分子生物学技术进展与其在生物医学研究中的应用

N O R M A LIZE D FLU O R E S C E N C E
PURE FLUOROCHROMES SPECTRA
1 .0
1 .0
1 .0
Spectrum G reen
Cy5
R hodam ine
0 .8
0 .8
Cy3
0 .8
0 .6
0 .6
0 .6
0 .4
0 .4
0 .4
0 .2
0 .2
分子生物学基本技术
核酸蛋白质提取纯化技术 分子杂交技术 DNA体外和体内扩增技术 核酸凝胶电泳技术
–突变分析 • RFLP，SSCP，DGGE，SEQ
核酸提取技术
要求：去除杂蛋白、多 糖、脂类等大分子杂质， 同时要快速简便。
常用的提取方法：
– 酚-氯仿提取法 – 盐析法 – 高温裂解法 – 固相吸附洗脱法 – 碘化钠提取法
病毒细菌核酸侵入 体细胞基因突变 基因突变 多基因突变 基因功能紊乱 ？？？
DNA的性质与利用
核酸分子杂交与分子识别
特异性: 基础
可观察性: 目标
DNA的复制与转录
特点：半保留，精确
– 子代分子含有一条母链和 一条新合成的新链；子代 分子与亲代分子结构完全 相同。
条件：DNA聚合酶，引 物，原料（dNTPs）， 温度，缓冲液
技术
基因芯片技术
高通量
敏感性不够高
低成本潜力
重复性不够好 质量不高
固态芯片的应用案例
固态芯片的应用案例
高通量
液相基因芯片技术 高敏感
性
高重复 性
价格低
通过 FDA
用液态芯片来检测蛋白
双抗体夹心 双抗原夹心 标记抗原竞争法
在不同颜色的乳胶颗粒上可以共价地结合 上抗体（如图）或抗原。病人血清中的蛋 白（抗原）或抗体回与乳胶颗粒上的反应 物特意性地结合并加上标记。最后通过激 光就可以判断是否有相关疾病了。
35
每种染色体分别对应一种唯一的荧光染料组合
SkyPaint 标记方案
chr Label
1
BCD
2
E
3
ACDE
4
CD
5
ABDE
6
BCDE
7
BC
8
D
A = Spectrum Orange B = Texas Red C = Cy 5
chr Label
9
ADE
chr Label 17 C
10 CE
18 ABD
核酸分子杂交技术
目标 DNA
探针杂交
膜上杂交
原位杂交
微孔板上杂交 芯片上杂交
杂交技术平台的改进目的：更快、更准、更便宜。
DNA(RNA)体外合成与扩增技术
聚合酶链反应技术 PCR
连接酶链反应技术 LCR
体外转录技术 逆转录技术
新技术进展
基因芯片技术 液相基因芯片技术 原位杂交技术 光谱核型分析技术 实时荧光定量PCR
11 ACD
19 AC
12 BE
20 A
13 AD
21 DE
14 B
22 ABCE
15 ABC
X AE
16 BD
Y CDE
D = Spectrum Green E = Cy 5.5
每种染色体 发射光谱是 唯一的
36
用SkyVision™ 拍摄频谱图像
1. CCD 相机
1
2. Sagnac干涉仪
3. SKY 滤镜组
液态芯片在蛋白水平上检测的疾病
自身免疫疾病 肿瘤筛查 各种感染性疾病的免疫学检测 过敏源识别 激素测定 免疫蛋白分类 酶水平的测定 血清蛋白图谱
原位杂交 卵泡组织VEGF-Mrna
100X
荧光原位杂交
光谱核型分析技术SKY
SkyPaint 探针用五种不同的荧光染料进行了探针标记: FITC, Rhodamin, TexasRed, Cy5 和 Cy5.5.
0 .8
Spectrum R ed
0 .6
0 .6
0 .6
0 .4
0 .4
0 .4
0 .2
0 .2
0 .2
0 .0
0 .0
0 .0
500 550 600 650 700 750
500 550 600 650 700 750
500 550 600 650 700 750
W A V E LE N G TH [nm ]
中心法则的延伸意义
复制
DNA
转录
RNA
翻译
蛋白质
所有生物功能都是在生物信息控制下的。 生理功能如此，病理机制也是如此。
所有疾病都是生物信息变异造成的。 所有疾病的诊断都是对生物信息收集和分 析的过程。 所有治疗都是对生物信息调整的过程。
基因结构与表达决定了疾病
复制
DNA
转录
RNA
翻译
蛋白质
感染性疾病 肿瘤 遗传病 常见病 自身免疫 ？？？
代谢、生长、发育、繁殖、遗传、变异、进化等
遗传信息传递的各个环节
生命有机体是高度复杂的自 组装体系
医学研究与实践
生物医学科研层次
分子生物学研究对象
CGAAT
ATTCG 双链DNA
基因概念
中心法则
复制
DNA
转录
RNA
翻译
蛋白质
任何性状 都是基因 或基因表 达决定的， 都有其分 子基础
现代分子生物学技术进展与 其在生物医学研究中的应用
主要内容
我对生命科学以及医学科研的理解 分子生物学在医学科研中的地位和作用 分子生物学及其技术的基本理论 分子生物学基本技术简介 现代分子生物学研究技术进展
生命科学研究内容
– 生命和生命有机体
生命运动的本质和规律
– 生命活动的主要特征：活的
-10
INTERFERO G RAM
-5
0
5
10
干涉仪旋转角度
频谱成像
由于三种染料发射光谱重叠， 普通图像很难区分
用频谱图像，可将其准确区分出来
CHROMOSOME LABELING CH 1: Cy3 + TR CH 2: Cy5.5 CH 3: SG + TR + Cy5 CH 4: Cy3 ... CH Y: TR + Cy5 + Cy5.5
4.Βιβλιοθήκη Baidu计算机
5. 显微镜
6. SkyPaint探针
4
7. 相机控制器
8. 干涉仪控制器
9. 监视器
2
3 9
sd300cyto.jpg
8
7
6
5
拍摄过程
Sagnac 干涉仪
CCD
光源 激发光滤片
准直镜 发射光滤片
分光镜 物镜 样品
FLU O R ESC EN C E IN TEN SITY
0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8
0 .2
0 .0
0 .0
0 .0
500 550 600 650 700 750
500 550 600 650 700 750
500 550 600 650 700 750
1 .0
1 .0
1 .0
F IT C
0 .8
Spectrum G reen
0 .8
Cy2
Texas Red
C y5.5
C y3.5