基因工程常用工具酶及应用知识讲解
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22
限制性核酸内切酶的反应条件
• 各种限制性核酸内切酶反应条件相似，主 要区别是对盐浓度的需求不同。据此可分 为三组
• 低盐组 0～50mmol/L NaCl • 中盐组 50～100mmol/L NaCl • 高盐组 100～150mmol/L NaCl
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限制性核酸内切酶的星号活性
当酶切条件发生变化时，限制性 核酸内切酶的专一性可能会降低，导 致同种酶识别多种序列，这种现象称 作限制性核酸内切酶的星号活性。
• 一般说来，在DNA分子中，识别序列短的 出现概率大，识别序列长的出现概率小。 有N个核苷酸的识别序列出现概率为1/4n。 如识别4个核苷酸Sau 3A，则间隔256 （4×4×4×4）个核苷酸就有一次机会出 现识别位点。如识别8个核苷酸的Not I，则 需间隔65536个核苷酸才有一次机会出现识 别位点。
28
5′CCGATA-OH 3′ 3′GGC
3
“分子剪刀”的发现者
4
第一节 限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease，RE) 是由细菌自己产生的一种能识别双链 DNA中的特定序列，并以内切方式水解
核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。
5
在细菌体内，这种内切酶可以分 解外源性的DNA物质，例如病毒等； 而细菌本身的DNA同一识别序列中的 某些碱基被甲基化所保护。这种细菌 内部的限制与修饰作用分别由核酸内 切酶和甲基化酶完成，构成了类似免 疫的防御系统。
EcoRI PstI HpaI
5' -G AATTC- 3' 3' -CTTAA G- 5'
5' -CTGCA G- 3' 3' -G ACGTC- 5'
5' -GTT AAC- 3' 3' -CAA TTG- 5'
5' sticky end 5'粘末端
3' sticky end 3'粘末端
blunt end 平末端
Ⅰ类和Ⅲ类限制性核酸内切酶同时具有内切 活性和甲基化修饰活性，且识别位点复杂， 特异性差，不适用于基因工程。
8
一.限制性内切酶的命名
• Hind Ⅲ H in
dⅢ
细 菌 属 名
的 第
前细 两菌 个种 字名 母的
细 菌 菌 株 的 第
现同 的一 第菌 三株
一
一 种中
个
个 酶发
字
字
母
母
9
• EcoRI E co R I
24
例如 EcoR I在正常条件下识别GAATTC,但 在低盐（小于50mmol/L)、高pH（大于8）、 甘油大量存在时，识别序列增加了AAATTC、 GAGTTC,导致EcoR I在DNA分子上的切割 位点大大增加。
25
第二节 其他工具酶
一.DNA聚合酶 作用: 依据模版,连接游离的单核苷酸,形成与
模版互补的新链。
26
1.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 该酶具有三种酶活性 5’→3’ DNA聚合活性 3’→5’ 外切酶活性 识别切除错配的核苷酸 5’→3’ DNA外切酶活性
27
5′CCGATA-OH 3′ 3′GGCTATCGGA
dNTP DNA聚合酶Ⅰ
5′CCGATAGCCT 3′ 3′GGCTATCGGA 5’→3’ DNA聚合酶活性
14
四.识别位点与切割方式
• 限制性内切酶识别序列一般为6个核苷酸，如 EcoRI，HindIII，BamHI，居多数。 也有少数限制性内切酶，识别序列为4个、5个、 或更多的核苷酸如8个及8个以上，当识别序列核 苷酸数为单数时，则以中间的核苷酸作为对称轴。 如GTNAC（N 代表四种核苷酸）。
15
18
同尾酶：两种酶识别不同的顺序，但切割 产生的粘末端相同，叫做同尾酶。
同尾酶产生的粘末端，可通过碱基互补连 接，形成的位点称为“杂种位点”，该位 点不能再被原来的两种酶切割。
19
例：AGATCT TCTAGA
Bgl Ⅱ源自文库
GGATCC CCTAGG
BamH Ⅰ
A TCTAG
GATCC G
连接酶
AGATCC TCTAGG
6
解释 何谓内切酶 -o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o红色为外切酶的作用位点， 蓝色为内切酶的作用位点
7
限制性核酸内切酶的分类
目前已发现的限制性核酸内切酶600余种，可 分为三大类。
Ⅱ类限制性核酸内切酶广泛用于基因工程； 特点：识别切割位点比较专一，只有切割 作用。无甲基化修饰作用。
细 菌 属 名
的 第
前细 两菌 个种 字名
母的
该 酶 的 基 因
位
第该 一菌 种株 内发
一
于 切现
个
R
酶的
字
质
母
粒
上
10
11
二. II型限制酶的识别特点
• 识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序的固 定位置切割，识别顺序为回文结构。 （Palindrome）
客上天然居 居然天上客
12
13
三. 限制性内切酶的切割方式
20
• 同位酶:识别相同的序列,但切割位点不同.
• 同裂酶: 又称异源同工酶，来源不同,但识
别位点和切割位点相同.
切割位点也可以不同，例如Sam I(CCC↓GGG)和 Xma I(C↓CCGGG)
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五.限制性内切酶的反应条件
• 反应温度 一般为37oC • 反应体积20µl • DNA含量 0.5－1µg • 酶含量 1－2u • DNA纯度：OD260/280nm>1.7 • 阳离子 Mg2+ • 反应时间 1-1.5h • pH7.5
16
稀切酶：有些酶的识别位点在核苷酸序列中 出现的几率很小，可称为稀切酶。 为了获得大的DNA片段，需用稀切酶切割。
个别限制性内切酶可识别两种以上的核苷酸 序列，如Acc I既可识别GTATAC，又可识 别GTCGAC。
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• 位点偏爱：限制性内切酶识别序列两侧的 核苷酸组成与酶切效率有关，比如Nae I在 pBR322质粒上有4个识别位点，其中两个 位点可迅速被Nae I切割。第三个位点稍慢。 而位于1285处的第四个识别序列，切割的 效率只有其他位点的1/15。
第四章
基因工程的工具酶 及其应用
1
TOOLS FOR GENE CLONING SCISSORS: RESTRICTION ENZYMES
GLUE: DNA LIGASE VEHICLE: PLASMID OR VIRAL VECTORS
2
基因工程的工具酶
定义 用于DNA和RNA切割和连 接的各种酶叫做工具酶。
限制性核酸内切酶的反应条件
• 各种限制性核酸内切酶反应条件相似，主 要区别是对盐浓度的需求不同。据此可分 为三组
• 低盐组 0～50mmol/L NaCl • 中盐组 50～100mmol/L NaCl • 高盐组 100～150mmol/L NaCl
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限制性核酸内切酶的星号活性
当酶切条件发生变化时，限制性 核酸内切酶的专一性可能会降低，导 致同种酶识别多种序列，这种现象称 作限制性核酸内切酶的星号活性。
• 一般说来，在DNA分子中，识别序列短的 出现概率大，识别序列长的出现概率小。 有N个核苷酸的识别序列出现概率为1/4n。 如识别4个核苷酸Sau 3A，则间隔256 （4×4×4×4）个核苷酸就有一次机会出 现识别位点。如识别8个核苷酸的Not I，则 需间隔65536个核苷酸才有一次机会出现识 别位点。
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5′CCGATA-OH 3′ 3′GGC
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“分子剪刀”的发现者
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第一节 限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease，RE) 是由细菌自己产生的一种能识别双链 DNA中的特定序列，并以内切方式水解
核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。
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在细菌体内，这种内切酶可以分 解外源性的DNA物质，例如病毒等； 而细菌本身的DNA同一识别序列中的 某些碱基被甲基化所保护。这种细菌 内部的限制与修饰作用分别由核酸内 切酶和甲基化酶完成，构成了类似免 疫的防御系统。
EcoRI PstI HpaI
5' -G AATTC- 3' 3' -CTTAA G- 5'
5' -CTGCA G- 3' 3' -G ACGTC- 5'
5' -GTT AAC- 3' 3' -CAA TTG- 5'
5' sticky end 5'粘末端
3' sticky end 3'粘末端
blunt end 平末端
Ⅰ类和Ⅲ类限制性核酸内切酶同时具有内切 活性和甲基化修饰活性，且识别位点复杂， 特异性差，不适用于基因工程。
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一.限制性内切酶的命名
• Hind Ⅲ H in
dⅢ
细 菌 属 名
的 第
前细 两菌 个种 字名 母的
细 菌 菌 株 的 第
现同 的一 第菌 三株
一
一 种中
个
个 酶发
字
字
母
母
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• EcoRI E co R I
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例如 EcoR I在正常条件下识别GAATTC,但 在低盐（小于50mmol/L)、高pH（大于8）、 甘油大量存在时，识别序列增加了AAATTC、 GAGTTC,导致EcoR I在DNA分子上的切割 位点大大增加。
25
第二节 其他工具酶
一.DNA聚合酶 作用: 依据模版,连接游离的单核苷酸,形成与
模版互补的新链。
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1.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 该酶具有三种酶活性 5’→3’ DNA聚合活性 3’→5’ 外切酶活性 识别切除错配的核苷酸 5’→3’ DNA外切酶活性
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5′CCGATA-OH 3′ 3′GGCTATCGGA
dNTP DNA聚合酶Ⅰ
5′CCGATAGCCT 3′ 3′GGCTATCGGA 5’→3’ DNA聚合酶活性
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四.识别位点与切割方式
• 限制性内切酶识别序列一般为6个核苷酸，如 EcoRI，HindIII，BamHI，居多数。 也有少数限制性内切酶，识别序列为4个、5个、 或更多的核苷酸如8个及8个以上，当识别序列核 苷酸数为单数时，则以中间的核苷酸作为对称轴。 如GTNAC（N 代表四种核苷酸）。
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同尾酶：两种酶识别不同的顺序，但切割 产生的粘末端相同，叫做同尾酶。
同尾酶产生的粘末端，可通过碱基互补连 接，形成的位点称为“杂种位点”，该位 点不能再被原来的两种酶切割。
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例：AGATCT TCTAGA
Bgl Ⅱ源自文库
GGATCC CCTAGG
BamH Ⅰ
A TCTAG
GATCC G
连接酶
AGATCC TCTAGG
6
解释 何谓内切酶 -o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o红色为外切酶的作用位点， 蓝色为内切酶的作用位点
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限制性核酸内切酶的分类
目前已发现的限制性核酸内切酶600余种，可 分为三大类。
Ⅱ类限制性核酸内切酶广泛用于基因工程； 特点：识别切割位点比较专一，只有切割 作用。无甲基化修饰作用。
细 菌 属 名
的 第
前细 两菌 个种 字名
母的
该 酶 的 基 因
位
第该 一菌 种株 内发
一
于 切现
个
R
酶的
字
质
母
粒
上
10
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二. II型限制酶的识别特点
• 识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序的固 定位置切割，识别顺序为回文结构。 （Palindrome）
客上天然居 居然天上客
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三. 限制性内切酶的切割方式
20
• 同位酶:识别相同的序列,但切割位点不同.
• 同裂酶: 又称异源同工酶，来源不同,但识
别位点和切割位点相同.
切割位点也可以不同，例如Sam I(CCC↓GGG)和 Xma I(C↓CCGGG)
21
五.限制性内切酶的反应条件
• 反应温度 一般为37oC • 反应体积20µl • DNA含量 0.5－1µg • 酶含量 1－2u • DNA纯度：OD260/280nm>1.7 • 阳离子 Mg2+ • 反应时间 1-1.5h • pH7.5
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稀切酶：有些酶的识别位点在核苷酸序列中 出现的几率很小，可称为稀切酶。 为了获得大的DNA片段，需用稀切酶切割。
个别限制性内切酶可识别两种以上的核苷酸 序列，如Acc I既可识别GTATAC，又可识 别GTCGAC。
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• 位点偏爱：限制性内切酶识别序列两侧的 核苷酸组成与酶切效率有关，比如Nae I在 pBR322质粒上有4个识别位点，其中两个 位点可迅速被Nae I切割。第三个位点稍慢。 而位于1285处的第四个识别序列，切割的 效率只有其他位点的1/15。
第四章
基因工程的工具酶 及其应用
1
TOOLS FOR GENE CLONING SCISSORS: RESTRICTION ENZYMES
GLUE: DNA LIGASE VEHICLE: PLASMID OR VIRAL VECTORS
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基因工程的工具酶
定义 用于DNA和RNA切割和连 接的各种酶叫做工具酶。