微生物工程实验指导2009
微生物工程实验报告
实验1 培养基的配制和灭菌一、目的要求1.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。
2.了解几种灭菌方法，掌握高压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。
3.熟悉菌种分离筛选的前期准备工作及操作方法。
4.每2人一组，每人一份实验报告。
二、实验材料1.药品：酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、葡萄糖、KNO3、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、1N HCl、1N NaOH2.设备：高压蒸汽灭菌锅、紫外线灭菌灯、75%酒精棉。
3.材料：天平、药匙、电炉、pH 试纸、烧杯、量筒、5mL、10mL 注射器、玻璃棒、试管、培养基、吸管、移液器（1mL 0.2mL）、牛皮纸、线绳、标签等。
三、实验内容(一) 培养基的配制1．培养基的配制方法和步骤1)称量：按照配方正确称取所需药品放于烧杯中。
2)溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。
3)调pH 值：用1N NaOH 或1N HCl 调pH，用pH 试纸对照。
4)加琼脂溶化：加热过程要不断搅拌，可适当补水。
5)分装：注意不要污染试管塞或纱布。
6)包扎成捆：用记号笔注明何种培养基。
7)灭菌：在高压锅中， 115 °C 高温灭菌30min。
2．培养基的配制A.富集培养基（液体）：海水2216E 液体培养基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉1.0，海水1L，pH 8.0。
取50mL 分装250mL 三角瓶后，8 层纱布封口，外包1层牛皮纸，121℃，高温灭菌20min。
B. 2216E 斜面（固体）：海水2216E 液体培养基中加入2%的琼脂粉，加热溶化琼脂，每支试管内。
加入3mL，121℃高温灭菌20min，灭菌后摆斜面。
C. 无菌生理盐水和保种液：生理盐水： NaCl 0.85% 蒸馏水配制。
每支试管加入5mL，盖上试管帽、包扎、121°C 高温灭菌20min。
保种液：生理盐水，加25%甘油D. 碳源优化培养基：以海水2216E 液体培养基（蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，磷酸铁0.01%，人工海水，pH7.6）为基础，碳源分别是：葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠、乳糖，每种碳源的添加量为1%。
《微生物技术大实验》实验指导
《微⽣物技术⼤实验》实验指导《微⽣物技术⼤实验》实验指导（适⽤专业：11级本科⽣物技术微⽣物学⽅向）柯野编韶关学院英东⽣命科学学院2014年实验⼀、重组毕⾚酵母发酵表达蛋⽩酶及其初步鉴定⼀、实验⽬的1、学习重组毕⾚酵母培养基产物表达的⽅法。
2、学习发酵过程中菌体浓度的测定。
3、学习表达的重组蛋⽩酶的鉴定及其酶活的测定。
⼆、实验内容1、毕⾚酵母的菌体⽣长和诱导表达的培养基的制备。
2、重组毕⾚酵母⽣长菌体曲线的测定。
3、对重组毕⾚酵母⼯程菌株的诱导表达。
4、对重组毕⾚酵母⼯程菌株的诱导表达发酵液的酶活测定。
5、SDS-PAGE鉴定重组蛋⽩酶。
三、实验原理蛋⽩酶是催化蛋⽩质化合物中肽键⽔解为⼩肽或氨基酸的⼀类酶总称，⼴泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实及微⽣物中，并且对⽣物体的⽣理调控、催化各种代谢反应等⽅⾯具有重要的作⽤。
蛋⽩酶是⼀类重要的⼯业⽤酶，约占整个⼯业⽤酶量60%以上；⼴泛应⽤于⾷品加⼯、⽪⾰、医药和化⼯等⾏业。
由于蛋⽩酶具有⼴泛的⼯业、⾷品和医药等⽅⾯的应⽤价值，⽬前⼯业上需求量⼤。
植物中提取的蛋⽩酶主要是中性蛋⽩酶。
植物蛋⽩酶⽣产依赖于植物种植，这易受到季节、地理、⽓候等多因素的影响致使来源不稳定。
动物源性蛋⽩酶多从⽜、⽺和猪等的胰脏中提取⽽得。
动物来源蛋⽩酶⽣产成本较⾼，并受到世界动物保护协会和⼈员的强烈反对，⽬前主要⽤于医药⽅⾯。
因此，动植物源蛋⽩酶不能满⾜当代⼯业的需要。
微⽣物源蛋⽩酶⼏乎具有所有植物和动物来源蛋⽩酶的应⽤特性，成为了⽬前的蛋⽩酶的重要来源。
据统计，微⽣物蛋⽩酶占据了世界蛋⽩酶销售⼤约70%以上的份额。
⽬前商业化的蛋⽩酶主要来源于芽孢杆菌，中性蛋⽩酶来⾃植物⽊⽠，⽽来源于真菌的极少。
⽬前，国内外学者对来源于霉菌的蛋⽩酶的研究主要集中于通过优化固体(或者液体)发酵来提⾼蛋⽩酶的产量或通过分离纯化其产⽣的部分酶进⾏性质研究；⽽优化发酵条件很难⼤幅度提⾼蛋⽩酶产量，且发酵过程易受多种因素(如易污染或菌株⽣长状态)影响。
微生物学类实验指导书(下)
实验一产酶微生物的分离、纯化与选育酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。
由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。
目前，能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。
通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。
1. 淀粉酶产生菌的分离与纯化1.1 实验目的学习从自然界中分离淀粉酶产生菌，并进行分离与纯化。
1.2 实验原理淀粉是由葡萄糖通过α-1，4糖苷键构成的直链淀粉和α-1，6位有分支的支链淀粉组成的。
按照水解淀粉方式的不同，主要的淀粉酶可分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和解枝酶（或异淀粉酶）4大类。
产淀粉酶的微生物有细菌、霉菌和酵母菌等。
利用淀粉遇碘液变为蓝色的特性，将分离的芽孢杆菌（或其他微生物）接种在含有淀粉的固体培养基表面进行培养，利用滴加碘液后菌落周围出现的透明圈判断该菌是否产生淀粉酶及初步判断淀粉酶活力的高低。
1.3实验仪器与材料土壤样品或其他富含淀粉质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、淀粉培养基平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。
1.4 实验方法与步骤1.4.1分离1）采集土壤样品，用无菌水制备1：10土壤悬液；2）取1：10土壤悬液5 ml，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75-80 ℃水浴中热处理10min，以杀死非芽孢细菌；3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置，于30-32 ℃培养24-48 h；4）对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。
微生物工程实验指导
微生物工程实验指导 田沈 范黎 杨秀山编首都师范大学生命科学院微生物系2005年8月目 录实验一 土壤中稀有放线菌的分离和纯化 (3)实验二 抗生菌的体外鉴别 (6)实验三 淀粉质原料的酒精发酵 (9)实验四 四环素的定向发酵及效价测定 (15)实验五 菌种保藏 (18)实验六 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的原生质体融合 (25)附录Ⅰ 实验常用培养基配方及其配制方法 (27)附录Ⅱ 实验中常用试剂的配制 (32)参考书目 (33)实验一 土壤中稀有放线菌的分离和纯化目的1、了解采集土样的要求和方法。
2、掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术。
3、学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。
原理筛选放线菌是新抗研究的重要课题之一。
迄今为止，已发现的抗生素有80%皆来自于放线菌。
放线菌主要存在于土壤中，并在土壤中占有相当大的比例。
一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。
通常，随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。
土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌。
若以常规方法进行分离，得到的几乎全部是链霉菌。
然而，当采用加热处理土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。
由土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法，并通过选用特殊培养基的方法，来获得少量稀有放线菌。
仪器和材料1、培养基：葡萄糖天门冬素琼脂，精氨酸琼脂，高氏1号琼脂，以上每种培养基皆用500ml三角瓶分装250ml。
2、灭菌物品：牛皮纸袋，培养皿，1ml、5ml吸管，250ml三角瓶分装90ml无菌水（含30粒玻璃珠），18×180mm试管分装9ml无菌水，牙签，玻璃刮铲，18×180mm试管中分装10 ml 1‰K2Cr2O7母液。
《微生物与发酵工程实验指导》实验指导
5、实验室应保持肃静，不得谈笑喧哗，不许搞其他动作，以免影响他人实验。
6、清洗仪器、用具、材料时，须将固形物倒入指定容器内，不得直接倒入水槽，以免造成水管堵塞。
7、实验过程中，须按操作规程仔细操作，注意观察试验结果，应及时记录。不得抄写他人的实验实习记录，否则，须重做。如有疑问，应向指导教师询问清楚后方可进行。
冷藏(2～5℃)
成 品
（二）、酸奶制作操作要点
⑴调配与均质 按1:7（14.3g:100ml）的比例加水（水质要求： PH6.5～7.3，硬度≤10度（德国度）），在45～50℃下把奶粉配制成复原牛奶，并加入10%白砂糖及适量（0.4-3.0%）稳定剂变性淀粉（使制成的酸奶口感饱满，粘度高，抗机械剪切力强，使酸乳在输送过程中保持良好状态），高速混料，水合45 ～60min，防止气泡产生。或用市售鲜牛奶加5%蔗糖调匀也可。
2、酵母菌常用培养基
（1）麦芽糖培养基 蛋白胨1%
麦芽糖2%
酵母膏0.5%
琼脂2%
自然pH 121.3℃灭菌20min。
3、霉菌常用培养基
PDA（马铃薯蔗糖培养基） 去皮马铃薯200g切成小块，加水1000ml煮沸30min出汁，三层纱布过滤，滤液中加入2%蔗糖，补充水至终体积1000ml，加琼脂2%，自然pH。121.3℃灭菌20min。
⑻品味 品尝自己制作的酸奶，判断其感官品质是否达到要求，若达不到要求，分析其原因。
酸奶质量的评定以品尝为标准，通常有色泽、凝块状态，表层光洁度、酸度及香味、无异味等各项指标。感官检验试验方法
2．麸曲培养基制备：取市售、无霉变麸皮过筛去除细粉（50目筛），称取8g麸皮，加入250ml三有瓶中，加水约8ml拌均，于121℃灭菌30min即得。
微生物学实验指导MICROBIOLOGYEXPERIMENT微生物学实验指导微生物学实验共20页
干热灭菌的原理
• 干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固 变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与 其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细 胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水 量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热 灭菌所需温度要高（160～170纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。
一般用于糖发酵或血清学试验，和其它需要节省材料 的试验。
• 三角瓶:
100mL、250mL、500mL和1000 mL 用来装无菌水、培养基和振荡培养微生物等.
• 烧杯:
50mL、100mL、250mL、500mL和1000mL 用来配制培养基与各种溶液等。
• 玻璃吸管: 0.2mL、0.5mL、 1mL、 5mL、10mL
脱脂棉），目的是避免将外界或嘴中杂菌吹入管内，或不慎 将菌液吸出管外。
玻璃器皿的洗涤方法:
1、新玻璃器皿的洗涤 在2%的盐酸溶液中浸泡数小时，用自来水冲洗干净。
2、旧玻璃器皿的洗涤 （1）试管、培养皿、三角瓶：洗衣粉和去污粉洗刷，自来水冲洗
洗涤装后有，固若体内培壁养的基水：均刮匀掉分，布洗成涤一薄层，表示完全洗净，若还 挂有水珠，则需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水冲洗。
微生物学实验指导 MICROBIOLOGYEXPERIMENT微生物学
实验指导微生物学实验
时间反复无常，鼓着翅膀飞逝
环境工程微生物学实验指导书
实验报告要包括以下内容： 1．实验名称、学生姓名、学号、班号和实验日期； 2．实验目的和要求； 3．实验仪器、设备与材料； 4．实验原理；
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武汉科技大学实验指导书
5．实验步骤； 6．实验原始记录； 7．实验数据计算结果； 8．实验结果分析，讨论实验指导书中提出的思考题，写出心得与体会。
二、实验内容
掌握细菌的革兰氏染色方法；掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养，以观 察菌种的个体，学会生物图的绘制。
三、实验仪器、设备及材料
显微镜、载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、石碳酸复红染液、草酸铵结晶紫染液、革氏 碘液、95%乙醇、蕃红染液、接种钩、酒精灯、已培养好的菌株。
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武汉科技大学实验指导书
实验三 微生物的接种技术
一、实验目的
掌握从环境中分离培养微生物和对微生物进行扩大培养的方法，从而获得若干种微生物的纯培养 技能。
二、实验内容
以微生物的斜面接种技术为例，掌握微生物的各种接种技术中需要注意的问题。
三、实验仪器、设备及材料
无菌斜面培养基、已培养好的待接种微生物、酒精灯、接种钩、无菌操作台。
七、实验注意事项
必须严格掌握乙醇脱色程度，如果脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够时，阴性菌被误 染为阳性菌。
八、思考题
1、光学显微镜的操作方法？ 2、微生物的染色原理是什么？ 3、绘制细菌的形态图，并说明革兰氏染色的结果。 4、通过革兰氏染色，你认为它在微生物学中有何实践意义？
主要参考文献： 周群英 高廷耀编著，环境工程微生物学（第二版）中第三部分“环境工程微生物实验”，高等教育出版 社，北京，2000
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武汉科技大学实验指导书
临床2009医学微生物教学大纲
4.熟悉真菌的微生物学检查法；
5.了解真菌感染的防治原则（了解真菌感染的治疗药物）
第三十七章主要病原性真菌
1.熟悉表面感染真菌、皮肤癣真菌形态特点；
2.熟悉皮下感染真菌、地方性流行真菌（掌握各种真菌的形态特点）；
3.掌握各种真菌的致病性及感染特点。
大纲制定者：高丰光
大纲审定者：
3.熟悉水痘-带状疱疹病毒与单纯疱疹病毒特性的区别及致病性；
4.熟悉EB病毒的致病机制与所致疾病；
5.熟悉人巨细胞病毒致病机制与所致疾病。
第三十三章逆转录病毒
掌握人类免疫缺陷病毒（生物学性状、传播环节、致病特点及防治原则）
第三十四章其它病毒
1.掌握狂犬病病毒（掌握要生物学特性、传播环节、致病特点及防治原则；
4.熟悉铜绿假单胞菌的生物学特性和致病性；
5.熟悉空肠弯曲菌的生物学特性和致病性。
和致病性；
2.熟悉诺卡菌属的生物学特性和致病性
第十九章支原体
1.熟悉支原体的培养特点及与细菌L型的主要区别；
2.掌握肺炎支原体和解脲脲原体的致病性；
3.熟悉肺炎支原体和解脲脲原体的致病性。
第九章球菌
1.掌握各种化脓性细菌的形态染色、培养特性，致病物质和所致疾病。
2.掌握葡萄球菌、链球菌的抗原构造及分类。
3..熟悉化脓性细菌的微生物学检查方法
4.了解其防治原则。
第十章肠杆菌科
1.掌握肠道杆菌的共同特性。
2.掌握埃希菌、志贺菌、沙门菌的致病物质、所致疾病。3.熟悉肠道感染细菌的生化反应特点、微生物学检查及防治原则。
第二十六章呼吸道病毒
1.掌握流感病毒的生物学特点、抗原变异与流行的关系；
2.熟悉流感病毒的致病性；
微免实验教学大纲2009
厦门大学本科实验教学大纲
课程编号
课程类型：院系通识课程
课程名称：微生物学与免疫学实验
课程英文名称： The Experimental course of Microbiology and Immunology 课程总学时：
实验学时： 8/周
学分：
先修课程：医学微生物学、医学免疫学、生物化学、有机化学、生理学
选用实验教材：微生物学及免疫学实验学指导自编教材
主要参考书：医学微生物学实验指导主编刘水平, 邬国军西安：世界图书出版社西安公司，2002
医学微生物学实验指导朱万孚主编北京：北京医科大学出版社，2003 一、课程性质、目的与任务
医学微生物学与免疫学实验是医学微生物学、医学免疫学课程的配套实验课程，通过实验课程的学习，验证微生物学与免疫学的有关理论问题，培养学生从基础医学研究与临床医学实际出发，掌握其基本的微生物学和免疫学实验技术，学会分析与综合、整体与分子兼顾的实验思维方式。
培养学生具体掌握体液免疫的常用实验技术，熟悉细胞免疫的基本方法，了解现代免疫学技术的发展和应用，养成良好的无菌观念，深刻理解医学微生物的常用培养方法、消毒灭菌的方法、及常见病原微生物的形态结构、有特征性的培养物和致病的有关物质。
二、教学内容及要求
大纲制定者：陈继冰大纲审定者：高丰光2009年1月19日。
微生物工程实验指导
实验一微生物学实验基本技能训练一、目的要求1．学习配制基本培养基。
2．了解并学习高压蒸汽灭菌的基本原理及操作。
3.学习无菌操作技能二一、器皿的准备在配制培养基的过程中，首先要使用一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，这些器皿在使用前都要根据不同的情况，经过一定的处理，洗刷干净，进行包装、灭菌后，才能使用。
1. 玻璃器皿的清洗（1）新玻璃器皿新玻璃器皿含有游离碱，一般先将其浸于2% 的盐酸溶液中数小时，然后用自来水清洗干净。
也可将器皿先用热水浸泡，再用去污粉或肥皂粉刷洗，最后经过热水洗刷、自来水清洗，待干燥后，灭菌备用。
（2）用过的玻璃器皿①试管或三角瓶的洗刷：盛有废弃物的试管或三角瓶，因其内含大量微生物，洗刷前应先经过高压蒸汽灭菌。
对只带有细菌标本或培养物的试管等玻璃器皿，用过后应立即将其浸于2% 的来苏尔消毒水中，经24h后，才可以取出洗刷。
用蜡封口的试管或石油发酵用瓶，清洗前先将其置于高压蒸汽灭菌器中消毒，然后取出，趁热拔去沾有蜡或油的棉花塞，立即倒去培养污物，再将试管投入温水中，稍加洗刷后浸于5% 的肥皂水内，煮沸5min，以去除试管上的油污。
也可将倒空的瓶子用汽油浸泡，待油溶解后再刷洗。
加过消泡剂的发酵瓶或做过通气培养的大三角瓶，一般先将倒空的瓶子用碱粉或用10% 的火碱水去掉油污后，再行洗刷。
管壁或瓶壁上留有培养物的痕迹，用试管刷难以去除，此时可用一根粗铁丝把顶端弯曲，捆几层纱布，浸湿，沾一点去污粉，或再沾少许细沙，擦磨管壁或瓶壁，就可把器壁的痕迹擦掉。
②培养皿的清洗：用过的器皿中往往有废弃的培养基，需先经高压蒸汽灭菌或沸水煮沸30min 后，倒掉污物，方可清洗。
如果灭菌条件不便，可将皿中培养基刮出来，倒在一起，以便统一处理。
洗刷时，先用热水洗一遍，再用洗衣粉或去污粉擦洗，然后用自来水冲洗干净，将平皿全部向下，一个压着一个，扣于洗涤架上或桌子上。
③吸管的清洗：吸过菌液的吸管，用完后应放入装有5% 石炭酸溶液的高玻璃筒内消毒；未吸过菌液的吸管，用后放入清水中，防止干燥；吸过带油液体的吸管，应先在10% 的氢氧化钠溶液中浸泡半小时，去掉油污，方可清洗。
微生物工程试验
实验一淀粉酶生产菌的筛选一、实验目的学习淀粉酶产生菌的筛选方法。
二、实验原理淀粉酶在酿造、纺织、食品加工、医药等领域有广泛用途。
淀粉酶是一类淀粉水解酶的统称，它能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉被水解后，遇碘不再变蓝色，因此可根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。
三、实验用品1.样品淀粉含量丰富的土样。
2.培养基肉汤培养基：牛肉膏3g,蛋白胨10g, NaCl 5g,加水至1000ml, pH7.0。
121 ℃ 灭菌20min。
初筛平板培养基：牛肉膏3g,蛋白胨10g, NaCl 5g,可溶性淀粉2g,琼脂18g, 加水至1000ml, pH7.4。
121℃灭菌20min。
Lugol碘液：碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。
先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘溶解于碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水即可。
3.器材高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，电子天平，电炉，恒温振荡器，恒温培养箱；烧杯，量筒，三角瓶，培养皿，移液管，洗耳球，试管，试管架，接种针，涂布棒。
四、实验方法1.培养基制备：配制肉汤培养基45ml,分装于250ml三角瓶中，纱布封口，灭菌。
配制初筛平板培养基350ml,分装于500ml三角瓶中，封口膜封口，灭菌。
2.倒平板：将融化的初筛平板培养基冷却至50〜60℃,以无菌操作法倒至已灭菌的培养皿中，至盖满底部。
冷却凝固待用。
3.样品预处理：取5g 土样接入45ml肉汤培养基中，30℃摇床振荡15min制成土壤悬液，此时的稀释度为10-1。
另取4支试管，分别记作10-2、10-3、10-4、10-5共5个梯度，每支试管内加入9mL无菌水。
用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL 土壤悬液，加入到10-2试管中混匀，再从此试管中吸取1mL加入到10-3试管中，依此类推直至10-5试管。
4.平板涂布分离：分别从不同稀释度的试管中吸取0.1ml悬液，均匀涂布于初筛培养基平板上，于30℃培养24〜48h。
最新微生物工程实验指导
微生物工程实验指导2009微生物工程实验指导河北农业大学生命科学学院制药工程系2007年10月实验一细菌生长曲线的测定一、实验目的了解细菌生长曲线特点及测定原理；学习用比浊法测定细菌的生长曲线。
二、原理将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。
它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。
依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。
这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。
因此通过测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。
测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。
本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。
三、实验材料1. 菌种大肠杆菌（E.coli）2. 培养基肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，琼脂 15-20g，水1000mL，调pH 7.0-7.2。
3. 仪器和器具721分光光度计，比色杯，恒温摇床，无菌吸管，试管，三角瓶。
四、流程种子液→标记→接种→培养→测定五、实验方法1. 种子液制备取大肠杆菌斜面菌种1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入肉膏蛋白胨培养液中，静止培养18h作种子培养液。
2. 标记编号取盛有50mL（5mL）无菌肉膏蛋白胨培养液的250mL三角瓶（18×180试管）11个，分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。
3. 接种培养用2mL（1mL）无菌吸管分别准确吸取2mL（0.2mL）种子液加入已编号的11个三角瓶（试管）中（可早、晚各接种一次，则均在白天取样，次日下午或晚上可测），于37℃下振荡培养。
微生物工程实验指导2009(完整)
微生物工程实验指导河北农业大学生命科学学院制药工程系2007年10月实验一细菌生长曲线的测定一、实验目的了解细菌生长曲线特点及测定原理；学习用比浊法测定细菌的生长曲线。
二、原理将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。
它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。
依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。
这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。
因此通过测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。
测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。
本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。
三、实验材料1. 菌种大肠杆菌（E.coli）2. 培养基肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15-20g，水1000mL，调pH 7.0-7.2。
3. 仪器和器具721分光光度计，比色杯，恒温摇床，无菌吸管，试管，三角瓶。
四、流程种子液→标记→接种→培养→测定五、实验方法1. 种子液制备取大肠杆菌斜面菌种1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入肉膏蛋白胨培养液中，静止培养18h作种子培养液。
2. 标记编号取盛有50mL（5mL）无菌肉膏蛋白胨培养液的250mL三角瓶（18×180试管）11个，分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。
3. 接种培养用2mL（1mL）无菌吸管分别准确吸取2mL（0.2mL）种子液加入已编号的11个三角瓶（试管）中（可早、晚各接种一次，则均在白天取样，次日下午或晚上可测），于37℃下振荡培养。
微生物工程实验 学号09121047 曹运鹏
黑曲霉发酵生产a-淀粉酶09生物技术（2）班曹运鹏 09121047摘要：本实验按照一定的接种量向5L搅拌式发酵罐接种，并定时取样（每隔六小时取一次样），测量了发酵期间不同时段所取样品的PH、生物量、酶活、残糖等参数随时间的变化。
发酵三天后放罐（大约66h），并分析了参数变化的原因，从而得到黑曲霉生产a-淀粉酶各种物质和理化性质的变化。
关键词：黑曲霉发酵 a-淀粉酶生物量 pH 酶活一、材料和方法：1.1材料菌种：黑曲霉PDA培养基：土豆200g（去皮）煮沸30min过滤，加糖20g，加水定容至1L.碘液：称取0.5gI2 ,5.0gKI，研磨溶解于少量蒸馏水，定容至100ml，褐色溶剂瓶内保存，避免阳光直射。
稀碘液：原碘液稀释100倍，当天配制。
0.5%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉0.5g，加5ml缓冲液搅拌混合，再徐徐加入70ml 煮沸的缓冲液，继续煮沸2min，冷切至室温，定容至100ml。
需当天配制。
缓冲液：K2HPO4-KH2PO4 （pH为6.0）发酵培养基（g/l）：淀粉200g；柠檬酸氢二氨100g；KH2PO4 15g;CaCl2 0.5g;七水硫酸亚铁0.05g；七水硫酸镁0.05g；水 5.0L，pH调至4.67；消泡剂 2.0mL。
·蒽酮试剂：溶解0.2g蒽酮于浓硫酸1L中，当天配制使用。
1.2方法1.21菌种制备先配制好PDA培养基，分装好，向各瓶中接入黑曲霉，170rpm摇瓶，28°c培养。
1.22设备罐体结构：发酵罐上部有进料口、取样口、冷凝器和尾气过滤器，罐内有搅拌油、挡板、消泡靶。
水通道：分为冷却水和夹套水。
冷却水可以使培养基降温，在发酵过程中，可以和夹套水一起控制发酵温度，夹套水为循环水，可以冷却也可以保温。
空气通道：空气经空压机压缩后，进入储气罐，经油水分离进入玻璃转子流量计，经过滤器后，进入罐底的空气分布器，尾气经罐顶过滤器后排出。
1.23空消把发酵罐顶部管道全部夹住，用罩子罩住。
微生物工程实验指导（2010-2011）
微⽣物⼯程实验指导（2010-2011）微⽣物⼯程实验指导（2010-2011）实验⼀：接种⼯具的认识与灭菌实验⼆：接种和移种实验三：⽐浊法测定发酵液中⼤肠杆菌浓度实验四：测定菌体⼲重实验五：双缩脲法测定蛋⽩质含量实验六：还原法测定⽆机磷实验七：⽆细胞抽提液的制备实验⼋：发酵菌种的⾃然选育实验九：发酵菌株的初筛实验⼗：⼯业发酵菌种的复筛实验⼗⼀：⽣长抑制物质活性的测定实验⼗⼆：⽣长曲线的测定实验⼗三：发酵污染的检测与判别实验⼗四：乳酸菌的分离纯化与鉴别实验⼗五：酸乳及酸乳饮料的制作实验⼗六：反应器的结构认识与清洗实验⼗七：反应器的灭菌实验⼗⼋：反应器电极的使⽤实验⼀：接种⼯具的认识与灭菌⼀、实验⽬的认识接种⼯具，学会使⽤⽅法，学习包扎接种针、移液管及灭菌⽅法。
⼆、实验原理接种是发酵技术的最基本操作，微⽣物的传代和扩⼤培养都需要接种或移种。
接种是指将微⽣物接到适合于其⽣长的营养物上使微⽣物繁殖的操作。
移种是指将已培养好的液体培养物转接到新鲜的液体培养基中，使其进⼀步扩⼤培养和⽣长繁殖的操作。
接种⼯具常⽤的有接种针、接种环、接种铲，移液管等。
三、试剂与器材接种针、接种环、移液管、棉花、⽜⽪纸四、实验操作1.认识接种针、接种环2.接种针、接种环的包扎和灭菌3.移液管的认识和包扎五、思考题灭菌后如果⽐较湿对接种有没有影响，怎么办？实验⼆：接种和移种⼀、实验⽬的学习接种的基本技能⼆、实验原理接种和移种是将已培养好的菌种转接到新鲜培养基的过程，不同的菌，采⽤不同的接种⽅法。
⼀般细菌和酵母菌由于菌落⽐较湿润，容易粘附到接种⼯具上，因此可以⽤接种针或接种环接种；⽽放线菌和霉菌的菌落⽐较⼲燥，不容易粘附在接种⼯具上，因此⽤接种铲产起斜⾯表层的⼀块菌苔作为接种物。
接种过程是⼀个⽆菌过程，接种⼯具、接种环、接种环境以及培养基都应该保证⽆菌条件。
三、实验材料已灭菌的接种针、接种铲、接种环、移液管、试管斜⾯培养基、液体培养基四、实验操作1.接种针的接种A两斜⾯之间的接种⽅法(1)贴标签接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种⽇期、接种⼈姓名等。
微生物学实验指导书
实验一微生物的分离和纯化本实验以微生物的分离和纯化为主线，综合包括了培养基的配制、消毒灭菌、微生物的分离等内容，在给定的时间内由学生自主完成。
包括以下知识内容。
学生书写实验报告的时候，不能照抄袭原文，要用自己的语言，表述实验过程，在别人看完你的实验报告后，能够知道你是怎样做的，能够重复你的实验过程。
一、目的要求1．了解培养基的配制原理，掌握常用培养基的配制方法。
2．掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作方法。
3 学习、掌握细菌、放线菌、酵母菌和霉菌稀释分离、划线分离等技术。
4 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。
5 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌及霉等种类的微生物的培养条件。
二、原理培养基是将微生物生长繁殖所需要各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。
其中除含有水分、碳水化合物、含氮化合物和无机盐类。
此外，微生物还必须在最合适的酸碱度范围的培养基上生长繁殖，因此，对不同种类的微生物，应将培养基调节到一定的PH值范围。
根据研究目的不同，可将培养基制成固体、半固体和液体三种形式。
固体培养基是在液体培养基中加入1.5～2%的琼脂作凝固剂，半固体培养基则加入0.5～0.8%的琼脂。
有时为了特殊目的，也可用明胶或硅胶等作为凝固剂。
由于微生物营养类型不同，应提供不同种类的培养基。
在分离、培养异样微生物时，对一般细菌常用肉膏蛋白胨培养基，对放线菌常用高氏合成1号培养基，培养酵母菌、霉菌则用麦芽汁或豆芽汁葡萄糖培养基，有时也常用马丁培养基分离霉菌。
马丁培养基除含有霉菌所含需的各种营养物外，还有孟加拉红染料，能抑制放线菌和细菌，链霉素可杀死或抑制细菌，但对霉菌均无害，所以这种培养基具有选择作用。
灭菌的方法很多，最常用的是加压蒸汽灭菌法。
此法是把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的。
在每平方厘米为一个大气压（即15磅/时2）的压力下，温度可达121℃，一般只要持续15～20分钟后，就可杀死一切微生物的营养体和它们的各种孢子。
环境工程微生物实验指导
环境工程微生物实验指导实验一微生物形态观察一、实验目的1、认识细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的基本形态特征。
2、巩固显微镜的使用方法。
3、学习微生物画图方法。
二、实验原理1、细菌的基本形态细菌是单细胞的微生物，能够独立进行生活，它的种类繁多，但基本形状有四种：球状、杆状、螺旋状和丝状，分别称为：球菌、杆菌、螺旋菌和丝状菌。
（1）球菌：细胞呈球形或椭圆形，根据它们相互联结的形式可以分为单球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等。
如金黄色葡萄球菌。
球菌大小以直径表示，一般为0.5~1μm。
（2）杆菌：细胞呈杆状或圆柱形，大小以宽度×长度表示，各种杆菌的长度与直径比例差异很大，有的粗短，有的细长。
如大肠杆菌就比较细而短、枯草杆菌粗而长。
杆菌是细菌中种类最多的，工农业生产中所用的细菌大多是杆菌。
（3）螺旋菌：细胞呈弯曲杆状，螺旋菌细胞壁坚韧较硬，常以单细胞分散存在。
大小一般为（0.3~1.0）μm×（1.0~50）μm，根据其弯曲情况可分为弧菌、螺菌、螺旋体。
弧菌只有一弯曲，而螺菌有2~6个弯曲。
其大小为0.3~1×1~50μm。
若菌体弯曲螺旋圈数较多者，无坚韧的细胞壁，比较柔软，能自由运动，通称为螺旋体。
2、细菌的特殊构造细菌细胞的特殊构造有荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等。
（1）荚膜：是有些细菌生活在一定营养条件下，向细胞壁表面分泌的一种粘液状、胶质状的物质。
用显微镜观察，中心部位是细菌菌体，在暗色背景下荚膜呈透明状环绕菌体。
（2）鞭毛和菌毛：鞭毛是某些微生物细胞表面着生的一根或数根细长、波曲、毛发状的丝状物。
直径为0.1~0.2μm，它是细菌的运动器官。
在光学显微镜下不能直接观察到。
经过特殊的鞭毛染色后，在光学显微镜下可以看到鞭毛。
（3）芽孢：是某些细菌在其生长的一定阶段，在细胞内形成一个圆形、椭圆形、壁厚、含水量极低、抗逆性极强的休眠体。
芽孢形成的位置、形状、大小可因菌种而异。
微生物工程实验指导
微生物工程实验指导适用生物技术专业食品与生物工程学院2008.1实验一 发酵实验用玻璃器皿灭菌前的包扎方法一、目的：学习发酵实验用玻璃器皿在灭菌前的包扎工作，并了解灭菌后的使用方法。
二、原理：为保持发酵实验用玻璃器皿灭菌后的无菌状态，需要对它们灭菌前进行包扎，这些工作看起来简单，但如操作不当或不按操作规程去做，则会影响实验结果，甚至会导致实验的失败。
三、材料和设备5ml吸管30只，9cm培养皿 10套，120*12mm试管 120只，250ml三角瓶30个，脱脂棉0.5斤，天然棉0.5斤，8层纱布30块，线绳。
四、方法1、洗涤1 新器皿应用2﹪盐酸浸泡数小时再洗涤。
2 琼脂块不能倒入下水道。
3 含菌培养基一般先煮再洗。
4 洗涤后玻璃器皿上水应均匀湿润而无条纹和水珠。
2、包扎① 平皿的包扎：10个一包。
前9个方向一致，最后一个反放，用纸卷成卷，也可放在特制铁桶中灭菌。
② 吸管的包扎：在吸管尾部塞入少许脱脂棉，脱脂棉长约1cm，距管口约0.5cm，以防止在使用时造成污染。
脱脂棉松紧适当，多余的棉花可用火焰烧掉。
每支吸管用约6cm宽纸条，吸管头部包衬双层纸，以30－45º卷起，吸管尾部用剩余纸条打成一结，防止散开，标上容量。
使用时，从吸管中间凝断包扎纸带，抽出吸管。
③ 试管的包扎：用天然棉做成棉塞，紧贴管臂，松紧适宜，棉塞要实，2/3塞进管口。
也可用硅胶塞。
十只一把，外加牛皮纸，扎好。
脱脂棉易吸水，可能造成染菌。
④三角摇瓶的包扎：用8层纱布（大小适宜），塞入瓶口2/3，瓶外部分揪成一团，再用一层牛皮纸或两层报纸把纱布遮严（以免打湿），包扎，用绳子系成活扣。
使用时，去掉包扎纸，拿去纱布，接种后，将纱布塞进瓶口，纱布四角拉下，用绳子系成活扣。
五、作业体会这样做有哪些好处？实验二 灭菌技术及其应用一、目的：掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的原理和操作。
二、原理：灭菌的基本原理是通过加热使微生物体内蛋白质凝固变性，从而达到灭菌目的。
生命科学学院学期实验课程教学进度计划2009学年第1学期
课程名称
微生物学实验
授课班级
07制药工程3，4班
学生人数
59
实验指导教师
孙佰申
职称
实验员（职称）
王锦文（实验员）
教材、参考书
实验指导书周长林主编.微生物学试验与指导.中国高等教育出版社,2004
1、பைடு நூலகம்萍等主编.微生物学实验.北京:高等教育出版社,2000
2、周德庆主编.微生物学教程.北京:高等教育出版社,1999
3、周德庆主编.微生物学实验手册.上海:上海科学技术出版社,1986
4、黄秀梨主编.微生物学实验指导.北京:高等教育出版社,1999
本课程实验在第▁5学期进行，计划共▁32▁学时，共▁9▁周，实际▁32▁学时；是否独立设课：是▁▁。
周次
星期
一
下午
土壤中抗生素产生菌的分离
29
5
一
晚上
30
5
13
一
下午
红曲霉培养基的制备及菌株的活化
29
4
一
晚上
30
4
14
一
下午
红曲霉产色素的发酵试验
29
4
一
晚上
30
4
课程考核（考试或考查）及成绩评定办法
考查：（出勤＋预习＋操作＋实验报告）60％＋实验理论考试（闭卷）40％
期中计划变动意见
期中进度检查
期末进度检查
实验技术人员签字：▁▁▁主讲教师所在系系主任签字：▁▁▁▁▁实验室主任签字：▁▁▁主讲教师所在学院负责人签字：▁▁▁▁2009年9月8日
注：此表一式五份（一份任课教师留存、一份向学生公布、一份教师所在学院留存、一份学生所在学院留存、一份交教务处存档）。
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微生物工程实验指导河北农业大学生命科学学院制药工程系2007 年10 月实验一细菌生长曲线的测定一、实验目的了解细菌生长曲线特点及测定原理；学习用比浊法测定细菌的生长曲线。
二、原理将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。
它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。
依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。
这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。
因此通过测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。
测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。
本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD 值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD 值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。
三、实验材料1. 菌种大肠杆菌（E.coli ）o 严去甘2. 培养基肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g,蛋白胨10g, NaCI 5g，琼脂15-20g，水1000mL，调pH 7.0-7.2。
3. 仪器和器具721 分光光度计，比色杯，恒温摇床，无菌吸管，试管，三角瓶。
四、流程种子液f 标记f 接种f 培养f 测定五、实验方法1. 种子液制备取大肠杆菌斜面菌种1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入肉膏蛋白胨培养液中，静止培养18h作种子培养液。
2. 标记编号取盛有50mL(5mL)无菌肉膏蛋白胨培养液的250mL三角瓶(18X 180试管)11 个，分别编号为0、1.5、3、4、6、& 10、12、14、16、20h。
3. 接种培养用2mL (1mL)无菌吸管分别准确吸取2mL (0.2mL)种子液加入已编号的11个三角瓶(试管)中(可早、晚各接种一次，则均在白天取样，次日下午或晚上可测)，于37C下振荡培养。
然后分别按对应时间将三角瓶(试管)取出，立即放冰箱中贮存，待培养结束时一同测定OD600值。
4. 生长量测定将未接种的肉膏蛋白胨培养基倾倒入比色杯中，选用600nm波长分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.10-0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD 值。
六、结果1. 将测定的OD值填入下表：2. 以上述表格中的时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制大肠杆菌的生长曲线实验二从土壤中分离产酸细菌一.实验目的要求：掌握微生物分离纯化的方法，学习筛选培养基制备原理和方法。
二.实验原理：从混杂的微生物群体中获得某一种或某一株微生物的过程，称微生物的分离与纯化，本实验采用稀释涂布平板法分离产酸细菌，以碳酸钙为底物，经产酸菌酸化形成透明圈。
2H+ + CO3J CO z f + HO三.主要设备、器材：1■实验器皿：250 mL三角瓶2只；试管7支（带棉或硅胶塞）；9 cm培养皿6个; 1 mL 移液管7根；吸耳球1个；涂布棒3个；废报纸、棉花、棉绳、玻璃珠若干。
净工作台、接种环、酒精灯各一套2■实验试剂：琼脂，蛋白胨，牛肉膏，CaCO3, 0.5mol/L的HCI溶液，0.5mol/L的NaOH 溶液，玻璃棒，pH 试纸四实验步骤：1. 分离用器皿的准备用报纸包扎6个培养皿，7根1mL移液管，3个涂布棒，160 C干热灭菌60 min。
（亦可121C湿热灭菌20 min）2. 无菌水的制备取1只250 mL三角瓶装入90 mL自来水和15-20粒玻璃珠。
121C湿热灭菌20 min。
取6支试管各加自来水9 mL （6只一捆）。
121C湿热灭菌20 min。
3. 培养基的制备及分离平板制作取1只250 mL三角瓶制作细菌固体培养基100 mL （配方：蛋白胨1.0%，牛肉膏0.3%，CaCO3 1%，琼脂1.8-2.0%，pH 7.0），121 C湿热灭菌20 min，60C 恒温箱保温。
倒平板，将培养基充分摇匀呈浑浊液，立即在超静台上将6 个培养皿倒入细菌培养基（约15-16 mL）。
4. 土壤中产酸细菌的分离操作称取校园土10 g,在超静台无菌操作倒入冷却至室温的无菌水中（90 mL蒸馏水/250mL三角瓶带玻璃珠），摇匀5-10 min，制成菌液，用十倍稀释法稀释到10-6 （5 支无菌水试管）。
分别取10-4，10-5，10-6稀释度的稀释液，每个稀释度涂布两个培养皿，每个培养皿0.1 mL （2-3滴）。
35C培养箱培养2d，观察单菌落周围有无透明圈出现。
如有透明圈说明该菌株可能产酸。
（以下内容选作）挑取具有透明圈的单菌落至牛肉膏蛋白胨斜面，进一步利用划线分离法纯化，做产酸能力实验。
从复筛培养基上挑取透明圈较大的单菌落接种至三角瓶液体培养基中，摇床培养2天后，检测产酸能力（用pH 试纸或酸碱滴定法）。
五根据实验结果进行分析讨论六思考题:1. 根据实验结果回答，如何区分平板中非产酸菌？2. 你觉得本实验设计的筛选培养基该如何改进？实验二喷雾干燥酶粉中分离筛选1398 中性蛋白酶生产菌株（选做）一、实验目的要求掌握微生物分离纯化的方法，学习筛选培养基的制备，灭菌等无菌操作技术。
二、实验原理中性蛋白酶是许多微生物分泌到胞外的能在pH 值中性范围内水解蛋白质的酶类，利用此机制以干酪素为底物，根据水解透明圈与菌落比值的大小来进行菌株的筛选。
比值大的其产酶活力明显增大。
三、材料与方法1、试验材料供试材料为喷雾干燥的中性蛋白酶样品。
购自市场。
2、培养基（1）干酪素培养基：干酪素 2.0％（用适量NaOH 溶液加热溶解），琼脂1.5%, pH7.0 （或干酪素4g,硫酸镁0.5g,氯化钾0.5g，硫酸铁O.OIg,蔗糖30g,琼脂20g, 1000mL）。
（2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.4%，蛋白胨0.6%，酵母浸出粉0.2%，NaCl 0.5 %，琼脂 2.0%，pH7.0（3）发酵培养基I:麸皮 4.0 %，蛋白胨0.1%, Na2HPO4 12H2O 0.4%, KH 2PO4 0.03%, pH7.0。
发酵培养基U:可溶性淀粉 1.0%,蛋白胨0.5%, Na2HPO4 12H2O 0.4%, KH2PO4 0.03% , CaCI2 0.1%, pH7.0。
3、仪器与设备超净工作台,恒温培养箱,恒温振荡培养箱,恒温水浴锅,台式低速离心机, 721 型分光光度计4、步骤（ 1 ）初筛利用样品通过常规稀释平板法：即取10 g样品置于已加入90mL 无菌水的三角瓶中，220 r/min旋转摇床，20 min后取出，静置30 s。
此三角瓶中液体的浓度为10-1，再用7支分别装有9 mL 无菌水的试管进行稀释，稀释至10-8。
将干酪素培养基分别倒入已灭菌的 6 个平皿中，每个平皿倒入10 mL 左右，然后吸取0.1 mL 的10-6，10-7，10-8稀释液分别涂布于干酪素培养基表面，每个稀释浓度涂布2个平皿。
37 C培养24 h。
肉眼选出产生透明圈的菌株。
将牛肉膏蛋白胨培养基分别倒入7个已灭菌的平皿（每个平皿倒10mL 左右，置平板）和7支试管（每支试管6mL左右，置斜面）内。
然后将选出来的若干株菌在平皿上划线，每株划一个平皿。
37 'C培养24 h。
取出，然后从平皿中选出其单菌落划线至斜面试管（每个平皿对应一支斜面试管）进行活化培养，37 C培养24 h。
（2）复筛面试管中分别接一环对应于装有发酵培养基I的三角瓶中进行发酵培养。
30 C恒温振荡培养48 h，3500r/min离心30 min，取上清液测蛋白酶活力。
然后从中挑选出酶活力较高的1-3株。
用发酵培养基H进行发酵培养，30 C恒温振荡培养48 h，3500 r/min离心30 min，取上清液测蛋白酶活力。
然后从中挑选出酶活力最高的 1 株。
5、蛋白酶活力的测定（1）原理采用福林-酚试剂法。
福林酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色（钼蓝和钨蓝混合物），由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸，色氨酸等），可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。
因此可利用此原理测定蛋白酶活力。
通常以酪蛋白为底物，在一定pH 值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶反应，经离心或过滤除去酪蛋白等沉淀物后取上清液，用Na2CO3 碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比，酪氨酸含量用分光光度计在660 nm处测定，从而计算出蛋白酶活力。
（2）试剂福林-酚试剂在2000mL 磨口回流瓶中，加入100g 钨酸钠（Na2WO4 2H2O），25g 钼酸钠（Na2MoO4 2H2O）及700mL 蒸馏水，再加50mL85%磷酸，100mL浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入50g 硫酸锂（Li 2SO4），50mL 蒸馏水及数滴浓溴水（99％），开口继续沸腾15 分钟，以便驱除过量的溴。
冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加浓溴水的步骤）。
定容至1000mL，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。
此溶液使用时加两倍蒸馏水稀释，即成已稀释的福林试剂。
0.4mol/L 三氯乙酸（TCA）溶液精确称取TCA65.4g ，加去离子水定容至1000 mL。
0.4mo1/L 碳酸钠溶液精确称取无水碳酸钠42.4 g，加去离于水溶解后，定容至1000 mL。
pH7.2 磷酸盐缓冲液称取磷酸二氢钠（NaH2PO4 2H2O）31.2 g，定容至1000 mL，即成0.2 mol/L溶液（A液）。
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4 12H2O）71.63 g，定容至1000 mL，即成0.2 mol/L 溶液（B 液）。
取 A 液28 mL 和 B 液72 mL ，再用蒸馏水稀释 1 倍，即成0.1 mol/L 、pH7.2 的磷酸盐缓冲液。
准确称取干酪素2 g,称准至0.002 g,加入0.1 mol/L氢氧化钠10 mL ,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮2%酪蛋白溶液沸)，然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100 mL即成。
配制后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。
100卩g/m酪氨酸溶液精确称取在105 °C烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000 g,用1 mol /L盐酸溶液60 mL溶解后，用蒸馏水定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。
吸取1 mg/mL酪氨酸标准溶液10 mL，用0.1 mol /L盐酸溶液定容至100 mL，即得到100g g/mL的酪氨酸标准溶液。