分子生物学实验基本技术训练
分子生物学实验技术全攻略
分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 2实验二质粒DNA的提取 3实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9实验八 RNA提取与纯化 11实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15实验十一感受态细胞的制备及转化 16实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18实验十三 DNA分析——Southern杂交 19一基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化二、目的基因获取实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。
二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。
特别是常用的大肠杆菌。
大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。
它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。
当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。
然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。
分子生物学：基础实验技能培训实验操作手册
基础实验技能培训实验操作手册2014-08植物基因组DNA提取实验材料：植物样本，植物基因组DNA提取试剂盒，β-巯基乙醇，氯仿，无水乙醇实验仪器、耗材：移液器、电泳仪、离心机、研钵、研钵棒、剪刀、天平、液氮实验前准备：1．Buffer GP1在使用前请加入β-巯基乙醇，5 ml Buffer GP1加5 μl β-巯基乙醇。
加入β-巯基乙醇的Buffer GP1室温可保存1个月。
2．预热水浴锅65度，将加入配制好的巯基乙醇预热。
3．第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。
4．称取植物样本约100 mg。
5．在研磨植物材料前，向研钵中倒入酒精，放入剪刀、钥匙高温消毒。
6．研钵、剪刀、钥匙冷却后，将液氮加入在研钵中以预冷研钵。
实验步骤：1. 取植物新鲜组织约100 mg，用剪刀将样本剪碎，放入研钵，加入液氮充分研磨至粉末状。
将粉末转移到离心管中。
注意：冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。
而且粉末应在化冻前转移，否则内源性DNase 有可能降解基因组DNA。
2. 加入700 μl 65℃预热的Buffer GP1（Buffer GP1在使用前请加入β-巯基乙醇，5 ml BufferGP1加5 μl β-巯基乙醇），迅速颠倒混匀后，将离心管置于65℃水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管混匀样品数次。
3. 加入700 μl 氯仿，充分混匀，12,000 rpm（～13,400×g）离心5分钟。
小心将上层水相转入一新的离心管中，加入700 μl Buffer GP2，充分混匀。
4. 将上步所得溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube）的吸附柱（Spin Column DM）中。
若一次不能加完溶液，可分多次转入。
10,000 rpm（～11,500×g）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
5. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），10,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
实验一、分子生物学基本操作及常用仪器介绍
4、不测量时要打开暗室盖，以确保光门关闭，以 免加快光敏元件的老化（比色计暗室上有一小钉， 压下后光门打开）。
5、灵敏档选择的依据时能够调零，尽量选用低档， 这样可以确保读数较稳定。
6、所测得的A值尽量在0.1～0.7之间，（最好在 0.2～0.6之间），因为此值范围内读数较准，超 过时，应稀释溶液
二、分子生物学实验的特点
1、分子生物学实验主要应用化学原理和方法所设计 的科学实验，也渗进了一些相关学科的理论知识与 方法。
2、由于研究对象为生物体，所以标本的来源不易， 微量和定量是分子生物学实验的一大特点。
3、分子生物学实验往往涉及生物大分子和生物材料 的检测，因此取材常为生物体的组织器官，甚至是 活的生物体。所以很难保证样品、标本的无菌性， 要注意作好自身防护。
4、实验课后均要将用过的仪器试管进行清洗，并整理 台面。
四、基本操作
（一）仪器的清洗
1、一般玻璃仪器：如试管烧杯量筒三角瓶等，先用自 来水洗刷，用毛刷沾少许肥皂粉或去污粉洗刷；再用自 来水反复冲洗，去尽肥皂水或去污粉直至无泡沫，最后 用蒸馏水淋洗2～3次，干燥备用。
2、做定量实验或要求严格时，除了用去污剂外，还需 以热洗液洗涤一次（或冷洗液浸泡过夜），而后再用蒸 馏水淋洗2～3遍。洗液由浓硫酸—重鉻酸钾—水按一定 比例根据不同需要配成。
（二）吸量管的使用与选择
1、吸管为精密吸量器，其规格有：0.1ml、0.25ml、1ml、2ml、 5ml、10ml等，有的吸量管上有两个环，上面的数字标示最 大体积，下面的是最小分刻度体积。根据实验需要，选择合 适规格的吸量管。如吸取1.5ml溶液，以选2 ml为宜；若用1 ml吸两次，则会增大误差。另外还应注意，在一组实验中， 吸量同一种试剂，应尽量选用一支移液管，以减少系统误差。
分子生物学专题训练(含答案)
分子生物学专题训练(含答案)分子生物学是研究生物体内分子结构、组成和功能的学科。
以下是一些分子生物学的专题训练题目及其答案。
1. DNA复制问题：DNA复制是指什么？在细胞中是如何进行的？答案：DNA复制是指在细胞分裂过程中，将一个DNA分子复制成两个完全相同的DNA分子的过程。
在细胞中，DNA复制通过酶的作用，在DNA双链上建立一个新的互补链，生成两个完全相同的DNA分子。
2. 基因转录问题：基因转录是什么过程？主要酶有哪些？简要描述转录的过程。
答案：基因转录是指将DNA中的基因信息转录成mRNA的过程。
主要酶有RNA聚合酶和辅助因子。
转录的过程分为三个阶段：起始、延伸和终止。
起始阶段是RNA聚合酶与DNA结合，形成转录起始复合物；延伸阶段是RNA聚合酶沿DNA模板链合成mRNA链；终止阶段是mRNA链与RNA聚合酶和DNA分离，形成终止转录复合物。
3. 翻译过程问题：翻译是指什么过程？主要的遗传密码是什么？简要描述翻译的过程。
答案：翻译是指将mRNA中的核酸序列转译成蛋白质的过程。
主要的遗传密码是以三个核苷酸为一个密码子，共有64种可能的密码子，编码了20种氨基酸和一个终止信号。
翻译的过程分为起始、延伸和终止三个阶段。
起始阶段是在起始密码子AUG的指导下，启动翻译过程；延伸阶段是tRNA带着相应的氨基酸与mRNA上的密码子互补配对，合成蛋白质链；终止阶段是遇到终止密码子时，翻译终止，释放蛋白质。
4. DNA重组问题：DNA重组是指什么过程？主要的DNA重组方式有哪些？简要描述DNA重组的过程。
答案：DNA重组是指在细胞中不同DNA分子之间交换DNA片段的过程。
主要的DNA重组方式有两个：同源重组和非同源重组。
同源重组是指两个同源染色体或同一个染色体上的两个同源DNA片段之间的重组；非同源重组是指不同染色体或同一染色体上的非同源DNA片段之间的重组。
DNA重组的过程包括DNA切割、DNA片段交换和DNA连接三个步骤。
分子生物学实训报告
一、实训背景分子生物学是研究生物大分子如蛋白质、核酸的结构与功能的一门学科。
随着生命科学技术的不断发展，分子生物学在医学、农业、环境保护等领域发挥着越来越重要的作用。
为了更好地理解和掌握分子生物学的基本理论和技术，我们开展了为期两周的分子生物学实训课程。
本次实训旨在通过实际操作，加深对分子生物学理论知识的理解，提高实验技能，培养科研素养。
二、实训目的1. 熟悉分子生物学实验室的基本操作规程和安全规范。
2. 掌握DNA提取、PCR扩增、酶切、电泳等分子生物学实验技术。
3. 理解基因克隆、基因表达、蛋白质分析等分子生物学实验原理。
4. 提高团队协作和沟通能力，培养科研素养。
三、实训内容1. 实验室基本操作与安全规范（1）熟悉实验室布局，了解各种仪器的使用方法。
（2）学习实验室安全操作规程，掌握实验室废弃物处理方法。
（3）进行实验前的准备工作，如配制试剂、消毒、无菌操作等。
2. DNA提取（1）了解DNA提取的原理和常用方法。
（2）学习酚-氯仿法提取DNA。
（3）对提取的DNA进行质量检测，如A260/A280比值、琼脂糖凝胶电泳等。
3. PCR扩增（1）了解PCR扩增的原理和步骤。
（2）设计PCR引物，进行PCR反应。
（3）对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
4. 酶切（1）了解酶切原理和酶切反应条件。
（2）学习限制性内切酶的用法。
（3）进行酶切反应，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
5. 电泳（1）了解电泳原理和电泳技术。
（2）学习琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等电泳技术。
（3）对DNA、蛋白质等生物大分子进行电泳分离和检测。
6. 基因克隆、基因表达、蛋白质分析（1）了解基因克隆、基因表达、蛋白质分析的基本原理。
（2）学习相关实验技术，如载体构建、重组表达、蛋白纯化等。
（3）对克隆的基因、表达的蛋白进行检测和分析。
四、实训过程1. 实验前准备（1）查阅相关文献，了解实验原理和操作步骤。
（2）配制实验试剂，确保实验用品齐全。
分子生物学与细胞生物学实验基本技术
分子生物学与细胞生物学实验基本技术2005-02实验一组织块培养法一、目的学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。
二、概述组织块培养法是常用的、简便易行和成功率较高的原代培养方法。
可以采用剪切法，即将组织块剪切成小块后，接种于培养瓶，组织小块贴壁24h或更长时间后，细胞就从组织四周游出。
但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞。
用于组织块培养的培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理，如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长。
（本节以新生牛主动脉平滑肌培养为例）三、材料（一）仪器1.净化工作台2.恒温水浴箱3.冰箱（4℃、-20℃）4.倒臵相差显微镜5.培养箱（二）玻璃器皿1.培养皿（Φ100mm）2.吸管（弯头）3.烧杯（500ml、200ml、10ml）4.广口试剂瓶（500ml）5.玻璃瓶（250ml、100ml）6.培养瓶7.废液缸（三）塑料器皿1.吸头2.枪头3.胶塞4.EP管（四）其他物品1.微量加样枪2.眼科组织剪（直尖、弯）3.眼科组织镊（直、弯）4.12.5cm组织镊（无钩、1×2钩）5.25cm敷料镊（无钩）6.止血钳（18cm直纹式、12.5cm直纹式、弯纹式）7.解剖剪（五）试剂1.D-Hanks液2.小牛血清3.RPMI16404.双抗（青霉素、链霉素）5.1N HCl6.7.4%NaHCO3四、操作步骤1.取材：打开胸腔，无菌操作下取出主动脉胸段，浸到预先配制好的含双抗（500u/ml青、链酶素）的D-Hanks液中漂洗。
2.组织的冲洗、修剪：取出主动脉，用锋利的剪刀修剪除去周围组织，再用D-Hanks冲洗主动脉3次，除去血块及杂组织等。
3.平滑肌组织分离：纵向剖开主动脉，撕下主动脉内层，取主动脉中层的平滑肌组织，无血清RPMI1640漂洗3次。
4.剪切：将平滑肌组织用锋利的眼科剪反复剪切至剪成1mm3小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加1～2滴培养液，以保持湿润。
分子生物学基本实验操作
分子生物学基本实验操作1.DNA提取：DNA提取是分子生物学中的基础实验操作，目的是从生物组织或细胞中提取出纯净的DNA样品。
常用的DNA提取方法包括酚氯仿法、盐法和商业化提取试剂盒。
该实验操作通常包括细胞破碎、蛋白质去除、DNA沉淀和洗涤等步骤。
2.PCR：聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中常用的方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR通过加入DNA模板、引物、碱基和聚合酶，利用循环反应的方式在体外合成特定序列的DNA。
PCR通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
3.凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA、RNA和蛋白质的常用方法。
通过将待测样品加载到凝胶中，然后通过电场使DNA、RNA或蛋白质在凝胶中迁移，可以根据迁移速度和分子大小进行分离和定性。
4. Western blot：Western blot是一种用于检测特定蛋白质的方法。
该方法通过将待测样品进行电泳分离，然后将蛋白质转移到膜上，并用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后再用染色剂或化学发光来检测目标蛋白质的存在。
5.DNA克隆：DNA克隆是将DNA片段插入到载体DNA中的过程，用于研究和重组DNA。
常用的DNA克隆方法包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。
通过将DNA片段插入载体中并转化至宿主细胞，可以大量复制目标DNA并随后进行研究。
6.基因测序：基因测序是确定DNA或RNA序列的方法，用于分析基因组、转录组和序列变异。
常用的基因测序方法包括链终止法（Sanger测序）和下一代测序（NGS）。
通过测序，可以获取DNA或RNA的序列信息，并进一步研究基因功能和变异。
7.基因表达分析：基因表达分析通过检测RNA水平来研究基因的表达情况。
常用的方法包括实时定量PCR、Northern blot和转录组测序。
这些方法可以定性和定量地研究基因的表达水平，并帮助解析基因调控和信号通路。
这些是分子生物学的一些基本实验操作。
当然，随着技术和方法的不断发展，分子生物学领域中还有许多其他的实验操作，用于研究生物分子结构和功能。
分子生物学实验一 基础知识和基本技能
安全和纪律教育
实验室安全管理条例 学生实验守则 实验课纪律
基础知识
一、化学试剂的取用
1、固态试剂的取用 2、液态试剂的取用 (1) 量筒量取 (2) 移液枪量取少量或微量的液体 A：移液枪的使用和维护 P27 B：两种移液方法：
前进移液法和反向移液法 P9
移液枪的使用和维护 P27
A管：1.25mL B管：386uL 3、学会使用离心机，将A、B管放入离心机 中，以12000rpm，离心5min。
1、容量设定 2、吸头安装 3、预洗吸头 4、吸液 5、放液 6、卸去吸头 7、调到最大量程，放回原位
播放视频
二、常用灭菌方法 P10
1、高压蒸汽灭菌 、高热灭菌 3、灼烧灭菌 4、过滤除菌 5、紫外线灭菌
三、离心机的使用 P31
1、安装与调试 2、操作程序 3、注意事项
基本实验技能培训
1、学会插枪头和装EP管，准备灭菌 2、学会使用移液器，每组各吸两管液体：
分子生物学实验基本技术
分子生物学实验进程
实验一 真核细胞染色体DNA的分离制备 DNA样品的纯化、定量和电泳检测 实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒转化 实验三 碱变性法小量制备质粒 DNA的限制性酶切 实验四 琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收 质粒DNA的连接和转化 实验五 真核细胞RNA的制备和逆转录PCR 实验六 Western印迹（上） 实验七 Western印迹（下） 实验八 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测 实验九 多聚酶链式反应（PCR）反应 实验十 Northern印迹 实验十一 Southern印迹 考试
1966
1972 1973 1973 1977 1977 1982 1986 2001
Finished unraveling the code; Nirenberg & Khorana
Recombinant DNA made in vitro; P. Berg DNA cloned on a plasmid; H. Boyer & S. Cohen Discovery of reverse transcriptase; H. Temin Rapid DNA sequencing; F. Sanger & W. Gilbert Discovery of split genes; Sharp, Roberts et al. Discovery of ribozymes; T. Cech & S. Altman Creation of PCR; K. Mullis et al. Human Genome Project; Venter, Collins and many others
段连接起来构成一个新的DNA分子的过程。
分子克隆（molecular cloning）：重组体分子的无性 繁殖过程。
分子生物学的实验技术
分子生物学的实验技术【分子生物学的实验技术】分子生物学作为现代生物科学领域的重要组成部分，以其独特的实验技术为研究人员提供了许多强有力的工具。
本文将对分子生物学中常见的实验技术进行介绍，包括DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳、克隆和测序等。
一、DNA提取DNA提取是分子生物学研究的第一步，也是最基本的实验技术之一。
DNA提取的目的是从生物样本中分离出DNA，并纯化得到高质量的DNA溶液，以便后续实验使用。
常用的DNA提取方法有酚/氯仿法、离心柱法和磁珠法等。
酚/氯仿法是一种传统的DNA提取方法，它利用酚和氯仿的不同密度分离DNA。
首先，将生物样本与裂解缓冲液混合并加入酚/氯仿混合液，通过离心分离出DNA在上层的细胞碎片，然后进行酚/氯仿再萃取和乙醇沉淀，最后得到纯化的DNA。
离心柱法是一种高效的DNA提取方法，它利用离心柱上的纤维素膜或硅胶膜对DNA进行捕获和纯化。
在这种方法中，生物样本与裂解缓冲液混合后，加入离心柱进行离心，DNA能够通过纤维素膜或硅胶膜的作用被固定，而其他杂质则被洗脱掉，最后用纯化缓冲液洗脱得到高质量的DNA。
磁珠法是一种快速、高通量的DNA提取方法，它利用表面修饰的磁珠对DNA进行特异性捕获。
在这种方法中，生物样本与裂解缓冲液混合后，加入磁珠混悬液，并利用磁力使磁珠与DNA结合，然后用磁力将磁珠与DNA一起沉淀到管壁上，洗脱杂质后得到纯化的DNA。
二、PCR扩增PCR（聚合酶链式反应）是一种用于体外扩增DNA的技术，通过反复的循环性温度变化，可以扩增特定的DNA片段。
PCR由于其高度敏感和高效性，被广泛应用于基因分型、基因定量、基因突变分析等领域。
PCR反应的基本组成包括DNA模板、引物、聚合酶、四种脱氧核苷酸和缓冲液。
首先，将DNA模板与引物、脱氧核苷酸和缓冲液混合，并添加聚合酶，然后进行多次温度循环，包括变性、退火和延伸等步骤，从而使DNA模板经过反复扩增，最后得到目标DNA片段的数量大幅增加。
分子生物学实验技术与操作规范
分子生物学实验技术与操作规范分子生物学实验技术与操作规范是在分子生物学实验中必须遵循的一系列准则和步骤。
这些规范旨在确保实验的准确性、可重复性和安全性。
本文将介绍分子生物学实验中常用的技术和操作规范。
一、引物设计与合成引物是在PCR反应中用于扩增目标DNA片段的短寡核苷酸序列。
引物的设计应遵循以下原则：引物长度应在18-25个碱基对之间，GC含量应在40-60%之间，避免引物间的互补性和自身互补性。
合成引物时应选择可靠的供应商，并进行质量检测。
二、核酸提取核酸提取是从生物样本中提取目标DNA或RNA的过程。
常用的核酸提取方法包括酚-氯仿法、盐析法和商用试剂盒法。
在进行核酸提取前，必须严格遵守实验室的安全操作规范，佩戴手套和口罩，避免污染。
三、PCR扩增PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA片段的技术。
在进行PCR反应时，应注意以下几点：准备反应液时要避免污染，使用无菌的试剂和器具；设置阳性对照和阴性对照以验证实验结果的准确性；选择合适的PCR条件，包括温度和时间参数。
四、凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的分离和检测DNA或RNA片段的方法。
在进行凝胶电泳前，应先准备好琼脂糖凝胶和电泳缓冲液。
电泳时要注意以下几点：将样品加入凝胶孔中时要避免气泡的产生；设置适当的电压和电泳时间以获得清晰的电泳带；使用DNA分子量标记物来确定目标片段的大小。
五、蛋白质表达与纯化蛋白质表达与纯化是研究蛋白质功能和结构的重要步骤。
在进行蛋白质表达时，应选择合适的宿主细胞和表达载体，并进行优化实验条件。
在蛋白质纯化过程中，常用的方法包括亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析。
在进行蛋白质表达与纯化实验时，应注意操作的无菌性和安全性。
六、基因克隆基因克隆是将目标基因插入到载体中的过程。
常用的基因克隆方法包括限制性内切酶切割、连接反应和转化。
在进行基因克隆实验时，应注意以下几点：选择适当的限制性内切酶和连接酶，并进行酶切和连接的优化实验；使用无菌的试剂和器具，避免污染；进行正反向测序以验证插入的正确性。
分子生物学常用实验技术及方法
第二章常用实验技术及方法一、聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）反应总体积为50讥其中含有：模板DNA 0.5 dPCR缓冲液（不含MgCl2）5止10XMgCl2 溶液5止dNTP (2.5 mmol/L) 0.5 1卩引物 1 (50 umol/L) 0.5 k引物 2 (50 umol/L) 0.5 kTaq DNA 聚合酶0.5 l无菌去离子水加至50 d上层用25 d液体石蜡油覆盖。
循环参数为：94 °C变性10 min94 C变性 1 min56 C退火 1 min72 C 延伸 2 min共30个循取环，PCR结束后，取2 dPCR扩增产物，经1 %琼脂糖凝胶电泳，在紫外检测仪上观察并拍照。
二、基于PCR技术的定点突变1.根据所要突变位点的特定氨基酸，并按公认的四引物法原理，分别设计上下游引物Primer 3和Primer 4，这两条引物部分交错互补，但分别含有欲突变后的碱基（红点）的互补序列（如下图所示）；P1# 严—k *—P3 P42.用基因5'端的Primer 1和Primer 2 PCR扩增DNA片段1，用基因3'端的Primer4和Primer 3 一起PCR扩增DNA片段2，PCR反应条件基本如上（七、聚合酶链反应），可根据具体实验略有调整，反应完毕后，分别电泳回收DNA片段1和DNA片段2；3.以片段1和片段2为模板，进行第二次PCR反应，反应体系为50止:片段1 1 d片段2 1 d10XPCR缓冲液(不含MgCl2) 5 d1O0lgCl2溶液 5 ddNTP (2.5 mmol/L) 5 dlTaq 酶 1 dl力加ddH2O至50 d在该反应体系中先不加入引物，按上述反应条件进行 10个循环，然后再加入Primer 1和Primer 4各1 ul，按上述反应条件再扩增30个循环；4.PCR 产物经电泳检查，然后连接到相应的载体中，进行测序以确定定点突变的正确性。
分子生物学实验教学教案
分子生物学实验教学教案一、实验原理及目的1. 实验原理：介绍PCR（聚合酶链反应）的原理及应用。
解释DNA提取、扩增和测序的基本步骤。
说明基因克隆、表达和纯化的过程。
2. 实验目的：让学生掌握PCR技术的操作步骤和技巧。
培养学生对DNA提取、扩增和测序的基本能力。
培养学生进行基因克隆、表达和纯化的实验技能。
二、实验材料及试剂1. 实验材料：学生分组，每组一份实验材料套装，包括DNA模板、引物、酶、dNTPs等。
2. 实验试剂：PCR反应混合物（含PCR缓冲液、酶、引物、dNTPs）DNA提取试剂盒琼脂糖凝胶核酸染料电泳缓冲液转移缓冲液洗涤缓冲液三、实验步骤及注意事项1. 实验步骤：按照实验材料及试剂的准备要求，准备实验所需的材料和试剂。
按照实验原理，进行PCR反应、DNA提取、扩增和测序等实验操作。
观察并记录实验结果，进行数据分析和解释。
2. 注意事项：实验操作过程中要严格遵守实验室安全规定，佩戴好个人防护装备。
在进行PCR反应时，要准确控制温度和时间，避免非特异性扩增。
在操作DNA时，要避免核酸的降解和污染。
四、实验结果与分析1. 实验结果：观察PCR反应后的琼脂糖凝胶电泳结果，记录DNA条带的大小和亮度。
分析DNA提取、扩增和测序的结果，确定目标基因的存在和序列。
2. 结果分析：根据实验结果，分析实验操作的准确性和可行性。
比较不同实验条件下的结果，探讨实验条件的优化方法。
结合理论知识，解释实验结果的生物学意义。
1. 实验报告内容：实验目的、原理和步骤的概述。
实验材料和试剂的使用情况。
实验结果的描述和数据记录。
实验结果分析的结论和讨论。
报告要条理清晰，语言简练，数据准确。
结果图要清晰，图例说明详细。
报告要包括实验操作中的问题和解决方法。
报告要结合实验结果，提出实验现象的解释和相关问题的讨论。
六、实验技能与技巧训练1. 实验技能：培训学生进行PCR反应的技巧，包括DNA模板的制备、引物的设计、反应混合物的配置等。
细胞分子生物学实验训练小结
细胞分子生物学实验训练小结引言在细胞分子生物学实验训练中，我们研究了一系列关于细胞和分子生物学的实验技术和方法。
本文档将总结我在实验过程中的研究体会和收获。
实验一：DNA提取DNA提取是细胞分子生物学中的一项重要技术，通过提取DNA可以进行后续的分子实验。
在实验中，我们首先研究了DNA 的结构和组成，研究了DNA提取的原理和方法。
通过使用DNA提取试剂盒进行实验操作，我们成功地从植物和动物组织中提取到了DNA。
这个实验让我深刻理解到DNA的重要性和其在生物学研究中的应用。
同时，也锻炼了我的实验操作技能和仔细观察的能力。
实验二：PCR扩增PCR扩增是一种常用的DNA分子生物学技术，可以快速扩增目标DNA序列。
在实验中，我们研究了PCR的原理和步骤，并进行了PCR反应的实验操作。
通过这个实验，我对PCR技术有了更深入的理解。
我学会了设计PCR引物，调节反应条件并分析PCR产物。
这个实验让我进一步认识到PCR技术在细胞分子生物学研究中的广泛应用，并加深了对PCR实验的熟悉程度。
实验三：凝胶电泳分析凝胶电泳是一种常用的分子生物学实验技术，用于分析DNA 或RNA分子的大小和纯度。
在实验中，我们研究了凝胶电泳的原理和操作步骤，并进行了样品电泳分析。
通过这个实验，我学会了制备琼脂糖凝胶，加载样品并运行电泳。
同时，我还学会了根据电泳图谱解读样品中的目标分子大小和纯度。
这个实验让我对凝胶电泳技术更加熟悉，并加深了对分子生物学分析方法的理解。
实验四：克隆与表达克隆与表达是细胞分子生物学中的重要技术，用于研究基因的功能和调控机制。
在实验中，我们研究了克隆和表达的基本原理和方法，并进行了相关实验操作。
通过这个实验，我学会了设计克隆实验的引物和载体，进行DNA片段的连接和转化，以及表达载体的构建和转染。
这个实验不仅巩固了我对PCR和凝胶电泳技术的掌握，还让我对基因克隆和表达的步骤和技术要点有了更深入的了解。
结论在细胞分子生物学实验训练中，我通过研究和实践，掌握了DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳分析以及克隆与表达等基本实验技术。
分子生物学实验技术
分子生物学实验技术分子生物学是现代生物学的重要分支之一，其在疾病预防、治疗和生物科技等方面有广泛应用。
本文将介绍分子生物学实验中常用的技术，并讨论其原理和应用。
一、基本实验技术1. DNA/RNA提取技术DNA/RNA提取是分子生物学实验中的基础技术之一。
DNA/RNA提取的目的是从细胞或组织中提取高质量的DNA或RNA，为其后续检测和研究做好准备。
现在市场上有多种DNA/RNA提取试剂盒，供实验室使用。
通常，提取DNA首先将组织/细胞裂解，然后进行蛋白质沉淀、DNA沉淀、洗涤和重溶等步骤。
而提取RNA则需要防止RNA酶的污染并保护RNA的完整性。
RNA提取常见的方法是直接裂解和三步酚-氯仿法等。
2. PCR技术PCR（聚合酶链式反应）技术是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
PCR反应是在一个热循环下进行的，包括退火、结合和扩增阶段。
其中，退火温度用于将引物与靶DNA结合，获得高特异性；扩增阶段用于扩增目标DNA片段，通常在72℃左右进行。
PCR技术广泛应用于疾病的诊断、基因多态性分析、DNA指纹鉴定和基因工程等方面。
对于基因工程，PCR技术在基因克隆、定量PCR、mutagenesis、突变扫描和芯片检测等方面也有重要应用。
3. 转染技术转染技术是指将外源基因或其他化合物转入目标细胞中的技术。
常用的转染方法包括：病毒介导的转染、电穿孔、化学转染及基于脂质体的转染等。
转染技术在基因治疗、模型建立、基因表达分析、药物筛选和基因敲除等方面都有广泛应用。
二、高级实验技术1. 基因测序技术基因测序是分子生物学中应用最广泛的技术之一，用于确定DNA序列。
常用的基因测序技术包括Sanger测序和新一代测序（NGS）技术。
Sanger测序是一种传统的测序技术，通过DNA聚合酶、DNA模板、引物和ddNTPs（二脱氧核苷三磷酸）来扩增和定序DNA。
此外，NGS技术的基本原理是平行测序，利用高通量测序技术对DNA样本进行重复测序，得到高质量的DNA序列。
分子生物学研究中的基础实验技术介绍
分子生物学研究中的基础实验技术介绍分子生物学研究在基础科研和生命医学研究中扮演着重要的角色。
飞速发展的分子生物学研究技术以其高效、精准、可重复性的特点成为了生命科学家的必备工具。
让我们一起来了解几种分子生物学研究中的基础实验技术。
1. DNA/RNA提取技术DNA/RNA提取是分子生物学研究的第一步，是从生物样品中获取纯度高的DNA或RNA的方法。
此技术可以应用于蛋白质鉴定、基因组测序和表观遗传学等领域。
常用的DNA提取方法有酚-氯仿法、盐析法和列柱法等。
其中酚-氯仿法简单易行，适用于DNA纯化和分子生物学操作；盐析法适用于大量的DNA提取；列柱法纯度高，适用于对高纯度DNA样品的分离。
RNA提取方法有TRIZOL法、琼脂糖纯化法和磁珠分离法等。
其中TRIZOL法适用于处理多样本，在样品处理时间短、批量大的情况下性能最佳；琼脂糖纯化法操作简单、成本低，适用于处理样品量小且同时提取RNA和蛋白质；磁珠分离法成本较高，但是它的效率和纯度都较高，可以用于小样本RNA提取和mRNA 纯化。
2. PCR技术PCR技术是基于DNA复制和扩增的技术，可用于DNA序列特异性检测、测序、基因表达分析和基因编辑等应用领域。
PCR技术是利用DNA聚合酶的反复循环态增加目标DNA分子的过程，从而扩增目标DNA分子，它是分子生物学研究中必须熟练掌握的基本操作之一。
PCR反应至少含有数量合适的引物、5'磷酸化的DNA模板、聚合酶、核酸酶抑制剂（RNase inhibitor）等组分。
PCR的引物选择是扩增成功的关键，匹配、降寶和引物长度的选择都会影响PCR扩增结果的可靠性。
3. 南方杂交南方杂交是一种测定核酸序列间同源性和差异性的分析方法，适用于在DNA或RNA样品中检测突变、重排和拷贝数变异等事件。
该方法在医学、生态、植物学和动物学等领域应用广泛。
南方杂交技术的基本原理是利用蛋白质-核酸之间的特异性结合，检测序列相似性。
分子生物学常用实验技术(精)
分子生物学常用实验技术第一章质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定第二章 DNA酶切及凝胶电泳第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第四章 RNA的提取和 cDNA 合成第五章重组质粒的连接、转化及筛选第六章基因组 DNA 的提取第七章 RFLP和 RAPD 技术第八章聚合酶链式反应 (PCR扩增和扩增产物克隆第九章分子杂交技术第十章测序技术第一章质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定第一节概述把一个有用的目的 DNA 片段通过重组 DNA 技术 , 送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体 (Vector。
细菌质粒是重组 DNA 技术中常用的载体。
质粒 (Plasmid是一种染色体外的稳定遗传因子 , 大小从 1-200kb 不等 , 为双链、闭环的 DNA 分子 , 并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力 , 能在子代细胞中保持恒定的拷贝数 , 并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活 , 而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性 , 如对抗生素的抗性等。
F 质粒 (又称F 因子或性质粒、 R 质粒 (抗药性因子和 Col 质粒 (产大肠杆菌素因子等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型 :紧密控制型 (Stringent control和松驰控制型 (Relaxed control 。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制 , 当染色体不复制时 , 它也不能复制 , 通常每个细胞内只含有 1个或几个质粒分子 , 如 F 因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制 , 在每个细胞中有许多拷贝 , 一般在 20个以上 , 如 Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂 -氯霉素时 , 细胞内蛋白质合成、染色体 DNA 复制和细胞分裂均受到抑制 , 紧密型质粒复制停止 , 而松驰型质粒继续复制 , 质粒拷贝数可由原来 20多个扩增至 1000-3000个 , 此时质粒 DNA 占总DNA 的含量可由原来的 2%增加至 40-50%。
第03章 分子生物学实验基本操作技术
第3章分子生物学实验基本操作技术这里的实验基本操作技术是指在分子生物学实验中使用范围最广、使用频率最高、几乎所有实验都要应用的技术。
器皿的清洗，试管、量筒（杯）、容量瓶、吸管及移液器、电子天平等量具的正确操作和使用、试剂配制等技术，应当都是基本操作技术，但这些内容已在分析化学、生物化学的实验课程中作了详细介绍。
本章主要介绍与分子生物学实验有关的除（灭）菌技术、无菌操作技术和微量操作技术。
3.1 除(灭)菌技术在进行分子生物学实验过程中，需要一个清洁的实验环境，所使用的器皿及溶液均需要进行除（灭）菌处理，一方面避免环境中微生物的污染，另一方面还可消除蛋白酶和核酸酶对实验的干扰和影响。
在进行微生物及细胞的纯培养时要求更高，不能有任何外来杂菌。
因此，对所有器材、培养基要进行严格灭菌，对工作场所进行消毒，保证工作顺利进行。
实验室常用的除灭菌方法主要有物理方法及化学方法两种。
物理方法包括用湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线、过滤、离心沉淀等方法除去微生物；化学方法是使用化学消毒剂、抗菌素等杀死或抑制微生物。
根据被灭菌物品的材料性质和实验要求，可采取不同的消毒灭菌方法。
3.1.1 物理灭菌法（1）干热灭菌：干热灭菌包括火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。
火焰灼烧适用于金属用具，如接种环、接种针和手术器械等，玻璃器皿的口颈，如试管口和瓶口，玻璃棒等的灭菌处理。
这种方法灭菌迅速彻底。
热空气灭菌一般在烤箱中进行，利用高温干燥空气（160℃~170℃）加热灭菌1~2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。
干热消毒后的器皿干燥，易于保存。
缺点是干热传导慢，可能有冷空气存留于烤箱内，因此要求较高的温度和较长的时间才能达到消毒的目的。
应当注意，干烤灭菌完毕后不得马上将烤箱门打开，须等温度降至70℃以下时再开箱门，以免冷空气突然进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。
在灭菌时，物品不能放的太挤。
灭菌的玻璃器皿中不可有水，有水的玻璃器皿在干热灭菌时容易炸裂。
生物学本科生必须练就的分子生物学实验基本功
生物学本科生必须练就的分子生物学实验基本功LI Hong-min;LI Dong-min;BU Huai-yu;XU Min;YU Yuan;LI Zhong-hu;CUI Ji-hong【摘要】分子生物学实验技能是现代生物学专业人才培养质量的重要衡量指标.为了切实提高学生的分子生物学实验技能,文章以充分调动学生学习主体作用为出发点,指出熟练使用常规仪器设备、正确配制溶液、透彻理解实验原理与实际应用价值、仔细观察与分析、正确判读分析实验结果等能力,是现代生命科学和医学生物学专业本科生必须具备的分子生物学实验基本功,更是发掘创新型人才、培养高层次人才的根基.【期刊名称】《高等理科教育》【年(卷),期】2019(000)001【总页数】8页(P81-88)【关键词】分子生物学;实验;操作技能;分析能力【作者】LI Hong-min;LI Dong-min;BU Huai-yu;XU Min;YU Yuan;LI Zhong-hu;CUI Ji-hong【作者单位】;;;;;;【正文语种】中文【中图分类】G642.423一、引言分子生物学是以研究核酸、蛋白质、脂质等生物分子的结构、功能及其相互作用，在分子水平揭示生命现象本质的一门学科[1]。
经过半个多世纪的迅猛发展，分子生物学方法与技术已经被广泛应用于植物学、动物学、微生物学、病毒学、神经生物学、肿瘤学、病理学等生物学相关领域，并成为这些学科研究纵深发展不可或缺的技术与方法支撑[2]。
因此，国内外高校十分重视生物学专业学生的分子生物学实验技能培养，从上世纪80年代起即相继面向研究生、本科生开设分子生物学培训班或实验课，在生物学及相关专业人才培养和推动生物学研究方面成绩斐然。
为提高分子生物学实验教学效果，针对分子生物学实验课程体系建设，多样化和现代化的教学方法与手段(如自主设计实验、教学与科研相结合、网络教学等)的使用，实验室建设与仪器设备的配置以及教材选择与编写[3-5]，实验内容的设置、实验材料的选择、实验时间的安排、实验室安全管理以及教学改革等[6-8]，国内教学科研人员均开展了广泛深入的研究，极大地推动了国内科研院所生物学本科生分子生物学实验教学的发展。
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型 号：cheni genins 制造商：SYNGENE
（英国）
未污染
离心技术
（高速冷冻离心机）
➢离心机工作规则：
1、检查离心管是否完好，不要使用有裂缝的离心管。 即使极小的裂缝也会在离心力作用下破裂。
2、每次使用前都要检查转子中是否有别人遗留的离心 管。转子中遗留的离心管可能导致离心机不平衡。
分子生物学实验 基本技术训练
➢PCR技术 ➢电泳技术 ➢离心技术 ➢微量移液技术 ➢无菌操作技术 ➢实验记录与实验报告的书写
PCR技术
（多聚酶链式反应）
PCR是采用分子技术模拟核酸在体内的复 制，实现DNA体外扩增，以获得大量DNA片 段供研究需要。
反应过程：
❖ 94℃ 4min ❖ 94℃ 30S ❖ 50℃ 30S ❖ 72℃ 60S ❖ 72℃ 10min ❖ 4℃ 保存 ❖ End
型 号：MiniSpin 制造商：Eppendorf
（德国）
型 号：3-18K 制造商：SIGMA
（德国）
微量移液技术
➢量液操作注意问题：
（1）不能移取量程以外体积的液体，否则会损坏移液 器。
（2）吸取液体时，先推至第一档在吸取；释放液体时 ，在第一档停顿1-2s后推至终点。
（3）吸取液体时不能太快。如果不小心将液体吸入吸 液杆应报告指导老师，经清洗后方可再用。
30个循环
型 号：PTC-100 制造商：MJ Research
(美国)
电泳技术
（琼脂糖电泳）
分类：
琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 醋酸纤维膜电泳 ……
常用
➢琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶的异同
聚合方式 电泳方式
毒性 适用对象 操作要求
孔径
琼脂糖凝胶 物理作用 平板 无毒 大分子 简单
与浓度成反比
聚丙烯酰胺凝胶 化学反应 垂直板 神经毒性 小分子 较难
与浓度成反比
➢琼脂糖凝胶浓度与线性DNA的 最佳分辨范围
琼脂糖浓度 线性DNA的最佳分辨范围（bp）
0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0%
1，000～30，000 800～12,000 500～10,000 400～7,000 200～3,000 50～2,000
❖ 电源：稳压、稳流、稳功率。
❖ 样品制备 （1）适用于琼脂糖电泳的样品可以是基因组DNA、
质粒和PCR产物等大分子。
（2）样品必须与上样缓冲液混合均匀，以保证样品 带电荷。
❖ 琼脂糖凝胶的制备 （1）将铺胶槽调成水平。
（2）准确称取一定质量的琼脂糖放入锥形瓶中， 量取30ml 1×电泳缓冲液倒入锥形瓶，瓶口倒扣 一个小烧杯。
3、将平衡的离心管对位放置，盖好转子盖。如果离心 启动后发现转子盖没盖，应停止离心，盖上转子盖后 再启动。
4、离心完成后应立即从离心机内取走样品。离心结 束后若样品长时间留在离心机里。会沉淀重新分 散开。
5.低温离心机在两次运行之间应关上盖子，以避免冷 凝。
6.每一次使用完离心机后都要将离心机内部清理干净 并填写使用记录。
在DNA双螺旋结构中碱基处于双螺旋结 构的内部，呈平面结构，垂直于螺旋轴成对排 列。糖基—磷酸脂基构成主链暴露在外表面， 并带有磷酸脂基的负电荷。 DNA分子电泳时 的迁移速度与凝胶孔径和所带电荷量成正比， 与分子大小成反比。
➢操作过程
❖操作前的准备
（1）标准分子质量标记（Marker）
Marker是一组固定的分子量的样品混合物，经电泳后 各成分会按照分子量大小进行排列。标准分子质量 标记作为样品的参照标准应与样品同时电泳。如： 1Kb DNA Marker：1000，2000，3000，4000，5000， 6000，7000， 8000，10000。
（4）使用完后，一定要将移液量调至最大量程，以免 压缩弹簧导致弹簧不能回复。
（5）移液器必须卸掉枪头后才能放在移液器架上。
➢各种酶等溶液的移取问题
分子生物学中由于移取试剂体积较小可以 使用微量移液器先将试剂（如引物,缓冲液等） 分别加到管壁上，加完之后通过点动离心,使液 体聚到管底，然后轻弹管底使之充分混匀。
❖注意事项：
（１）制胶槽要调成水平 （２）加样时移液器头不要插破胶孔。 （３）加样的体积不要大于胶孔的体积。 （４）琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。 （５）在电泳时，电泳缓冲液应略高于琼脂糖凝胶
面，琼脂糖凝胶点样口应放在电泳槽负极一侧。 （6）不要用手直接接触凝胶及凝胶成像仪内部。
型 号：Power Pac Basic TM 制造厂：BIO-RAD
❖ 样品缓冲液： 盐类（维持样品）、甘油（增加重量从而使样品下沉至 点样孔）、以及示踪染料（以便监测电泳进程）。例如 6×Loading Buffer：30%(v/v)甘油，0.25%（w/v) 溴 酚蓝，0.25%（w/v)二甲苯腈蓝，蒸馏水配置。
❖ 电泳缓冲液： 凝胶中所加的缓冲液应该与电泳槽中的相一致． 琼脂糖凝胶电泳最常用的缓冲液是TAE (Tris-醋酸－ EDTA）与TBE (Tris-硼酸－EDTA）。
分子生物学反应体系中的酶要最后加入到体 系中.
无菌操作技术
➢器材包扎
1、三角瓶至少留1/3空间，先盖透气膜，后盖报 纸，线绳缠好。 培养时不能覆盖报纸，透气膜用完后回收。
2、枪头盒、EP管盒、培养皿要用报纸包好。 3、离心筒将盖旋紧后回旋半圈，报纸包扎。
❖加样和电泳
（１）取一只PE手套，用移液器在上面点上上样 缓冲液，然后取样品使其与上样缓冲液混合均匀 点在胶孔中。
（２）标准分子量标记直接点在胶孔中。
（３）盖好电泳槽盖，正确连好导线。
（4）在电泳时，为了获得电泳分离DNA的最大 分辨率，电场强度不应高于5 示剂距凝胶前沿约1cm是停止电泳。 （２）关闭电源，取出凝胶，放入凝胶成像仪观察。
（3）将锥形放入微波炉中加热煮沸3次至琼脂糖全 部融化透明，摇匀。加热时避免凝胶溶液爆沸。
（4）待凝胶冷却至50～60℃时加入染料，混匀 后匀速倒入胶托中。倒胶时避免温度过低防止 凝胶凝固结块或出现气泡。若凝胶出现气泡则 不允许使用。
（5）小心将梳子插在胶托中，待凝胶完全凝固 后再拔出梳子。
（6）将凝胶放入电泳槽中，并向电泳槽中倒入 1×电泳缓冲液，液面高过胶面2～5mm。