基因工程常用工具酶及应用知识讲解
《基因工程的基本工具》 知识清单
《基因工程的基本工具》知识清单一、限制性内切核酸酶（限制酶）限制酶是基因工程中最重要的工具酶之一。
它就像一把精准的“分子剪刀”，能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点将 DNA 分子切开。
限制酶具有特异性，不同的限制酶识别的核苷酸序列不同。
例如，EcoRⅠ限制酶识别的序列是 GAATTC，而 BamHⅠ限制酶识别的序列是 GGATCC 。
当限制酶识别到特定序列后，就会在该位点将 DNA 双链切断，形成黏性末端或平末端。
黏性末端是指被切开的 DNA 双链的末端，一条链突出几个碱基，另一条链对应位置凹进去几个碱基，就像“锯齿”一样。
而平末端则是指切开的双链末端是平齐的。
限制酶的发现和应用，为基因工程中对 DNA 进行精确的切割和操作奠定了基础。
二、DNA 连接酶有了“剪刀”将 DNA 切开，还需要“胶水”将它们连接起来，这就是DNA 连接酶的作用。
DNA 连接酶能够将两个具有相同黏性末端或平末端的 DNA 片段连接在一起，形成一个完整的 DNA 分子。
DNA 连接酶连接的是 DNA 片段之间的磷酸二酯键。
在基因工程中，常用的 DNA 连接酶有 E·coli DNA 连接酶和 T4 DNA 连接酶。
E·coli DNA 连接酶只能连接黏性末端，而 T4 DNA 连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端，但连接平末端的效率相对较低。
三、载体在基因工程中，要将目的基因导入受体细胞，就需要一个“运输工具”，这就是载体。
载体需要具备一些特定的条件：1、能够在受体细胞中稳定保存并自我复制。
这样才能保证目的基因在受体细胞中能够长期存在和表达。
2、具有多个限制酶切点，以便插入目的基因。
3、具有标记基因，便于筛选含有目的基因的受体细胞。
常见的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒等。
质粒是一种小型的环状DNA 分子，广泛存在于细菌等原核生物中。
它具有自主复制能力，并且通常含有一些抗生素抗性基因作为标记基因。
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
《基因工程的基本工具》 讲义
《基因工程的基本工具》讲义基因工程作为现代生物技术的核心领域，为人类解决许多重大问题提供了强大的手段。
要深入理解基因工程，首先需要了解其基本工具，就如同工匠需要熟悉手中的工具才能打造出精美的作品一样。
一、限制性内切酶限制性内切酶，简称限制酶，是基因工程中的“剪刀”。
它能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割 DNA 分子。
这些酶的发现具有一定的偶然性。
在细菌中，它们被用于抵御外来DNA 的入侵，通过切割入侵的 DNA 来保护自身。
科学家们巧妙地利用了这一特性，将其应用于基因工程中。
限制酶具有高度的特异性，不同的限制酶识别的核苷酸序列不同，切割的位点也不同。
例如，EcoRI 识别的序列是 5' GAATTC 3' ，并在G 和 A 之间切割。
限制酶切割 DNA 产生的末端有两种类型：黏性末端和平末端。
黏性末端是指被切割后的DNA 片段末端有单链突出，就像“粘性的尾巴”，容易相互连接；平末端则是平整的切口。
二、DNA 连接酶有了“剪刀”将 DNA 切断，还需要“胶水”将其连接起来，这就是DNA 连接酶的作用。
DNA 连接酶能够将两个具有相同黏性末端或平末端的 DNA 片段连接在一起，形成一个完整的 DNA 分子。
在基因工程中，常用的 DNA 连接酶有 T4 DNA 连接酶等。
DNA 连接酶连接的是 DNA 片段之间的磷酸二酯键，这是保证DNA 分子结构稳定的重要化学键。
三、载体基因工程中，目的基因需要一个“运输工具”才能进入受体细胞并稳定存在和表达，这个“运输工具”就是载体。
常见的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等。
质粒是一种小型的环状 DNA 分子，存在于许多细菌和酵母菌中。
它具有自主复制能力，并且能够携带一些外源基因。
作为载体，需要具备一些重要的特点。
首先，要有一个或多个限制酶切割位点，以便插入目的基因。
其次，要有标记基因，用于筛选含有目的基因的受体细胞。
例如，氨苄青霉素抗性基因可以用来筛选导入了重组质粒的细菌。
基因工程的工具酶
03
应用领域：基 因工程、生物 制药、环境保
护等领域
04
发展趋势：定 向进化与优化 将成为工具酶 研究的重要方 向，推动基因 工程领域的发
展。
工具酶在合成生物学中的应用与前景
工具酶在合成生物学中的作用：作为构建基因电路的关键元件，实现对基因的精确调控 工具酶的发展趋势：更高效、更精确、更稳定的工具酶不断被开发出来 工具酶在生物制药中的应用前景：利用工具酶进行药物设计和生产，提高药物疗效和降低成本 工具酶在环境保护中的应用前景：利用工具酶进行污染治理和生态修复，保护生态环境和促进可持续发展
工具酶在基因治疗和生物医学中的未来发展
01
基因治疗：工具酶在基因编辑和基因治疗中的应用
02
生物医学：工具酶在疾病诊断和治疗中的应用
03
未来发展：工具酶在个性化医疗和精准医疗中的应用
04
展望：工具酶在基因治疗和生物医学领域的发展趋势和挑战
THANK YOU
YOUR LOGO
04
应用：基因工 程、DNA测序 、基因治疗等
领域
DNA连接酶
功能：连接 DNA片段，形 成重组DNA
特点：高效、 特异性强、稳 定性好
应用：基因克 隆、基因突变、 基因表达调控 等
类型：T4 DNA连接酶、 T7 DNA连接 酶等
聚合酶
01
功能：在基因工程中，聚合酶用于切割和连 接DNA，以实现基因的插入、删除和修改
工具酶：基因工程工具酶是指 在基因工程中用于切割、连接 和修饰DNA的酶
12
34
应用：在基因突变的研究中，
实例：例如，使用限制性内切
基因工程工具酶可以用来诱导
酶切割DNA，然后使用DNA连
基因工程基因工程工具酶
基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。
在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。
本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。
它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。
1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。
它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。
一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。
1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。
它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。
通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。
二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。
在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。
2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。
它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。
2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。
它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。
通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。
三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。
在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。
3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。
它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。
3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。
它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。
基因工程所需要的酶
基因工程所需要的酶引言基因工程是一项重要的生物技术，它利用酶的特殊功能来改变生物体的遗传信息。
酶在基因工程中起着关键作用，它们能够催化特定的化学反应，使得基因组中的DNA序列发生改变。
本文将介绍基因工程中常用的酶以及它们在不同的应用领域中的作用。
常用酶及其功能1. 限制性内切酶限制性内切酶是一类能够识别DNA序列并在特定位置切割DNA链的酶。
它们广泛应用于基因工程中的DNA重组、克隆和测序等领域。
限制性内切酶根据其识别位点和切割模式被分类为不同类型，如EcoRI、BamHI等。
这些酶可以将DNA分子切割成片段，并产生粘性或平滑末端，为后续操作提供方便。
2. DNA连接酶DNA连接酶是一种能够将两个单链DNA或RNA分子连接成一个完整双链分子的酶。
它们在基因工程中常被用于连接DNA片段，构建重组DNA分子。
T4 DNA连接酶是常用的DNA连接酶之一，它能够将DNA片段连接成环状或线性结构。
3. 核酸聚合酶核酸聚合酶是一类能够催化DNA或RNA的合成的酶。
在基因工程中，核酸聚合酶被广泛应用于PCR（聚合酶链式反应）和基因克隆等领域。
其中，Taq DNA聚合酶是PCR反应中最常用的核酸聚合酶之一，它能够耐高温，并具有高度特异性和高效率。
4. 核酸修复酶核酸修复酶是一类能够修复DNA损伤和错误的酶。
在基因工程中，核酸修复酶被用于修复突变的DNA序列，纠正基因组中的错误。
CRISPR-Cas9系统利用Cas9核酸修复酶来导向性地切割和编辑目标DNA序列。
5. 核苷三磷脂转移ase核苷三磷脂转移ase（NTPase）是一类能够催化核苷三磷酸与核苷二磷酸之间的磷酸酯键转移的酶。
在基因工程中，NTPase被广泛应用于DNA合成和修饰等领域。
DNA聚合酶的活性依赖于NTPase的催化作用。
酶在基因工程中的应用1. DNA重组和克隆在基因工程中，限制性内切酶被广泛应用于DNA重组和克隆。
通过选择适当的限制性内切酶，可以将目标DNA片段与载体DNA连接起来，构建重组DNA分子。
基因工程-工具酶
基因敲入
2
能。
利用工具酶将外源DNA片段整合到目标基
因中，实现新基因的表达。
3
基因编辑
通过工具酶修饰目标基因的特定碱基， 实现精确的基因改造。
农业、医药和工业领域的应用
农业
利用基因工程和工具酶，开发抗 虫、抗病、耐旱和高产的转基因 作物。
医药
工具酶在基因治疗中起着关键作 用，用于修复人类遗传病和癌症 等疾病的基因。
基因工程-工具酶
基因工程是利用DNA技术对生物体进行改造的科学，工具酶在基因工程中起 着至关重要的作用。
工具酶的作用
工具酶是基因工程中的重要工具，用于切割、连接和修饰DNA分子，使得科 学家能够精确操控基因。
常用的工具酶类型
限制酶
识别和切割DNA序列，用于定位和克隆特定基因。
连接酶
将不同DNA片段连接在一起，构建重组DNA分子。
修饰酶
对DNA分子进行修饰，如甲基化、去甲基化等。
造极酶
用于扩增DNA序列，如聚合酶链反应（PCR）中 的DNA聚合酶。
工具酶的工作原理
工具酶通过与DNA特定序列的互作用，识别并结合到目标序列上，然后以特 定的方式切割、连接或修饰DNA分子。
பைடு நூலகம்
基因修饰的方法
1
基因敲除
通过工具酶切割目标基因，使其失去功
工业
利用工具酶进行工业发酵，生产 各种化学品、药物和生物燃料。
挑战和限制
• 技术限制：某些DNA序列难以切割或修饰。 • 安全问题：基因修饰可能带来意想不到的风险和后果。 • 伦理考虑：对基因工程的道德和伦理问题需引起广泛关注。 • 法律和监管：基因工程面临严格的法律和监管要求。
基因工程操作的工具酶
也称为Kronberg酶，是Kronberg等1956年发 现的第一个DNA聚合酶。
具有三种酶活性
a、5’ ---3’DNA聚合酶活性
CCGATA-OH E.coli DNA pol I CCGATAGCCT
GGCTATCGGA Mg2+ dNTP
GGCTATCGGA
.
46
b、3’ ---5’ 外切酶活性
.
44
3. DNA聚合酶
分为两类： ①依赖于DNA的DNA聚合酶，包括大肠杆菌
DNA聚合酶I（全酶）、大肠杆菌DNA聚合 酶I的Klenow大片段酶、T4 DNA聚合酶、 T7DNA聚合酶和耐高温的DNA聚合酶等。 ②依赖于RNA的DNA聚合酶，有逆转录酶。
.
45
DNA聚合酶
(1)大肠杆菌DNA聚合酶I （E.coli DNA pol I)：
.
21
常见的限制性内切酶
限制性核酸内切酶名称 识别序列和切割点
EcoR Ⅰ
G↓AATTC
HindⅡ
GTPy↓PuAC
Hind Ⅲ
A↓AGCTT
BsuR I
GG↓CC
.
22
Pst Ⅰ Sma Ⅰ Xba Ⅰ Xho Ⅰ BamHⅠ Not Ⅰ
CTGCA↓G CCC↓GGG
T↓CTAGA C↓TCGAG G↓GATCC
.
14
限制性酶的识别序列一般为4~8个核苷 酸，这些序列大多呈回纹结构。
Eco RⅠ识别6个核苷酸序列，在特定的G-A 之间切割DNA分子。 5’ … G↓A –A- T –T – C … 3’ 3’ … C – T –T –A –A↑G … 5’
.
15
Pst Ⅰ酶切 5’ … C – T –G –C–A↓G … 3’ 3’ … G↑A–C – G–T– C… 5’
《基因工程的基本工具》 知识清单
《基因工程的基本工具》知识清单一、限制性内切酶限制性内切酶，又称限制酶，是基因工程中最重要的工具之一。
它就像一把极其精准的“分子剪刀”，能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割 DNA 分子。
限制酶的作用特点具有高度的特异性。
每种限制酶所识别的核苷酸序列通常是回文序列，即从两条链的5'端向3'端读取，序列是相同的。
例如，EcoRⅠ识别的序列是 GAATTC，切割位点就在 G 和 A 之间。
限制酶的切割方式有两种：一种是在识别序列的中轴线两侧进行切割，产生的 DNA 片段末端是平末端；另一种是在中轴线处切割，产生的 DNA 片段末端是黏性末端。
黏性末端因为具有互补的单链，所以在DNA 连接酶的作用下更容易连接。
限制酶在基因工程中的主要用途是切割目的基因和载体，以便于构建重组 DNA 分子。
二、DNA 连接酶有了“剪刀”把 DNA 切开，还需要“胶水”把它们粘起来，这时候就轮到 DNA 连接酶发挥作用了。
DNA 连接酶能够将两个具有相同末端的 DNA 片段连接在一起。
常见的 DNA 连接酶有两种，分别是 E·coli DNA 连接酶和 T4 DNA 连接酶。
E·coli DNA 连接酶只能连接黏性末端，而 T4 DNA 连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，但连接平末端的效率相对较低。
在基因工程中，DNA 连接酶用于将切割后的目的基因和载体连接，形成重组 DNA 分子。
三、载体载体是将外源基因送入受体细胞的“运输工具”。
它需要具备一些特定的条件。
首先，载体要有一个或多个限制酶切点，以便插入目的基因。
其次，载体要有自我复制的能力，或者能整合到受体细胞的染色体 DNA 上，随染色体 DNA 一起复制。
再者，载体要有标记基因，便于重组 DNA分子的筛选。
常见的标记基因有抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
常见的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等。
质粒是一种小型的环状 DNA 分子，广泛存在于细菌和酵母菌等微生物中。
基因工程常用工具酶及应用
DNA 连接酶
36
DNA连接酶
连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手）， 不是氢键（梯子的踏板）。
37
三.RNA酶
主要功能 降解RNA 由于RNA酶分布广泛，如唾液、 皮肤分泌物中都含此酶，在涉及RNA 的实验中谨防RNA酶污染。
38
四.核酸酶SI
• 降解单链 DNA 或 RNA，形成5’-P的单核苷 酸或寡核苷酸片段
5'粘末端
PstI
3' sticky end
3'粘末端
HpaI
blunt end
平末端
14
四.识别位点与切割方式
• 限制性内切酶识别序列一般为6个核苷酸，如
EcoRI，HindIII，BamHI，居多数。 也有少数限制性内切酶，识别序列为4个、5个、 或更多的核苷酸如8个及8个以上，当识别序列核 苷酸数为单数时，则以中间的核苷酸作为对称轴。 如GTNAC（N 代表四种核苷酸）。
某些碱基被甲基化所保护。这种细菌
内部的限制与修饰作用分别由核酸内
切酶和甲基化酶完成，构成了类似免
疫的防御系统。
6
解释 何谓内切酶
-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o红色为外切酶的作用位点， 蓝色为内切酶的作用位点
7
限制性核酸内切酶的分类
目前已发现的限制性核酸内切酶600余种，可 分为三大类。 Ⅱ类限制性核酸内切酶广泛用于基因工程；
15
• 一般说来，在DNA分子中，识别序列短的 出现概率大，识别序列长的出现概率小。 有N个核苷酸的识别序列出现概率为1/4n。 如识别4个核苷酸Sau 3A，则间隔256 （4×4×4×4）个核苷酸就有一次机会出 现识别位点。如识别8个核苷酸的Not I，则 需间隔65536个核苷酸才有一次机会出现识 别位点。
基因工程的工具酶
T
T
A
G
C
C
G
怎样切？ • 基因的剪刀——限制性内切酶（简称限制酶）
例：大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
限制酶
限制酶
几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点
Pst I
Provindencia stuartii 164
Haemophilus influenzae Rd
4363 pBR322物理图谱
练习题
为了绘制长为3.0kb BamH Ⅰ限制性片段的限制性图谱，分别用EcoR Ⅰ、Hpa Ⅱ、 EcoR Ⅰ+Hpa Ⅱ消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，溴化乙锭染色后观 察DNA带型。请根据这些结果绘制一个限制性图谱，要标明EcoR Ⅰ和Hpa Ⅱ识别位点间的 相对位置，以及它们之间的距离（kb）。
现非特异性的DNA片段的现象。 易产生星活性的内切酶用*标记。如：EcoR I*
造成星活性参数 甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基
亚枫，二价阳离子，12%
限制性内切酶的应用
1、重组DNA前的切割 2、构建新质粒 3、构建物理图谱 4、DNA分子杂交 5、制备DNA探针 6、亚克隆以用作序列分析 7、基因定位，DNA同源性研究。
A. 连接的两条链必须分别具有 3′端自由羟基（-OH）和5 ′端磷酸基团（-P），而且只有这两 个基团彼此相邻时才能进行连接反应；
B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程，因此连接反应必须有能量分子的参与， 通常有两种能量分子，即ATP和NAD+。
是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。
《基因工程的工具——酶与载体》 知识清单
《基因工程的工具——酶与载体》知识清单基因工程作为现代生物技术的核心领域之一，为人类带来了前所未有的机遇和挑战。
而在基因工程中，酶和载体是至关重要的工具，它们就像是工匠手中的精巧工具，帮助我们实现对基因的精确操作和转移。
一、基因工程中的酶1、限制性内切酶限制性内切酶，也被称为“分子剪刀”，是基因工程中最重要的工具酶之一。
它能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点将 DNA 分子切断。
这种特性使得我们能够从复杂的 DNA 分子中切取特定的基因片段。
不同的限制性内切酶识别的序列不同，这为基因工程的操作提供了丰富的选择。
限制性内切酶的作用就像是一把精准的剪刀，能够在 DNA 这个长长的“绳子”上剪出我们需要的特定片段。
比如，EcoRI 能识别GAATTC 序列，并在 G 和 A 之间切断 DNA 双链。
2、 DNA 连接酶当我们用限制性内切酶切下所需的基因片段后，需要将它们与其他DNA 片段连接起来，这时候就轮到 DNA 连接酶发挥作用了。
DNA 连接酶能够将两个具有相同黏性末端或平末端的 DNA 片段连接在一起，形成一个完整的 DNA 分子。
想象一下，DNA 连接酶就像是一个“胶水”，把被剪开的 DNA 片段重新粘在一起，使它们成为一个连续的整体。
3、 DNA 聚合酶在基因工程中，DNA 聚合酶常用于 DNA 的复制和扩增。
例如，PCR（聚合酶链式反应）技术就依赖于耐高温的 Taq DNA 聚合酶。
通过 PCR 技术，我们可以在体外大量扩增特定的 DNA 片段，为后续的实验和应用提供足够的材料。
4、反转录酶反转录酶能够以 RNA 为模板合成互补的 DNA（cDNA）。
这在获取真核生物的基因时非常有用，因为真核生物的基因中含有内含子，而通过反转录得到的 cDNA 不含内含子，更便于在原核生物中表达。
二、基因工程中的载体1、质粒质粒是一种存在于细菌细胞质中的小型环状 DNA 分子。
它具有自主复制能力，可以在细菌细胞内独立存在和复制。
第二章基因工程中常用的工具酶
第二章 基因工程中常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA 分子的特异切割分子的特异切割DNA 甲基化酶—用于DNA 分子的甲基化分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA 和RNA 的连接的连接核酸聚合酶—用于DNA 和RNA 的合成的合成核酸酶—用于DNA 和RNA 的非特异性切割的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA 和RNA 的末端修饰的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
§2-1 核酸内切限制酶定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。
双链结构的核酸内切酶。
到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。
种以上不同的核酸内切限制酶。
核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）一 、限制修饰系统的种类（图）限制修饰系统的种类（图）二、 限制性内切酶的定义、命名1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II 型限制酶。
型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
例如：Hin d Ⅲ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae ，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
表示分离到的第三个限制酶。
Eco RI RI——Escherichia coli RI RI Hin d Ⅲ—Haemophilus influensae d ⅢSac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA 分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp 的地方可以随机地切割DNA 分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。
基因工程常用工具酶及应用
*
5′CCGATA-OH 3′ 3′GGC DNA聚合酶Ⅰ 5′CCG 3′GGC ＋dA,dT 3’→5’ 外切酶活性
2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段
该酶是用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ ，从全酶中切去 5‘ → 3’ 外切活性的肽段后产生的一条多肽链，保留了5’→3’聚合和3’→5’外切活性。
5'
5'
3'
-G AATTC-
5'
3'
-CTTAA G-
5'
5'
3'
3'
-GTT AAC-
-CAA TTG-
5' sticky end 5'粘末端
3' sticky end 3'粘末端
blunt end 平末端
*
四.识别位点与切割方式
限制性内切酶识别序列一般为6个核苷酸，如EcoRI，HindIII，BamHI，居多数。
M-MLV－来自于莫络尼鼠的白血病病毒
二 . T4DNA连接酶
催化两个DNA片段的3’-OH和5’-P末端 形成磷酸二酯键
该酶是大肠杆菌T4噬菌体的DNA30编码的产物，分子量68kd。现已由基因工程菌表达。
*
DNA 连接酶
“分子针线”
*
DNA连接酶
连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。
01
该酶称为Klenow酶。也称为 Klenow 片段（Klenow fragment）。
02
*
3.T4噬菌体DNA聚合酶
来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，具有
5’→3’ DNA聚合酶活性
《基因工程的工具——酶与载体》 知识清单
《基因工程的工具——酶与载体》知识清单一、基因工程简介基因工程，又称为重组 DNA 技术，是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外 DNA 重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
它是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，而实现这一技术的关键就在于一系列特殊的工具，其中酶和载体起着至关重要的作用。
二、基因工程中的酶1、限制性核酸内切酶（限制酶）限制酶是能够识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开的酶。
限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割 DNA 分子。
例如，EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC 序列，并在 G 和 A 之间切断磷酸二酯键。
限制酶切割DNA 分子产生的末端有两种类型：黏性末端和平末端。
黏性末端是指被限制酶切开的 DNA 双链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对；平末端则是指切口平整，不带有伸出的核苷酸。
2、 DNA 连接酶DNA 连接酶的作用是将两个具有相同末端（如黏性末端或平末端）的 DNA 片段连接起来，形成一个完整的 DNA 分子。
DNA 连接酶与限制酶的作用相反，它通过催化磷酸二酯键的形成，将断开的 DNA 片段重新连接起来。
3、 DNA 聚合酶在基因工程中，DNA 聚合酶常用于 DNA 片段的扩增，如 PCR 技术（聚合酶链式反应）。
PCR 技术中使用的热稳定 DNA 聚合酶（Taq 酶）能够在高温环境下保持活性，不断地将脱氧核苷酸加到引物的 3'端，使 DNA 链得以延伸。
4、反转录酶反转录酶能够以 RNA 为模板合成互补的 DNA 链，即 cDNA。
这在获取目的基因时非常有用，例如从真核生物细胞中提取出mRNA，然后通过反转录酶合成 cDNA，再进行后续的基因操作。
三、基因工程中的载体1、载体的作用载体在基因工程中主要起到运输目的基因的作用，它能够将目的基因导入到受体细胞中，并使其在受体细胞中稳定存在和表达。
基因工程的主要工具酶及其功能
基因工程的主要工具酶及其功能基因工程，听起来有点高大上是不是？不过，别紧张，其实它就是通过一些技术手段去“修修补补”我们基因里的东西，改改它们的“工作方式”。
你想想，就像是给手机换个更强大的处理器，或者把家里的WiFi升级成超速光纤，基因工程就是想通过这种方法让某些生物更强大、效率更高。
你可能会想，基因工程到底怎么做到的？答案就是：它有一堆超级厉害的工具，而这些工具的幕后英雄，正是酶。
对，就是那些在生物体内帮忙做各种“化学工作”的小能手。
酶是啥？简而言之，酶就是大自然的“万能钥匙”，它们能帮助我们剪、粘、拼接、修复、拆解基因链。
没有它们，基因工程可能就成了空谈。
所以，酶就是基因工程的“主力军”，它们有着不可或缺的地位。
就像我们上学时，如果没有老师的引导，知识就没法传授到我们手里；如果没有酶的帮助，基因操作也是无从下手。
首先要聊聊的是“限制性内切酶”，这是基因工程中最常见的一种酶，简直可以说是基因“剪刀”。
它的功能很简单却非常强大——它能在特定的DNA序列上找到并切割掉不需要的部分，哎呀，这就像你在看视频时用剪辑软件裁掉那些你觉得无聊的部分，留下一段精简有趣的内容。
限制性内切酶其实是自然界中细菌用来对抗病毒入侵的一种防御武器，它通过切割外来病毒的DNA来保护自己。
科学家们聪明地发现，利用这些“剪刀”可以方便地切割我们想要的DNA片段，从而为基因工程的“拼图”提供了素材。
要聊的是“连接酶”。
你可以把连接酶想成是基因工程中的“胶水”。
有了限制性内切酶剪出DNA片段之后，这些片段就需要拼接起来，才能形成新的基因。
连接酶就是做这件事的“能手”。
它能够把切开的DNA片段连接在一起，把它们重新合并成一个完整的基因，就像你把几块乐高积木拼成一个完整的房子。
没有连接酶，基因工程的“拼图”就无法完成，那些小小的DNA片段就只能任其散落一地，完全无法发挥作用。
可能有些人开始好奇，这些酶真的有那么神奇吗？当然啦！接下来我们要说的“聚合酶”，它是基因工程中的“扩音器”。
《基因工程的工具——酶与载体》 知识清单
《基因工程的工具——酶与载体》知识清单一、基因工程简介基因工程，又称基因拼接技术或 DNA 重组技术，是指按照人们的意愿，将一种生物的基因在体外进行改造和重新组合，然后导入另一种生物的细胞内，使其能够表达并产生新的性状或产物的技术。
这项技术的出现，为人类解决许多问题提供了新的途径和方法。
二、酶在基因工程中的作用1、限制性核酸内切酶（简称限制酶）限制酶是基因工程中最重要的工具酶之一。
它能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割 DNA 分子。
例如，EcoRⅠ限制酶能够识别 GAATTC 序列，并在 G 和 A 之间切断磷酸二酯键。
限制酶的作用就像是一把“分子剪刀”，能够将 DNA 剪成不同的片段，为后续的基因重组提供材料。
不同的限制酶识别的核苷酸序列不同，切割位点也不同。
这使得我们可以根据需要选择合适的限制酶来切割 DNA。
2、 DNA 连接酶在基因工程中，将切割后的 DNA 片段连接起来需要用到 DNA 连接酶。
DNA 连接酶能够将两个具有相同黏性末端或平末端的 DNA 片段连接在一起，形成一个完整的 DNA 分子。
DNA 连接酶的作用就像是“胶水”，将断开的 DNA 链条重新连接起来，保证基因的完整性和稳定性。
3、反转录酶反转录酶在基因工程中也有着重要的作用。
它能够以 RNA 为模板合成 DNA，这一过程被称为反转录。
例如，在获取目的基因时，如果我们只有相应的 mRNA，就可以利用反转录酶合成与之互补的 DNA 链，即 cDNA。
4、聚合酶聚合酶在基因工程中的应用也非常广泛。
例如，在 PCR 技术（聚合酶链式反应）中，DNA 聚合酶能够在体外快速大量地扩增特定的DNA 片段。
三、载体在基因工程中的作用载体是基因工程中用于携带目的基因进入受体细胞的工具。
常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等。
1、质粒质粒是一种存在于细菌等微生物细胞中的小型环状 DNA 分子。
它具有自主复制能力，能够在细胞内独立地进行复制和遗传。
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EcoRI PstI HpaI
5' -G AATTC- 3' 3' -CTTAA G- 5'
5' -CTGCA G- 3' 3' -G ACGTC- 5'
5' -GTT AAC- 3' 3' -CAA TTG- 5'
5' sticky end 5'粘末端
3' sticky end 3'粘末端
blunt end 平末端
第四章
基因工程的工具酶 及其应用
1
TOOLS FOR GENE CLONING SCISSORS: RESTRICTION ENZYMES
GLUE: DNA LIGASE VEHICLE: PLASMID OR VIRAL VECTORS
2
基因工程的工具酶
定义 用于DNA和RNA切割和连 接的各种酶叫做工具酶。
细 菌 属 名
的 第
前细 两菌 个种 字名
母的
该 酶 的 基 因
位
第该 一菌 种株 内发
一
于 切现
个
R
酶的
字
质
母
粒
上
10
11
二. II型限制酶的识别特点
• 识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序的固 定位置切割，识别顺序为回文结构。 （Palindrome）
客上天然居 居然天上客
12
13
三. 限制性内切酶的切割方式
模版互补的新链。
26
1.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 该酶具有三种酶活性 5’→3’ DNA聚合活性 3’→5’ 外切酶活性 识别切除错配的核苷酸 5’→3’ DNA外切酶活性
27
5′CCGATA-OH 3′ 3′GGCTATCGGA
dNTP DNA聚合酶Ⅰ
5′CCGATAGCCT 3′ 3′GGCTATCGGA 5’→3’ DNA聚合酶活性
3
“分子剪刀”的发现者
4
第一节 限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease，RE) 是由细菌自己产生的一种能识别双链 DNA中的特定序列，并以内切方式水解
核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。
5
在细菌体内，这种内切酶可以分 解外源性的DNA物质，例如病毒等； 而细菌本身的DNA同一识别序列中的 某些碱基被甲基化所保护。这种细菌 内部的限制与修饰作用分别由核酸内 切酶和甲基化酶完成，构成了类似免 疫的防御系统。
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限制性核酸内切酶的反应条件
• 各种限制性核酸内切酶反应条件相似，主 要区别是对盐浓度的需求不同。据此可分 为三组
• 低盐组 0～50mmol/L NaCl • 中盐组 50～100mmol/L NaCl • 高盐组 100～150mmol/L NaCl
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限制性核酸内切酶的星号活性
当酶切条件发生变化时，限制性 核酸内切酶的专一性可能会降低，导 致同种酶识别多种序列，这种现象称 作限制性核酸内切酶的星号活性。
Ⅰ类和Ⅲ类限制性核酸内切酶同时具有内切 活性和甲基化修饰活性，且识别位点复杂， 特异性差，不适用于基因工程。
8
一.限制性内切酶的命名
• Hind Ⅲ H in
dⅢ
细 菌 属 名
的 第
前细 两菌 个种 字名 母的
细 菌 菌 株 的 第
现同 的一 第菌 三株
一
一 种中
个
个 酶发
字
字
母
母
9
• EcoRI E co R I
6
解释 何谓内切酶 -o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o红色为外切酶的作用位点， 蓝色为内切酶的作用位点
7
限制性核酸内切酶的分类
目前已发现的限制性核酸内切酶600余种，可 分为三大类。
Ⅱ类限制性核酸内切酶广泛用于基因工程； 特点：识别切割位点比较专一，只有切割 作用。无甲基化修饰作用。
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• 同位酶:识别相同的序列,但切割位点不同.
• 同裂酶: 又称异源同工酶，来源不同,但识
别位点和切割位点相同.
切割位点也可以不同，例如Sam I(CCC↓GGG)和 Xma I(C↓CCGGG)
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五.限制性内切酶的反应条件
• 反应温度 一般为37oC • 反应体积20µl • DNA含量 0.5－1µg • 酶含量 1－2u • DNA纯度：OD260/280nm>1.7 • 阳离子 Mg2+ • 反应时间 1-1.5h • pH7.5
• 一般说来，在DNA分子中，识别序列短的 出现概率大，识别序列长的出现概率小。 有N个核苷酸的识别序列出现概率为1/4n。 如识别4个核苷酸Sau 3A，则间隔256 （4×4×4×4）个核苷酸就有一次机会出 现识别位点。如识别8个核苷酸的Not I，则 需间隔65536个核苷酸才有一次机会出现识 别位点。
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5′CCGATA-OH 3′ 3′GGC
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同尾酶：两种酶识别不同的顺序，但切割 产生的粘末端相同，叫做同尾酶。
同尾酶产生的粘末端，可通过碱基互补连 接，形成的位点称为“杂种位点”，该位 点不能再被原来的两种酶切割。
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例：AGATCT TCTAGA
Bgl Ⅱ
GGATCC CCTAGG
BamH Ⅰ
A TCTAG
GATCC G
连接酶
AGATCC TCTAGG
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稀切酶：有些酶的识别位点在核苷酸序列中 出现的几率很小，可称为稀切酶。 为了获得大的DNA片段，需用稀切酶切割。
个别限制性内切酶可识别两种以上的核苷酸 序列，如Acc I既可识别GTATAC，又可识 别GTCGAC。
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• 位点偏爱：限制性内切酶识别序列两侧的 核苷酸组成与酶切效率有关，比如Nae I在 pBR322质粒上有4个识别位点，其中两个 位点可迅速被Nae I切割。第三个位点稍慢。 而位于1285处的第四个识别序列，切割的 效率只有其他位点的1/15。
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例如 EcoR I在正常条件下识别GAATTC,但 在低盐（小于50mmol/L)、高pH（大于8）、 甘油大量存在时，识别序列增加了AAATTC、 GAGTTC,导致EcoR I在DNA分子上的切割 位点大大增加。
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第二节 其他工Βιβλιοθήκη 酶一.DNA聚合酶 作用: 依据模版,连接游离的单核苷酸,形成与
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四.识别位点与切割方式
• 限制性内切酶识别序列一般为6个核苷酸，如 EcoRI，HindIII，BamHI，居多数。 也有少数限制性内切酶，识别序列为4个、5个、 或更多的核苷酸如8个及8个以上，当识别序列核 苷酸数为单数时，则以中间的核苷酸作为对称轴。 如GTNAC（N 代表四种核苷酸）。
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