OPTI MEM进行贴壁细胞培养的实验方法
Western实验步骤
转染（24-well）步骤1、贴壁细胞，0.5×105/500μl无抗生素培养基2、0.8μgDNA加入50μlOpti-MEM(或其它无血清培养基)3、2μl Lipofctoomine TM2000加入50μlOpti-MEM(或其它无血清培养基)，室温5min4、混合后室温20min共100μl5、每孔加100μl，混匀6、37℃培养18-48h，4-6h是更换培养基型号总体积DNA Lipo200096-well 100μl 0.2μg 0.5μl24-well 500μl 0.8μg 2μl6-well 2ml 4.0μg 10μl60-mm 5ml 8.0μg 20μl10-cm 15ml 24μg 60μlWestern Blot步骤一、蛋白样品制备（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取（Monolayer adherent cells）:1、倒掉营养液，用冰预冷的PBS洗三次，弃净PBS后把培养皿置于冰上（期间标记EP管，用冰）2、1ml三去污裂解也加7μl PMSF（苯甲基磺酸氟）、1μl aprotinin(抑肽酶)、1μl leupetin（亮氨酸）、1μl pepstain(胃酶抑素)摇匀置于冰上。
也可以用冰冷PBS转移至EP管离心后再裂解，可操作性更强。
用量：6孔板每孔25μl，60mm2平皿70μl。
用过的scraper先用75%乙醇洗，再用超纯水洗3、在冰上用塑料细胞刮刮下贴壁细胞，用加样器吸至EP管中，4℃冰箱中震荡15分钟4、于4℃下12000rpm离心30min（提前开离心机预冷）5、将离心后的上清转移至0.5ml的离心管中放于-20℃保存（2）组织中总蛋白的提取1、将少量组织块置于1~2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎2、加400μl单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。
然后置于冰上。
裂解完一管先用75%乙醇洗，再用超纯水洗，最后用吸水纸吸干。
各种转染试剂的中文转染方法
各种转染试剂的中文转染方法FuGENE6（Roche）转染步骤：转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。
将细胞以1-3×105/2 ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。
将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。
使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。
1. 在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100 ul。
2. 将3-6 ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。
3. 加入1-2 ug的DNA溶液（0.02－2.0 ug/ul），轻弹管壁混合。
4. 室温孵育20分钟。
5. 将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1 ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2 ml不含血清和双抗的营养液。
6. 将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。
7. 3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。
Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）：1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。
细胞铺板在2 ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
2. 对于每孔细胞，使用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释4.0 ugDNA，轻轻混匀。
3. 使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释10 ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。
Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。
NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。
4. 混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。
室温放置20分钟。
5. （optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。
贴壁细胞传代培养步骤
贴壁细胞传代培养步骤贴壁细胞传代培养是一项细胞学技术，用于繁殖选定细胞，其目的是在同一种细胞中完成繁殖。
此技术对于基础研究、比较生物学和临床诊断都具有重要意义。
在贴壁细胞传代培养过程中，可以形成一系列细胞系供后续的研究使用，因此这一技术在细胞学研究中扮演着至关重要的角色。
贴壁细胞传代培养具体步骤如下：第一步：首先，将细胞从初始培养基中分离出来，用活细胞物镜观察，查看细胞形态是否正常，结果显示细胞有正常分裂。
第二步：将第一步中分离出的细胞悬浮液转移到饱和细胞悬浮液中，一般采用0.25%的胨酶，将细胞细胞壁分裂，使细胞形成悬浮状态，这一步称为“贴壁”。
第三步：将贴壁后的细胞悬浮液转移到新培养皿中，一般采用Trypsin EDTA抑制剂，使悬浮的细胞不能再分裂，形成不可见的“细胞溶液”，这一步称为“传代”。
第四步：缓慢地用微量移液器将细胞溶液倒入新培养皿中，当液体分散成一液一固时，加入培养基，使细胞随培养基逐渐沉淀，这一步称为“培养”。
第五步：此时，细胞受到培养环境的刺激，开始新一轮的分裂，细胞学习到细胞性质的分化，然后细胞会沉淀在培养皿底部，细胞分裂结束后，就形成了新一代的细胞，从而完成了一次贴壁细胞传代培养实验。
以上就是贴壁细胞传代培养的具体操作步骤，要想做好这项实验，必须按照上述步骤进行操作，只有这样，才能确保实验数据的准确性。
同时，必须注意实验中的环境条件，确保培养基的新鲜，避免菌类污染，进而确保实验的准确性和稳定性。
贴壁细胞传代培养技术正逐步得到应用，目前，它已经运用于很多细胞学领域，尤其是在细胞分化和细胞系的建立中发挥了重要作用。
贴壁细胞传代培养技术更加方便、成本更低，并且能够解决传统细胞培养技术中遗传变异现象导致的假阳性，新增细胞不能够稳定传代等问题，所以受到越来越多的关注。
最后，应该提醒大家，在实验中一定要遵守实验安全规范，做好实验前预防措施，以保障实验安全、获得准确有效的实验结果。
总之，贴壁细胞传代培养技术由于其便捷性、稳定性、节约开销等优点，在细胞学领域具有重要的应用价值，未来将会发挥更大的作用。
贴壁细胞的脂质体转染
一、实验材料1、宿主细胞CHO（贴壁细胞）2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司）3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔……板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。
以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。
（我的接种密度是3~4*105/ml.）转染时，细胞要达到90~95%的融合。
2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min）3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积250 ul）4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。
5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。
6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
在37℃，5％的CO2中保温5~6小时。
7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48~72h检测转染水平。
8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养基。
三、个人经验：我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。
转染率很高。
以下是个人经验，与大家分享。
1.细胞的状态。
这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。
有文献说传代不要超过17代。
我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。
2.细胞的融合度。
贴壁细胞培养步骤及注意事项
贴壁细胞培养步骤一、复苏1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。
液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。
2.把上述细胞悬液吸到装有10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。
3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。
吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。
4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。
5.3天换一次培养基（具体看细胞生长状态及培养液情况）。
二、传代1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。
2.把原有培养基吸掉。
3.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS4.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。
5.当看到细胞开始脱离培养皿时倒掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终止消化。
6.用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。
7.把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
8.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。
9.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。
一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个，继续培养。
10.若是只培养一皿，只需吹散后倒剩1/4左右，重新加入培养液继续培养。
三、冻存1.把原有培养基吸掉。
2.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS3.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。
4.去掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终止消化。
5.吹落后把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
6.加入1毫升冻存液悬浮细胞，装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。
7.4℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。
配制溶液一、培养基配制（1）（DEME培养基）89%基础培养基+10%血清（FBS）+1%双抗45毫升培养基+5毫升血清+0.5毫升双抗（2）（1640培养基）89%基础1640培养基+10%血清（FBS）+1%双抗45毫升培养基+5毫升血清+0.5毫升双抗二、冻存液90%血清+10%DMSO；DMSO要慢慢滴加，边滴边摇三、消毒液75%的酒精注意事项（1）进入细胞间必须严格按照下列步骤操作①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。
细胞贴壁实验报告
一、实验目的1. 掌握细胞贴壁生长的基本原理和方法。
2. 了解细胞培养过程中细胞贴壁生长的重要性。
3. 观察细胞在不同条件下的贴壁生长情况，分析影响细胞贴壁生长的因素。
二、实验原理细胞贴壁生长是细胞在体外培养过程中的一种重要生长方式。
细胞在培养皿表面贴附，通过细胞与培养皿表面的相互作用，细胞逐渐伸展、增殖。
细胞贴壁生长对于细胞培养、细胞实验和药物筛选等具有重要意义。
三、实验材料1. 细胞：小鼠心肌细胞（HL-1细胞）2. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清3. 培养工具：培养皿、移液枪、吸球、无菌操作台、显微镜、盖玻片、载玻片4. 实验试剂：0.5%多聚赖氨酸、PBS缓冲液、胰蛋白酶四、实验步骤1. 预处理：将细胞从培养瓶中取出，用胰蛋白酶消化后，用PBS缓冲液清洗细胞，收集细胞悬液。
2. 细胞贴壁：将细胞悬液加入培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
3. 贴壁条件优化：1）将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟，自然晾干后，将其放置于培养皿底部。
2）将细胞悬液加入盖玻片上，使其均匀铺展。
3）将培养皿置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
4. 观察与记录：1）每隔一定时间（如1小时、2小时、4小时等），在显微镜下观察细胞贴壁生长情况。
2）记录细胞贴壁生长速度、细胞形态、细胞数量等指标。
5. 数据分析：1）根据观察结果，绘制细胞贴壁生长曲线。
2）分析影响细胞贴壁生长的因素，如培养时间、细胞密度、培养条件等。
五、实验结果与分析1. 细胞贴壁生长曲线：细胞在培养皿中贴壁生长，随着时间的推移，细胞数量逐渐增加，细胞形态逐渐伸展。
2. 影响细胞贴壁生长的因素：1）培养时间：细胞贴壁生长速度随培养时间的延长而增加，但过长的培养时间会导致细胞密度过大，影响细胞生长。
2）细胞密度：细胞密度越高，细胞贴壁生长速度越快，但过高的细胞密度会导致细胞相互挤压，影响细胞生长。
3）培养条件：适当的温度、pH值、气体环境等有利于细胞贴壁生长。
lipofectamine3000说明方案
0.2 μｇ 0.4 μＬ
5μＬ 5μＬ
室温孵育 5 分钟
加入 DNA- 脂质体复合物
96-well
至细胞中
DNA- 脂质体复合物
10 μＬ
50 μＬ 1μｇ 2μＬ
25μＬ 25 μＬ
24-well
50 μＬ
250 μＬ 5μｇ 10 μＬ
125μＬ 125 μＬ
6-well
250μ L
mine?300 0 转染 DNA 产 品参考 用量
37°C 孵育细胞 2–4 天。然后分析转染细胞。
转染 siRNA 至细胞中时，遵循如上所述的 DNA 实验方案，但在稀释 siRNA 时不要
加入 P3000?试剂 (第 3 步)。
细胞培养容器 贴壁细胞
Opti-MEM 培 养 基 稀 释 Lipofectamine ?3000 试 剂 （ 2 管）
Opti-MEM 培养基 Lipofectamine ?3000
10 μＬ
DNA ，制备 DNA 预混液， 然后添加 P3000?试剂，充 分混匀 Lipofectamine ?3000 试 剂 中加入稀释的 DNA(1:1 比例 )
DNA(0.5 – 5μ g/ μ L)
P3000?
试
剂
(2 μ L/ μ gDNA)
稀释的 DNA
稀
释
的
Lipofectamine?3000
96-well
24-well
6-well
表 1：使
1–4×104 5μ L×２
0.5–2×105 25μ L×２
0.25–1×106
用
125 μ L×２
0.15 和 0.3 μＬ 0.75 和 1.5 μＬ 3.75 和 7.5 μＬ lipofecta
贴壁细胞培养步骤及注意事项
贴壁细胞培养步骤及注意事项第一步：准备工作1.1清洁实验台面和培养器具在开始培养之前，应先清洁培养器具和实验台面，以确保无菌环境。
1.2准备培养基根据不同实验的要求，准备需要的培养基，并确保其无菌。
1.3预热培养基和器械将培养基和器械置于37℃的培养箱中，使其达到需要的温度。
第二步：细胞分离2.1收集细胞使用无菌技术，收集需要培养的细胞，最好使用处于快速生长期的细胞。
2.2细胞计数使用显微镜和计数板计数细胞数目，以便确定接种的细胞数量。
2.3离心细胞将细胞离心，去除上清液。
第三步：贴壁培养3.1接种细胞将细胞重新悬浮在预热的培养基中，并根据需要的细胞浓度接种到培养器皿中（例如培养皿、培养瓶等）。
3.2倾斜培养器具倾斜培养器具，以确保细胞均匀分布并黏附于底部。
3.3培养器出现倒置的小液滴密封培养器，以防止培养基蒸发和外界污染。
第四步：培养条件4.1恒温条件将培养器放在恒温箱中，维持适当温度（通常为37℃）和湿度。
4.2CO2条件对于一些细胞，需要提供CO2环境以保持合适的pH值。
可以通过加入CO2气体或培养箱添加CO2控制器来实现。
4.3培养时间根据细胞类型和所需实验目的，确定合适的培养时间。
第五步：观察和维护细胞5.1细胞观察使用显微镜定期观察细胞的形态和增长情况。
注意检查细胞的黏附性和细胞层的均一性。
5.2细胞维护根据需要，定期更换培养基，以保持细胞的正常生长和功能。
5.3细胞传代根据细胞生长状态，当细胞层达到一定的密度时，可进行细胞的传代，以保持细胞的活性和健康。
注意事项：1.确保所有用于细胞培养的器具和培养基都是无菌的，以防止细胞受到外界污染。
2.严格遵循无菌技术，避免任何可能导致细菌和真菌污染的操作。
3.细胞培养过程中，保持实验室卫生，定期清洗工作台和设备。
4.在细胞培养中，要注意避免细胞的过度处理和操作。
5.对于一些特殊类型的细胞，如原代细胞，可能需要特殊的培养条件和技术，需要进行额外的注意和维护。
上海opti-mem转染试剂原理
上海opti-mem转染试剂原理上海opti-mem转染试剂是一种常用于细胞转染实验中的试剂，它可以帮助研究人员将外源DNA分子有效地引入到目标细胞中。
该试剂采用了一种特殊的化学方法，通过改变细胞膜的通透性，使得外源DNA能够穿过细胞膜进入到细胞质中。
下面是关于上海opti-mem转染试剂原理的详细介绍：1. 上海opti-mem转染试剂的成分：上海opti-mem转染试剂主要由两部分组成：脂质体和DNA复合物。
脂质体是由一种正离子表面活性剂（如聚乙烯亚胺或脂肪酸酯化合物）和胆固醇等组分构成的，它们能够与DNA形成可逆的复合物。
DNA复合物则是由目标DNA分子与脂质体形成的复合物，通过这种复合物，外源DNA能够进入到细胞内。
2. 上海opti-mem转染试剂的作用机制：-第一步，脂质体与DNA复合物的形成：脂质体与目标DNA形成可逆的复合物，这个过程主要是通过静电相互作用来进行的。
脂质体中的正带电离子通过与DNA的负带电离子相互作用，使得DNA与脂质体相结合。
-第二步，脂质体与细胞膜的结合：通过与细胞膜上的负带电成分相互作用，脂质体能够与细胞膜上的带电成分相结合。
这种结合主要是通过静电相互作用来实现的。
-第三步，细胞膜的改变：脂质体与细胞膜结合后，会改变细胞膜的组织结构和特性，使得细胞膜的通透性增加。
这个过程中，细胞膜上的磷脂分子会发生重新排列和重新组装，从而改变了细胞膜的通透性。
-第四步，外源DNA的进入：由于细胞膜的通透性增加，外源DNA能够通过细胞膜进入到细胞质中。
一旦进入到细胞质中，外源DNA就能与细胞内的各种分子（如细胞核、细胞器等）相结合，从而实现转染。
综上所述，上海opti-mem转染试剂通过改变细胞膜的通透性，使得外源DNA能够进入到细胞中，并与细胞内的各种分子相结合。
这种转染试剂具有简单、高效、可靠等特点，被广泛应用于各种细胞转染实验中。
支原体检测-贴壁细胞培养法
支原体检测(DNA荧光染色法-贴壁细胞爬片法)实验原理：利用荧光试剂二苯甲酰胺(Hoechst33258),结合到细胞和支原体DNA,A-T富含区域的特点，在紫外激发束（波长为330～380nm）激发下产生黄绿色荧光的原理，利用荧光显微镜检测细胞中是否存在支原体污染。
实验基本材料准备：（1）实验仪器：荧光显微镜（莱卡激发波长330～380nm紫外光UV-2A滤光片）；（2）实验耗材：盖玻片（12×12mm）；载玻片（76×26mm）；甲醇；冰乙酸；荧光染料Hoechst33258；封片液；吸管；六孔板；细胞培养液（MEM完全培养基和五抗生素MEM培养基）；1xPBS；细胞消化液（0.25%胰蛋白酶液）（3）待检细胞：将待检细胞传1～2代，每次培养3～5d，作为待检样品（4）盖玻片准备：盖玻片处理同载玻片，擦净后干燥用无菌去离子水2～8℃保存待用。
（5）载玻片准备：玻片置于自来水中加洗涤剂煮20min，然后用自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗3次，放入去离子水中2～8℃待用实验试剂试液配制：(1)固定液配制:甲醇:冰乙酸（3:1）混匀，现配现用；(2)二苯甲酰胺荧光染料(3)封片液；(4)1×PBS细胞样品制备及实验步骤（1）待检细胞处理：①将长成致密单层的细胞用0.25%的胰蛋白酶+0.05%EDTA消化，800～1000r/min离心5min，弃上清胰蛋白酶混合液，所沉淀的细胞用1×PBS洗1次，离心条件相同；用细胞生长液按实验要求稀释至 1×105/ml，加入3ml/孔至6孔板中（6孔板中事先加入盖玻片），在5%CO2，37℃孵箱中培养3～5天；（2）固定：用枪头吸出六孔板中的培养液，用1×PBS清洗六孔板5ml，吸出，加入新配制的固定液5ml，放置5min，吸出；再加新固定液到六孔板中放置10min，用枪头吸出；（3）清洗细胞：加入5ml蒸馏水至六孔板，3min，清洗三次；（4）染色：每孔加入33258荧光染料工作液2ml，室温避光放置30min。
optimem
optimemopti-mem® i 减血清培养基是一种经过改良的 minimal essential medium (mem)，能够使胎牛血清添加量减少至少50%，而生长速率或形态无变化。
还推荐 opti-mem® i 培养基与阳离子脂质体转染试剂（如 lipofectamine™试剂）配套使用。
opti-mem® i 培养基可用于各种悬浮和贴壁的哺乳动物细胞，包括 sp2、ae-1、cho、bhk-21、hek 和原代成纤维细胞。
针对广泛的细胞培养应用，提供了多种组分的 opti-mem® i 改良培养基。
完整配方保密。
有关更多信息，请联系技术服务部。
opti-mem® i 培养基的使用 opti-mem® i 减血清培养基是一种内含胰岛素、转铁蛋白、次黄嘌呤、胸苷和微量元素的独特培养基。
这些附加组分可使血清添加量减少至少 50%。
opti-mem® i 培养基使用碳酸氢钠缓冲体系 (2.4 g/l)，因此需要 5–10% co2 的环境来维持生理 ph 值。
cgmp 生产和质量体系 opti-mem® i 在位于纽约格兰德岛上符合 cgmp 要求的工厂内生产。
该工厂是在 fda 登记的医疗器械生产商，且通过 iso 13485 标准认证.为确保供应链的稳定，同时提供由苏格兰工厂生产的同等 opti-mem® i 产品(31985-047)。
该工厂亦是在 fda 登记的医疗器械生产商，且通过 iso 13485 标准认证。
for research use or further manufacturing. not for diagnostic use or direct administration into humans or animals.。
lipofecmine说明书
6.加入DNA-脂质体复合物至细胞中。
7.37℃孵育细胞2-4天。然后分析转染细胞。
siRNA转染
转染siRNA至细胞中时，遵循如上所述的DNA实验方案，但在稀释siRNA时不要
加入P3000?试剂(第3步)。
细胞培养容器
96-well
24-well
6-well
贴壁细胞
1–4×104
5μL
25μL
125μL
室温孵育5分钟
加入DNA-脂质体复合物至细胞中
96-well
24-well
6-well
DNA-脂质体复合物
10μL
50μL
250μL
37°C孵育细胞2–4天。然后分析转染细胞。
表1：使用lipofectamine?3000转染DNA产品参考用量
Opti-MEM培养基
10μL
50μL
250μL
DNA(0.5–5μg/μL)
0.2μg
1μg
5μg
P3000?试剂(2μL/μgDNA)
0.4μL
2μL
10μL
Lipofectamine?3000试剂中加入稀释的DNA(1:1比例)
稀释的DNA
5μL
25μL
125μL
稀释的Lipofectamine?3000
lipofectamine3000protocol中文版
1.接种细胞至70-90%汇合度时转染
2.使用Opti-MEM培养基稀释Lipofectamine?3000试剂(2管)，充分混匀
3.使用Opti-MEM培养基稀释DNA，制备DNA预混液，然后添加P3000?试剂，充分混匀。
4.在每管已稀释的Lipofectamine?3000试剂中加入稀释的DNA(1:1比例)。
贴壁培养实验报告
一、实验目的1. 掌握动物细胞贴壁培养的基本方法。
2. 观察细胞贴壁、生长、增殖过程。
3. 了解细胞培养技术的基本原理和应用。
二、实验原理动物细胞贴壁培养是一种常见的细胞培养方法，适用于大多数动物细胞。
该方法将细胞悬浮于含有营养物质的培养液中，使其附着于培养皿底部或盖玻片上，形成单层或多层细胞。
在适宜的培养条件下，细胞可进行增殖、分化等生物学活动。
三、实验材料1. 细胞：小鼠成纤维细胞2. 培养基：DMEM培养基3. 试剂：10%胎牛血清、青霉素-链霉素混合液、0.25%胰蛋白酶4. 仪器：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、移液器、培养皿、盖玻片等四、实验方法1. 细胞复苏：将冷冻保存的细胞取出，用预热的DMEM培养基溶解，37℃水浴箱中复温至37℃，加入10%胎牛血清、青霉素-链霉素混合液，制成细胞悬液。
2. 细胞接种：将细胞悬液用移液器吸取，接种于培养皿中，每孔加入2ml细胞悬液，置于CO2培养箱中培养。
3. 细胞传代：待细胞生长至80%左右融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液。
按照1:3的比例传代培养。
4. 观察细胞贴壁、生长、增殖过程：每隔一定时间，观察细胞在培养皿中的生长状态，包括细胞形态、数量、融合程度等。
五、实验结果1. 细胞复苏：冷冻细胞在37℃水浴箱中复温后，逐渐恢复活力，出现典型的细胞形态。
2. 细胞接种：细胞接种后，约24小时开始贴壁，约48小时形成单层细胞。
3. 细胞传代：细胞传代后，生长状态良好，形态、数量、融合程度与原代细胞相似。
4. 细胞生长曲线：观察细胞生长过程，绘制细胞生长曲线，显示细胞呈指数增长。
六、实验讨论1. 本实验成功实现了动物细胞贴壁培养，观察了细胞贴壁、生长、增殖过程。
2. 细胞贴壁培养过程中，温度、CO2浓度、pH值等环境因素对细胞生长具有重要影响。
本实验中，CO2培养箱的温度设置为37℃，CO2浓度为5%，pH值稳定在7.2-7.4。
OPTIMEM进行贴壁细胞培养的实验方法
OPTIMEM进行贴壁细胞培养的实验方法贴壁细胞培养是一种常用的细胞培养方法，其中OPTIMEM是一种用于培养特定类型细胞的培养基。
下面将详细介绍使用OPTIMEM进行贴壁细胞培养的实验方法。
实验材料和仪器：1.贴壁细胞系：例如，HEK293细胞或NIH/3T3细胞等。
2. 细胞培养培养基：例如，Dulbecco修改的Eagle培养基（DMEM）或Roswell Park Memorial Institute 1640培养基（RPMI 1640）。
3.OPTIMEM培养基。
4.烧杯和离心管。
5.无菌培养皿。
6.无菌培养壶。
7.显微镜。
8.离心机。
9.生物安全柜。
10.细胞移液器和离心管。
11.无菌培养室。
实验步骤：1.贴壁细胞的准备a.预先处理细胞培养器皿，将其在生物安全柜中用70％乙醇消毒，并用无菌PBS洗涤2次。
b.从细胞培养器皿中收集细胞，可以使用三文鱼糖蛋白酶或胰蛋白酶来消化细胞。
将细胞悬浮在培养基中，并利用细胞计数板在显微镜下计数细胞数。
c.获得所需数量的细胞，通常为1×106细胞/毫升。
d.用无菌PBS洗涤细胞2次并将其重悬于OPTIMEM培养基中，使细胞的最终浓度为1×105细胞/毫升。
e.获取无菌培养皿，将细胞悬浮液转移到培养皿中。
f.将培养皿放入无菌培养室，并将其放入培养箱中进行培养。
2.细胞培养和观察a.将培养皿放入培养箱中，在37℃，5%CO2的恒温培养箱中培养细胞。
b.每天观察细胞的生长情况和形态学特征。
使用显微镜定期检查细胞的形态和密度。
c.检查细胞的污染和部分剥离，如果有必要，及时更换培养基。
3.细胞传代a.当细胞达到80-90％的密度时，用无菌PBS洗涤培养皿。
用胰蛋白酶消化细胞。
注意避免过度消化引起细胞死亡。
b.离心细胞悬浮液，去除上清液。
c.用新的OPTIMEM培养基将细胞悬浮，将细胞转移至新的无菌培养皿中。
d.将培养皿放入培养箱中进行培养。
PROTOCOL FOR EDIT II NEW
PROTOCOLBEXCUY21 EDITII电转悬浮细胞1.消化收集悬浮细胞于指形管中。
2.离心收集细胞,控制转数在800-1000转左右。
离心3-5min，离心时间可根据客户样本自行调整，弃掉上清。
3.吸取一定量的OPTI-MEM I 充分重悬细胞（建议2ml），再次离心收集细胞。
弃掉上清。
（最大程度的洗掉血清，血清会影响转化效率）。
4.加入同样体积的OPTI-MEM I，悬浮细胞。
此时，可进行活细胞计数，建议加入trypen blue染色后计算活细胞数量。
同时，进行第二次离心收集细胞。
结束后，弃上清。
5.根据4计算得到的细胞大致数量，推算出要加入的OPTIMEMI的总量。
（对首次尝试的细胞，推荐先用20-25ul OPTIMEM悬浮1X106的细胞），使得电阻达到200欧姆。
举例：如果1计算出的细胞总数是6X106，那么根据每个电击杯(gap=2mm) 中添加1X106的细胞数量，若每个电击杯中的终体积达到25ul左右来计算，应该加130ul-140ul左右（实际加入150ul，但由于操作中，去上清会去的不完全干净，会有些许的液体残留在管内，所以一般要加入少一点的量，来保证平分6管之后，体积不会超出25ul太多）6．充分悬浮细胞，加入质粒，每个gap=2mm电击杯中添加5ug的质粒，那么，6个处理，总共添加30ug质粒，若质粒浓度为5ug/ul，则共添加6ul。
7．充分混匀细胞，分装至电击杯中，每个电击杯26ul。
轻轻在超净台上磕一磕，保证液体落到杯底部，并且没有气泡，气泡会影响转化效率。
8．此时，6个电击杯中装有相同的细胞和质粒，此时，可进行多个参数的电转实验。
9．设定参数大概流程：i 点击NEW，选择DECAY MODE中的+/-mode，enterii 编辑程序参数，save the data and name it。
PS：将Capacitance(uF)在940即可。
主界面选择Decay模式编辑程序参数实时输出数据iii 保存好程序后，按standby，仪器准备好开始电击了，此时，start和Ω键亮起。
贴壁细胞培养流程
贴壁细胞培养流程-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII贴壁细胞培养流程1.将自己的细胞取出来，观察密度。
（细胞密度大于等于80%就可以处理了）2.准备传代需要的实验器材及试剂（5ml、1ml枪头，PBS,培养基，废液缸）3.将培养瓶中培养液倒出（培养瓶举高一点，不要太靠近废液缸，以免污染）4.每次加3ml左右PBS洗细胞，洗两次（注意不要将细胞吹打下来。
用PBS洗的目的：传代细胞所用的培养基一般含有血清，而血清能影响胰酶的活性，使其失效，因此一般在加胰酶之前会用PBS洗一下，避免胰酶活性降低）5.加入1ml胰酶，前后摇匀，在显微镜下观察其形态（为什么用胰酶消化：细胞外含有多种胞外蛋白,如胶原蛋白。
这些蛋白使细胞间或细胞与培养瓶内壁粘连起来。
用胰蛋白酶分解这些蛋白质后它们就分开了。
胰酶消化过度：消化过度，一方面会对细胞本身造成伤害，另一方面，造成细胞流失，也就是吸取消化液时，由于消化过度，其中大量溶在消化液中的细胞被吸走，导致细胞数量减少）6.等到细胞变圆，没有连成一片且开始慢慢脱落下来的时候就可以终止消化了（如果想加速消化，就把细胞放回培养箱）7.终止消化：加入5ml左右培养基，并将细胞吹打下来。
吹打完后在显微镜下观察吹打情况。
（注意四个角落的细胞是否吹打下来）8.把细胞吸到离心管中，离心5分钟1000转。
9.离心完后取出离心管，离心管底部有一团白色的细胞。
10.倒出培养液，加入2ml左右培养基并吹散细胞。
11.取出一个培养瓶，加入7ml左右培养基。
12.吸取0.4ml左右细胞加入培养瓶，混匀培养瓶中细胞并前后摇匀。
做好标记，放入培养箱。
（吸取前先混匀离心管中细胞。
）2。
OPTI-MEM进行贴壁细胞培养的试验方法
O P T I - MEM进行贴壁细胞培养的实验方法日期：2012-05-17来源：互联网作者：青岚点击：194次相关专题无血清培养基可以提供细胞贴壁需要的一些基质，本文总结了利用无血清培养基OPTI-MEM进行贴壁细胞的脂质体转染试验材料，步骤、个人经验以及问题分析。
贴壁细胞的脂质体转染一、实验材料1、宿主细胞CHO贴壁细胞）2、脂质体LIPOFECTAMINE2000（invitrogen 公司）3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen 的LIPOFECTAMINE200说明书上列举了24孑L、12孑L、6孔……板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。
以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。
（我的接种密度是3~4*105/ml.）转染时，细胞要达到90~95%勺融合。
2、溶液1: 240ul 无血清培养基+10ullipofectamine2000perwell（总体积250ul）（温育5min）3、溶液2: Xul无血清培养基+4ug质粒perwell（总体积250ul）4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。
5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。
&将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
在37C, 5%勺C02中保温5~6小时。
7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37C, 5%勺C02中48~72h检测转染水平。
8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1: 10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。
三、个人经验：我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。
OPTI-MEM进行贴壁细胞培养的实验方法
OPTI-MEM进行贴壁细胞培养的实验方法日期：2012-05-17来源：互联网作者：青岚点击： 194次•MEM细胞培养基无血清培养基可以提供细胞贴壁需要的一些基质，本文总结了利用无血清培养基OPTI-MEM进行贴壁细胞的脂质体转染试验材料，步骤、个人经验以及问题分析。
贴壁细胞的脂质体转染一、实验材料1、宿主细胞CHO(贴壁细胞)2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000(invitrogen公司)3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔......板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。
以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧!1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。
(我的接种密度是3~4*105/ml.)转染时，细胞要达到90~95%的融合。
2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well (总体积250 ul)(温育5min)3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well(总体积250 ul)4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。
5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。
6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
在37℃，5%的CO2中保温5~6小时。
7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5%的CO2中48~72h检测转染水平。
8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例(根据细胞的生长情况)接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。
三、个人经验：我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。
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OPTI-MEM进行贴壁细胞培养的实验方法
日期：2012-05-17来源：互联网作者：青岚点击：194次
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•MEM细胞培养基
无血清培养基可以提供细胞贴壁需要的一些基质，本文总结了利用无血清培养基OPTI-MEM进行贴壁细胞的脂质体转染试验材料，步骤、个人经验以及问题分析。
贴壁细胞的脂质体转染
一、实验材料
1、宿主细胞CHO(贴壁细胞)
2、脂质体LIPOFECTAMINE2000(invitrogen公司)
3、6孔细胞培养版
4、无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)
5、转染级质粒
二、实验步骤
invitrogen的LIPOFECTAMINE2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔......板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所
以一直采用的是6孔版做的转染。
以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧!
1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。
(我的接种密度是3~4*105/ml.)转染时，细胞要达到90~95%的融合。
2、溶液1：240ul无血清培养基
+10ullipofectamine2000perwell(总体积250ul)(温育5min)
3、溶液2：Xul无血清培养基+4ug质粒perwell(总体积
250ul)
4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。
5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml无血清培养基。
6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
在37℃，5%的CO2中保温5~6小时。
7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5%的CO2中48~72h检测转染水平。
8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例(根据细胞的生长情况)接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。
三、个人经验：
我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。
转染率很高。
以下是个人经验，与大家分享。
1.细胞的状态。
这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。
有文献说传代不要超过17代。
我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。
2.细胞的融合度。
细胞的融合度必须要达到90%才能做，细胞太少，容易死的。
3.无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍(我曾比较过OPTI-MEM与PBS或无血清的DMEM，前者的转染效率确实高)。
注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。
如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。
4.加入无血清培养基后5~6小时更换全培养基。
无血清培养基培养时间过长，对细胞是有毒性的，这里有血的教训!
5.转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。
浓度不要低于0.35ug/ul。
低浓度的质粒，我做的结果都不好。
6.48小时mRNA表达最高;72h蛋白表达最高。
加转染试剂(Opti-MEMI),细胞就浮起或死亡问题分析?
各位前辈：我想把microRNA转到成纤维细胞内，用的是GIBCO(tm)Opti-MEMIReduced-SerumMedium(1X)和Lipofectamine?2000转的。
现在的问题是一加转染试剂细胞就大量死亡。
Opti-MEM和冲洗用的PBS都37度预热过的。
甚至我用无血清的DMEM对照也大量死亡。
有时细胞死亡稍微好点，是不是和细胞批次关系更密切，还是有其他原因。
我的实验操作：
110%血清DMEM接种细胞在24孔板，长至30~50%满底时进行转染。
2lipofectamine20000.5ul稀释于
25ulOpti-MEMIReduced-SerumMedium(1X)(GIBCO)静置5分钟3microRNA10pM稀释于25ulOpti-MEM
4混匀2和3，加Opti-MEM至500ul。
室温静置30min。
5用PBS(室温)轻轻冲洗培养空，镜下观察部分细胞略变圆(或有变圆倾向)，但没什么细胞浮起。
吸去PBS，轻轻加入2和3的混合物。
镜下观察，即刻细胞大量浮起，或细胞挛缩，有细胞死亡倾向。
6h后证实细胞大量死亡。
但有细胞干死在培养皿底的印迹。
不同批次的细胞，死亡情况略有不同。
问题分析：
1.不是说明书上说什么你就做什么，你是有自主意识的。
2.你的细胞加opti-MEM就不好有两种可能：a。
你养的细胞有问题，或者有共生菌，改变培养条件就可能爆发;b。
你的细胞对opti-MEM敏感。
为什么一定要用opti?你没有自己的主见吗?
3.你的转染有问题。
从你的描述来看，你并不是接种后24hr 左右立即做转染，而是让它长到50%左右，也就是如果不到50%，你也许会长更久，对吗?——这是转染实验的大忌，超过24hr细胞对转染会不敏感，转染效率下降。
4.你转染时选择的细胞丰度也没有太大的问题，但是这个也是具体问题具体对待。
像HeLa是绝对要30%左右的，就是这样48hr后，细胞已经铺得密密麻麻;就不要想95%了，那样的细胞只能扔掉，一天换几次新鲜的培养基也跟不上培养基变黄的速度。
需要参考的东西包括你细胞原本的生长速度，对lipo2K的敏感程度(被抑制和毒死的情况，我可以负责任的告诉你lipo2K
非常毒，他们的lipo2K是稀释到33%的产品，他们100%的
lipo2KCD是另卖的，其中原因之一就跟毒性有关，没有多少细胞能耐受)，总之要确保你的细胞在24hr长到合适的浓度做转染，转染40-48hr后铺满孔，或多或少一点点也可。
5.由于lipo2K毒性很高，如果实在不合适，你应该考虑更换其他的转染试剂;此外，应该用你的平时养细胞的培养基做转染，不过记得去除抗生素，另外稀释lipo2K和质粒的培养基要去血清去抗生素的。
6.无血清细胞处于一种应激状态，本来就长不好，这时候你投毒，当然更差。
lipo2K不是不计较培养基是否有血清吗，所以在“双无”培养基稀释lipo2K和RNA，形成复合物后可以投到含血清的无抗生素的培养基中。
实际上我们转染用的培养基，double血清含量(普通5%，转染用10%)。
早期lipo的说明书要求“双无”，3hr后添加double血清培养基。
实际操作发现，也可以直接投入double血清培养基中。
7.无抗生素的原因是，细胞膜被穿孔，抗生素进入直接杀细胞。
经验推荐：OPTI-MEM与PBS和无血清的DMEM培养基相比较，LifeTech的GIBICO无血清培养基OPTI-MEM的转染效率比较高，不妨试下。