CRISPR操作-在线设计gRNA教程

CRISPR操作-gRNA设计教程

我们都知道一个基因（一个基因ID）往往可以编码多个转录本（多个NM 号），相应的也对应多个蛋白质（多个NP号）。一条mRNA上编码蛋白质的区域称为CDS（coding sequence）。一个基因产生的多个mRNA往往有部分区域是重叠的（图4a红框内的区域），这部分重叠的区域叫做保守的CDS （consensus CDS），简称CCDS。我们通过基因组编辑破坏一个基因，往往需要破坏所有的mRNA编码的蛋白，因此，我们选择编辑的位点通常位于CCDS区域的上游位置（靠近起始密码子ATG的位置）。编辑的目的是在CDS区域随机引入碱基的缺失或插入（indels），如此可以破坏三联密码子的阅读框，产生移码突变(图4b)。

图4CCDS和移码突变示意图。a，方框代表外显子组织情况，黑色方框代表CDS区，红色框内是该基因对应的CCDS；b，移码突变。一个T碱基的插入改变了阅读框，最终导致终止密码子的提前出现，蛋白质翻译提前终止。移码突变往往导致蛋白质功能丧失。

SgRNA设计的站点介绍如下：

着重推荐Lei Stanley Qi Lab的

/index.jsp

（打不开请复制到浏览器地址栏）

这个在线站点功能比第一个丰富，可以选择基因编辑工具的其他用途

（激活，抑制基因表达等）（图5）。下一步就是选择物种（图6）。但只有常见的9种。再下一步就是直接输入基因的名称（或序列）即可（图7）。

图5选择编辑类型

图6选择物种

图7选择基因名称。

我们以人的LDLR基因作为例子说明，输入“LDLR“，然后点击“CRISPR-ERA search”，会出来很多设计好的sgRNA（图8），ID编号#1-N（紫色框），后面一系列参数代表sgRNA对应的mRNA、基因组位置等。绿色框里代表打分，简而言之是E+S分越高越好。但这个不是很直观，我们可以切换到图示模式，请点击红色框的链接查看排名前50位的sgRNA在基因组上对应的位置（图9）。图示模式是兼容在UCSC基因组浏览器中的，这一工具包含的信息特别丰富，大家可以自己探索探索其他好玩的功能。

图8LDLR设计的sgRNA页面图。

如图9所示，出来的sgDNA集中分布在距离ATG下游的第3和4个外显子中，我们可以选择打分优先靠前的#1，2，3号sgRNA。对于做基因的敲除（KO）而言，强烈建议选择ATG下游通常100aa以内范围内的sgDNA 来用（比如图9中的#2，4，9等）；而且，一定要位于CCDS区域内（CCDS 是consensus CDS，即公共的CDS区域，是针对很多个转录本[isoforms]定义，图9中绿色条框即是。这个很重要！！！如果默认不显示，需要在图示的下面设置一下，如图10）。

图9sgRNA在基因组上的相对各个外显子的位置。注意对应基因的方

向和CCDS的位置。

图10注意高亮信息的设置。

●Feng Zhang lab：/。这是最早的一个设计

站点。包括常见的16个物种。选中物种，把你要设计的区段序列扔到下面的框里运行就行。但前提是你自己已经选好了位置（图11）。

图11

●还有其他，如omictools下面的Cas-Designer

/cas-designer/。这个站点内容更加丰富，比如物种覆盖式最多的，包括植物，昆虫等等（图12左）。这个站点也是输入目的基因的序列定制的，不同的是可以有较大的自由度选择位置预测。

图12

●还有一些商业公司的，比如Thermo下面的（图13）：

https:///crispr/index.html#/searc h

物种较少，商业性目的特别强，了解下即可。

图13

●手动版设计方法—好用不贵（可能保证不了特异性）

手动版本虽然费事，但有时候却会事半功倍，节约后续鉴定单克隆的成本。经验表明脱靶也没有那么不堪，完全可以利用。我们举例来说：

图14

序列中PAM和sgDNA的序列放大如下（前提是sgDNA位于CCDS区域，而且特异性要保证）：

也即，让Cas9切割位置（确定的）跨过一个酶切位点（比如sfcI）。这样，在Cas9成功编辑靶序列产生indels的时候，酶切位点一定会遭到破坏。这为后续的单克隆鉴定提供了便利。请看示意图（图15）：

图15

注意一点：PCR引物设计的时候确保PCR片段内部不要出现第二个SfcI的酶切位点。这样后面酶切的时候结果是唯一的。实验流程和鉴定结果应该是这样的（图16）：

图16

对于WT，酶切是充分的，不会残留。而对于成功编辑的两个mixture：*1和*2，由于产生了indels，部分sfcI的位点造到破坏，sfcI切不动的。

对于成功编辑的单克隆而言，应该是一点都切不动。后续鉴定只要这样的克隆去测序即可（图17，红色编号为阳性克隆）。

图17

TA克隆测序结果（图18）：

图18

其他Cas9，比如Cpf1和saCas9的设计

因为以上介绍的站点没用涉及Cpf1和saCas9，特别是saCas9（非常适合AAV介导的载体基因编辑）。

http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html这个网站兼容几乎所有类型的Cas9设计。

打开页面，输入要编辑区域的基因组碱基序列，然后在PAM类型里选择

你需要的Cas9类型，比如spCas9，saCas9以及cpf1等。其他条件默认设置即可，然后点击sunmit即可。非常傻瓜式的操作（图19，20）

图19

图20