胚胎干细胞体外培养.

胚胎干细胞体外培养

(一)胚胎干细胞的来源

目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。

(二)胚胎干细胞的分离

1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1

2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1

3.5～1

4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。

2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。

从囊胚分离ICM的方法主要有三种：

(1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。

(2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。

(3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。

由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。

(三)胚胎干细胞的培养和建系

ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs

成千上万的克隆。目前建立ESCs系的方法有多种，常用方法包括以下过程：①原始ESCs 的获得：从受孕动物体内或体外受精卵培养中获得发育至桑葚胚或胚泡阶段的早期胚胎，用机械法分离、胰酶或胶原酶消化桑葚胚或胚泡内细胞团得到原始ESCs悬液。②ESCs的传代培养：将原始ESCs悬液接种到经放射线照射或丝裂霉素C处理的成纤维细胞饲养层上进行培养。培养1周左右，发现典型的ESCs集落，挑取细胞集落，用低浓度胰酶分散后，进行传代培养，3～5天传1次。经反复传代培养，可获得生长旺盛的高纯度ESCs。③ESCs 的鉴定。

由于ESCs来源于分裂增殖非常活跃的早期胚胎细胞，所以维持其生长代谢所需的营养要充足，用于ESCs培养的饲养层细胞培养基含高糖和谷氨酰胺，同时加胎牛血清、新生牛血清、2-巯基乙醇。高糖的作用是提高ESCs的增殖速度，同时提供饲养层细胞生长所需的能量；谷氨酰胺作为细胞合成蛋白质与核酸的原料，是饲养层细胞培养基的必需品；2-巯基乙醇的作用为促进胚胎细胞的分裂增殖，并可还原血清中的含硫化合物，防止过氧化物对ESCs的损害。

1.胚胎干细胞的培养体系：

(1)常规培养液：选择和配制高质量的培养基是体外培养ESCs的基本要求。常用的培养基有MEM-α、DMEM、TCM-199、F12等合成培养基，以DMEM应用最为普遍。再加入10%新生牛血清、10%胎牛血清、0.1mM 2-巯基乙醇、100μg/ml L-谷氨酰胺。Thomson等建立恒河猴(rhesus monkey)ESCs系时，培养基中补加了1%的非必需氨基酸，结果ESCs生长良好。Gardner和Lane发现，如果培养基中含有输卵管液中高浓度表达的氨基酸成分，胚胎卵裂、囊胚形成和孵化均显著增加。

(2)无血清培养基：血清中含有大量促细胞生长因子和多种营养物质，有促进细胞生长繁殖和黏附的作用，但血清中还含有许多未知的成分和一些分化诱导因子，不利于ESCs 未分化状态的维持。为此人们尝试使用无血清培养液、化学合成培养液(chemically defined medium)进行ESCs的培养，加入刺激细胞生长的激素、细胞因子等，发现ESCs 增殖旺盛，且能保持未分化状态。

(3)条件培养基(conditioned medium，CM)：Martin曾应用小鼠畸胎瘤多能干细胞系PSA-1的条件培养基建立了小鼠ESCs系，后Axelrod对其进行了改良：将PSA-1畸胎瘤细胞接种于STO饲养层上，在含有10%胎牛血清的DMEM中贴壁培养，达到50%～75%汇合时更换培养液，用不含血清的DMEM培养基(加有10mg/ml转铁蛋白、10mg/ml 胰岛素)继续培养24小时，收集培养液，离心，去除细胞沉淀，上清液再经过0.22μm的微孔滤膜过滤，过滤后的PSA-1培养液再加入10%胎牛血清、0.1mM 2-巯基乙醇，即为PSA-1条件培养基。使用前用含有10%胎牛血清、0.1mM 2-巯基乙醇的DMEM培养基稀释，PSA-1细胞分泌的细胞因子等活性物质的活性基本保持不变。以后许多实验室制备了不同的条件培养基取代饲养层细胞来维持ESCs的生长，如BRL(buffalo rat liver cells)、PC10-6R转染的COS细胞、HBC-5637(5637 human bladder carcinoma cells)、RH-CM(大鼠心肌细胞条件培养基)等，这些条件培养基中都含有高浓度的细胞分化抑制因子，可以抑制ESCs的分化。

(4)饲养层(feeder layer)：饲养层是一层经过射线照射或丝裂霉素C处理后用作培养ESCs的底物细胞层。饲养层细胞经射线照射或丝裂霉素C处理后，虽然失去分裂能力，但