Nature Genetics上的肠道菌群GWAS研究是怎么做的

Nature Genetics上的肠道菌群GWAS研究是怎么做的

木子君

肠道菌群与人类健康的密切关系越来越受到重视，已经成为时下最热门的研究方向之一。被称为人类“第二基因组”的肠道菌群除了受到环境、饮食、疾病等因素的影响以外，还在一定程度上受到遗传因素影响，也就是说肠道微生物会受到宿主基因的控制。例如已报道的乳糖编码基因（lactase gene，LCT）与双歧杆菌的关联性(Goodrich, Davenport et al. 2016)。尽管这种概念已被广泛接受，但是基于GWAS的肠道菌群研究还很有限，到底有多少微生物受到宿主基因的影响，以及这种关联如何影响健康和疾病的发生，都非常值得研究。

那么一篇肠道菌群的GWAS研究如何做，怎样才能发到高水平的期刊呢？今天就以2016年发表在Nature Genetics上的一篇文章为例，讲讲肠道菌群的GWAS研究思路。

Genome-wide association analysis identifies variation in vitamin D receptor and other host

factors influencing the gut microbiota

本文主要利用1812人样本集进行GWAS研究，发现了一系列影响肠道菌群induvidual bacteria 和β-diversity的SNP。之后针对VDR基因上的SNP为例，研究了该基因影响肠道微生物的机制。

大致可以把这篇文章的思路分为三步：

下面我们看看作者如何一步步有理有据地走下来。

第一步：全基因组关联分析

本文的数据来自两个人群（PopGen和FoCus），共1812个样本有肠道微生物的16S测序以及SNP芯片数据。同时还有性别，年龄，吸烟状况，饮食情况等一些对于肠道微生物有影响的环境因素数据。

1. 前期处理

1.1 协变量

在做关联分析之前，要先确定协变量，校正其他因素对于肠道微生物的影响。经过相关性分析发现年龄，性别，吸烟，饮食等情况对于肠道微生物的影响都是显著的（图1），因此都被纳入关联分析作为协变量。

1.2微生物筛选

其次对于微生物信息也做了一些筛选。16S测序得到了38个门和174个属的丰度信息，但是有的分类单位丰度非常低，在实验中的稳定性很差。因此作者设计了一个实验：对于10个样本做三次测序的技术重复，并计算两两重复之间的相关性。发现reads大于40时技术重复的相关性r2达到0.97（图2），因此将低于40的分类单位都去除了。最终剩下58个分类单元（core measurable microbiota）用于后期关联分析。

1.3 人群分层

关联分析之前的质控，要检验样本是否有人群分层。根据计算总体的λGC = 1.00，因此没有人群分层（图3）。后面关联分析时还是将遗传的前3个主成分作为了协变量进行了校正。

1.4 关联分析

样本: n=1812（FoCus + PopGen）

微生物数据: 58个分类单元和40个40 species-level OTUs.

SNP: MAF >0.05 , IMPUTE2 INFO criteria >0.8.

模型: 负二项分布模型.

协变量: BMI, 年龄,性别,遗传主成分1-3, 饮食因素

结果：找到40个与单个微生物显著关联的位点，对于22个bacteria；42个与β-diversity 显著关联的位点，其中21个在独立的肥胖样本中验证。（见下图）

2. 目标位点和基因筛选

接下来，作者只选了一个位点rs7974353以及其对于的基因—VDR。这个位点并不是两个关联分析的交集（只在β-diversity关联分析中是显著的），也并不是top显著的位点。VDR基因是VitaminD受体基因，而在第一组关联分析后的富集分析结果在出现了response to vitamin 以及response to vitamin D response to vitamin A等关键词（图5），而且P值非常显著。提示该基因可能与β-diversity以及某些微生物关联。且根据文献查询结果，该基因的产物会形成VDR-RXR二聚体，VD、微生物的次级代谢产物secondary bile acid等都可以作为配

体与之结合从而发挥功能（图6）。因此作者后面选择该基因作为研究对象。

3. VDR基因功能验证

1. 基因敲除小鼠

在VDR基因敲除小鼠中证明了VDR基因确实会影响肠道菌群的β-多样性（图7）。同时还发现敲除后的小鼠Parabacteroides显著上升（图8），因此VDR与Parabacteroides呈负相关。

2. 结肠活检样本

59个结肠活检样本（case、control），疾病组中VDR上调，相应的Parabacteroides下调，呈负相关，与小鼠实验中一致。此外在该实验中，还发现bile acid代谢相关基因的表达与Parabacteroides的丰富显著相关（图9）。因此提出VDR基因通过影响bile acid代谢来影响肠道微生物（例如Parabacteroides）。下面，就要验证虚线的关系是否成立。

3. 代谢组检测

为了验证bile acid是否与肠道菌群相关，作者取了551个样本检测了血清中的5中bile acid 和fatty acid含量，然后与肠道菌群做相关性分析。发现多数bile acid确实与肠道菌群显著关联，其中bile acid 与Parabacteroides的相关性也是显著的（图10）。

也就是验证了后面一条虚线的关系。

4. 宏基因组测序

为了验证VDR与bile acid 代谢的相关性，作者选取了122个样本做了肠道菌群的全宏基因组测序，组装得到基因和通路的丰度，并选出与bileacid代谢相关的基因。发现VDR genotype 也显著影响肠道微生物中VDR代谢通路的基因丰度（图11）。