态， 常用的渗透压稳定剂包括甘露醇 、山梨醇等。
01
植物组织
用于制备原生质体的材料，通常 选用幼嫩的叶片、茎段或根尖等 部位。
02
03
缓冲液
用于维持细胞内的酸碱平衡，常 用的缓冲液包括Tris-HCl和MES 等。
微生物原生质体制备所需的材料
微生物菌落
用于制备原生质体的材料，可以根据 实验需求选择不同的微生物菌落。
酶
用于分解细胞壁，常用的酶包括溶菌 酶、蜗牛酶等。
原生质体的制备
原生质体的制备一、原生质体是什么呢？嗨，小伙伴们！今天咱们来唠唠原生质体的制备。
原生质体啊，就像是细胞的一个小核心部分，它把细胞壁给去掉了，只剩下细胞膜包裹着里面的细胞质和细胞核这些东西呢。
想象一下，就好像给细胞做了个小手术，把外面那层“衣服”（细胞壁）脱掉啦。
这原生质体在很多科学研究里可都是超级重要的呢。
二、原生质体的制备原料要制备原生质体，咱们得先选好原料呀。
一般呢，植物细胞是比较常见的制备原生质体的原料。
不过呢，这植物细胞也不是随便选的哦。
得找那些细胞状态比较好的，就像是挑水果一样，要挑那种新鲜又健康的。
比如说一些嫩叶细胞就比较合适，它们的细胞壁相对薄一些，就比较好处理啦。
当然啦，除了植物细胞，微生物细胞有时候也能用来制备原生质体，不过这就更复杂一些啦。
三、原生质体的制备方法那具体怎么制备原生质体呢？这可有点小复杂呢。
首先得有一种东西能把细胞壁给溶解掉，这个东西就叫酶啦。
就像是用魔法药水把细胞壁这个小城堡的城墙给融化掉一样。
一般会用到纤维素酶和果胶酶，这两种酶就像是一对小搭档，纤维素酶负责分解纤维素，果胶酶负责分解果胶，这样细胞壁就慢慢消失啦。
然后呢，我们还得控制好环境条件。
温度得刚刚好，不能太热也不能太冷，就像我们人感觉最舒服的温度那样，大概25℃到30℃就挺合适的。
还有溶液的酸碱度也很重要呢，pH值一般在5.5到6.5左右比较好。
要是这些条件没控制好，那原生质体可能就制备不出来啦，或者质量不好。
四、原生质体的分离当细胞壁被溶解掉之后呢，原生质体就和其他的细胞碎片混在一起啦，这时候就得把原生质体给分离出来。
可以用过滤的方法，就像我们泡茶的时候用滤网把茶叶渣给过滤掉一样。
用那种很细的滤网，把那些大的细胞碎片给挡住，让原生质体流过去。
还有一种方法就是离心啦，把混合液放在离心机里转一转，原生质体就会因为重量的不同和其他的东西分开啦。
五、原生质体的纯化分离出来的原生质体可能还不是特别纯呢，里面可能还混着一些酶或者其他的杂质。
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1.影响原生质体数量和活力的因素
（1）细胞壁降解酶的种类和组合
不同植物种类或同一植物种的不同器官以及它们的培养细胞，由于它们的细胞壁结构组成不同，分解细胞壁所需的酶类也不同。
例如，叶片及其培养细胞用纤维素酶和果胶酶，根尖细胞以果胶酶为主附加纤维素酶或粗制纤维素酶（Driselase酶），花粉母细胞和四分体期小孢子用蜗牛酶和胼胝质酶，成熟花粉用果胶酶和纤维素醇。
（2）渗造压稳定剂
用酶法降解细胞壁前，为防止原生质体的破坏，一般需先用高渗液处理细胞，使细胞处于微弱的质壁分离状态，有利于完整原生质体的释放。
这种高渗液称为渗透压稳定剂。
常用的滲透压稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类（KCI、MgSO4.7H2O）等。
在降解细胞壁时，渗透压稳定剂往往和酶制剂混合使用。
滲透压稳定剂中，用得最多的是甘露醇，常用于烟草、胡萝ト、柑橘、蚕豆原生质体制备；蔗糖常用于烟草、月季等；山梨醇常用于油菜原生质体制备。
滲透压稳定剂种类及浓度的选择应根据植物种类而异，例如胡萝ト用0.56mol ／L甘露醇，月季用14％蔗糖，柑橘用0.8mol／L甘露醇，蚕豆用0.7mol／L甘露醇，烟草的四分体用7％熊糖，烟草的成熟花粉用13％甘露醇。
（3）质膜稳定剂
质膜稳定剂可以增加完整原生质体数量、防止质膜破坏，促进原生质体胞壁再生和细胞分裂形成细胞团。
如在分离烟草原生质体时，在酶液中加人入葡聚糖硫酸钾，一旦洗净确液进行培养，原生质体很快长壁并持续细胞分裂形成细胞团。
而未加葡聚糖硫酸钾的对照，原生质体经一周培养即解体。
常用的原生质膜稳定剂有葡聚糖硫酸钾、MES、氯化钙、磷酸二氢钾等。
（4）pH的影响
分离原生质体时，酶液的pH是值得注意的问题。
因为降解酶的活力和细胞活力最适pH是不一致的低pH时（＜4.5），酶的活力强，原生质体分离速度快，但细胞活力差，破坏的细胞较多；pH偏高时，酶活力差，原生质体分离速度慢，完整的原生质体数目较多。
分离原生质体时，酶液的pH因植物种类不同而有差异，如胡萝ト为5.5、月季为5.5～6.0、烟草为5.4～5.8、柑橘为5.6、蚕豆为5.6～5.7。
（5）温度影响
制备生质体时，一般在26土1℃条件下酶解。
（6）植物材料的生理状态
一般应选择植物体细胞分裂旺盛的部分进行取材。
采用那些颗粒细小、疏松易碎的胚性愈伤组织和由其建立的胚性悬浮细胞系，更容易获得高质量的原生质体。
要得到良好的供体材料，必要时应对材料进行预处理及预培养。
2.植物原生质体的纯化
材料经过一段时间的酶解后，需要将酶解混合物中破碎的原生质体、未去壁的细胞、细胞器及其他碎片去除出去。
纯化原生质体的常用方法有过滤、离心、飘浮法，在实际操作中一般联合运用这三种方法。
1）过滤法用滤网过滤酶解混合物，滤去未被酶解的细胞、细胞团及组织块
2）离心法利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于离心管底部。
3）飘浮法采用比原生质体比重大的高渗溶液（如蔗糖、Ficoll溶液），使原生质体漂浮在溶液表面。