分子生物学实验基本技术训练

30个循环
型 号：PTC-100 制造商：MJ Research
(美国)
电泳技术
（琼脂糖电泳）
分类：
琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 醋酸纤维膜电泳 ……
常用
➢琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶的异同
聚合方式 电泳方式
毒性 适用对象 操作要求
孔径
琼脂糖凝胶 物理作用 平板 无毒 大分子 简单
与浓度成反比
聚丙烯酰胺凝胶 化学反应 垂直板 神经毒性 小分子 较难
与浓度成反比
➢琼脂糖凝胶浓度与线性DNA的 最佳分辨范围
琼脂糖浓度 线性DNA的最佳分辨范围（bp）
0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0%
1，000～30，000 800～12,000 500～10,000 400～7,000 200～3,000 50～2,000
在DNA双螺旋结构中碱基处于双螺旋结 构的内部，呈平面结构，垂直于螺旋轴成对排 列。糖基—磷酸脂基构成主链暴露在外表面， 并带有磷酸脂基的负电荷。 DNA分子电泳时 的迁移速度与凝胶孔径和所带电荷量成正比， 与分子大小成反比。
➢操作过程
❖操作前的准备
（1）标准分子质量标记（Marker）
Marker是一组固定的分子量的样品混合物，经电泳后 各成分会按照分子量大小进行排列。标准分子质量 标记作为样品的参照标准应与样品同时电泳。如： 1Kb DNA Marker：1000，2000，3000，4000，5000， 6000，7000， 8000，10000。
型 号：MiniSpin 制造商：Eppendorf
（德国）
型 号：3-18K 制造商：SIGMA
（德国）
微量移液技术
➢量液操作注意问题：
（1）不能移取量程以外体积的液体，否则会损坏移液 器。
（2）吸取液体时，先推至第一档在吸取；释放液体时 ，在第一档停顿1-2s后推至终点。
（3）吸取液体时不能太快。如果不小心将液体吸入吸 液杆应报告指导老师，经清洗后方可再用。
型 号：cheni genins 制造商：SYNGENE
（英国）
未污染
离心技术
（高速冷冻离心机）
➢离心机工作规则：
1、检查离心管是否完好，不要使用有裂缝的离心管。 即使极小的裂缝也会在离心力作用下破裂。
2、每次使用前都要检查转子中是否有别人遗留的离心 管。转子中遗留的离心管可能导致离心机不平衡。
分子生物学反应体系中的酶要最后加入到体 系中.
无菌操作技术
➢器材包扎
1、三角瓶至少留1/3空间，先盖透气膜，后盖报 纸，线绳缠好。 培养时不能覆盖报纸，透气膜用完后回收。
2、枪头盒、EP管盒、培养皿要用报纸包好。 3、离心筒将盖旋紧后回旋半圈，报纸包扎。
3、将平衡的离心管对位放置，盖好转子盖。如果离心 启动后发现转子盖没盖，应停止离心，盖上转子盖后 再启动。
4、离心完成后应立即从离心机内取走样品。离心结 束后若样品长时间留在离心机里。会沉淀重新分 散开。
5.低温离心机在两次运行之间应关上盖子，以避免冷 凝。
6.每一次使用完离心机后都要将离心机内部清理干净 并填写使用记录。
分子生物学实验 基本技术训练
➢PCR技术 ➢电泳技术 ➢离心技术 ➢微量移液技术 ➢无菌操作技术 ➢实验记录与实验报告的书写
PCR技术
（多聚酶链式反应）
PCR是采用分子技术模拟核酸在体内的复 制，实现DNA体外扩增，以获得大量DNA片 段供研究需要。
反应过程：
❖ 94℃ 4min ❖ 94℃ 30S ❖ 50℃ 30S ❖ 72℃ 60S ❖ 72℃ 10min ❖ 4℃ 保存 ❖ End
❖加样和电泳
（１）取一只PE手套，用移液器在上面点上上样 缓冲液，然后取样品使其与上样缓冲液混合均匀 点在胶孔中。
（２）标准分子量标记直接点在胶孔中。
（３）盖好电泳槽盖，正确连好导线。
（4）在电泳时，为了获得电泳分离DNA的最大 分辨率，电场强度不应高于5 V/cm
❖凝胶来自百度文库像
（１）待前沿指示剂距凝胶前沿约1cm是停止电泳。 （２）关闭电源，取出凝胶，放入凝胶成像仪观察。
（4）使用完后，一定要将移液量调至最大量程，以免 压缩弹簧导致弹簧不能回复。
（5）移液器必须卸掉枪头后才能放在移液器架上。
➢各种酶等溶液的移取问题
分子生物学中由于移取试剂体积较小可以 使用微量移液器先将试剂（如引物,缓冲液等） 分别加到管壁上，加完之后通过点动离心,使液 体聚到管底，然后轻弹管底使之充分混匀。
❖ 电源：稳压、稳流、稳功率。
❖ 样品制备 （1）适用于琼脂糖电泳的样品可以是基因组DNA、
质粒和PCR产物等大分子。
（2）样品必须与上样缓冲液混合均匀，以保证样品 带电荷。
❖ 琼脂糖凝胶的制备 （1）将铺胶槽调成水平。
（2）准确称取一定质量的琼脂糖放入锥形瓶中， 量取30ml 1×电泳缓冲液倒入锥形瓶，瓶口倒扣 一个小烧杯。
❖ 样品缓冲液： 盐类（维持样品）、甘油（增加重量从而使样品下沉至 点样孔）、以及示踪染料（以便监测电泳进程）。例如 6×Loading Buffer：30%(v/v)甘油，0.25%（w/v) 溴 酚蓝，0.25%（w/v)二甲苯腈蓝，蒸馏水配置。
❖ 电泳缓冲液： 凝胶中所加的缓冲液应该与电泳槽中的相一致． 琼脂糖凝胶电泳最常用的缓冲液是TAE (Tris-醋酸－ EDTA）与TBE (Tris-硼酸－EDTA）。
（3）将锥形放入微波炉中加热煮沸3次至琼脂糖全 部融化透明，摇匀。加热时避免凝胶溶液爆沸。
（4）待凝胶冷却至50～60℃时加入染料，混匀 后匀速倒入胶托中。倒胶时避免温度过低防止 凝胶凝固结块或出现气泡。若凝胶出现气泡则 不允许使用。
（5）小心将梳子插在胶托中，待凝胶完全凝固 后再拔出梳子。
（6）将凝胶放入电泳槽中，并向电泳槽中倒入 1×电泳缓冲液，液面高过胶面2～5mm。
❖注意事项：
（１）制胶槽要调成水平 （２）加样时移液器头不要插破胶孔。 （３）加样的体积不要大于胶孔的体积。 （４）琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。 （５）在电泳时，电泳缓冲液应略高于琼脂糖凝胶
面，琼脂糖凝胶点样口应放在电泳槽负极一侧。 （6）不要用手直接接触凝胶及凝胶成像仪内部。
型 号：Power Pac Basic TM 制造厂：BIO-RAD