《微生物鉴定指导原则》解读
2010年版微生物限度检查法及应用指导原则的介绍
增、修订内容（6）-控制菌检查
1、增加“控制菌检查用培养基的适用性检查”
（8）液体培养基指示能力检查： 分别接种不大于100cfu 的试验菌（见表2）于被检 培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定 的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养 基管比较，被检培养基管试验菌生长情况、指示 剂反应等应与对照培养基一致。
起草的指导思想
微生物限度检查法应用指导原则 ： 为更好应用微生物限度检查法（附录ⅩⅢC），特制定本指 导原则。 对标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步的说明。
主要说明的内容有（1）微生物限度检查法适用范围的说明 （2）关于表面活性剂、灭活剂及中和剂的说明（3）方法选 择的原则及离心沉淀法的说明（4）对照培养基概念、用途 及分发（5)对“无法消除抑菌作用”情况的说明(6)控制菌检 查确证方法的选择原则（7)微生物限度标准如何制定和执行？ (8)化学药制剂微生物限度检查如何执行？(9)如何确定一个 药品的微生物检测项目？(10)制定药品的微生物限度标准的 依据。
增、修订内容（6）-控制菌检查
1、增加“控制菌检查用培养基的适用性检查”
（4）液体培养基促生长能力检查：分别接种不大 于100cfu 的试验菌（见表2）于被检培养基和对照 培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及 最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被 检培养基管试验菌应生长良好。
增、修订内容（6）-控制菌检查
增、修订内容（6）-控制菌检查
2、删除“控制菌验证时的阴性菌对照组” 3、控制菌判断：由“应进行分离、纯化、染色镜 检和适宜的生化试验” “应进行分离、纯 化、染色镜检和适宜的鉴定试验” 4、大肠菌群检查用培养基：由胆盐乳糖发酵培养 基 乳糖胆盐发酵培养基
非无菌产品微生物限度检査指导原则
中国药典2015年版性项下的有关内容对准确度进行评价。
2.精密度微生物定量检验的精密度是指在检验范围内，对同一个均匀的样品多次重复取样测定，其检验结果的一致程度，通常采用标准偏差或相对标准偏差来表示，也可以采用其他适宜的方式。
精密度验证的方法是：制备试验菌的菌悬液，齒悬液的浓度应选择为能够准确读数的最高浓度，然后系列稀释至较低浓度（如小于l O cfu/m l)。
每个试验菌选择其中至少5个浓度的菌悬液进行检验。
每一个浓度至少应进行10次重复检验，以便能够采用统计分析方法得到标准偏差或相对标准偏差。
一般情况下，可以接受的相对标准偏差(R S D)应不大于35%。
不考虑特殊的检验结果，替代方法的相对标准偏差（R S D)应不大于药典方法。
例如，药典菌落计数平皿法其可接受的相对标准偏差（R S D)与含菌浓度的关系见表2。
表2不同含蔺浓度下预期的相对标准偏差cfu/皿预期RSD<10<35%10 〜30<25%30 〜300<15%3.专属性微生物定量检验的专属性是指通过检测适宜的试验菌，以证明检验方法与其设定目的相适应的能力。
例如，菌落计数平皿法其设定目的在于检出一定数量的微生物，则其专属性验证应证明当样品中存在一定数量的试验菌时，通过平皿法检验，能够检出试验菌，而样品的存在不会对结果造成影响。
专属性验证时，应能够设计出可能使替代方法出现假阳性的实验模型来挑战替代方法，从而确认替代方法的适用性。
当替代方法不依赖微生物生长出菌落或出现混浊就可以定量时(如不需要增菌或在1〜50cfu范围内就可直接测定菌数的定量方法），以上验证方式就显得更为重要。
4.定量限微生物定量检验的定量限是指样品中能被准确定量测定的微生物最低数量。
由于无法得到含有已知微生物数量的实验样品，因此，在定量限验证时，应选择在检验范围内至少5个菌浓度，每个浓度重复取样测定不少于5次，替代方法的定量限不得大于药典方法。
USP-35-1113 微生物鉴定、鉴别及菌株分型指导原则翻译稿
通过表型进行微生物鉴定
表型方法是通过基因表达产物区分不同的微生物。通常这需要相当数量的单菌落纯培养 物。微生物活化、繁殖和鉴定受到培养条件的限制，事实上许多环境中的微生物目前还不能 通过常规培养条件分离。此外，由原代微生物传代的分离的得到的新鲜子代培养物，其表型 性质可能不会充分表达。但是，很多鉴定系统都是基于碳源利用、生理生化反应而设计的，
这些函数的数学推导见表 4。
表 4 两行两列联表采用培养方法和替代 PCR 方法（ISO 5725-1 和 5725-2 2004）*
PCR 方法
培养方法
阳性
阴性
合计
阳性
a 阳性
b 假阴性
a+b
阴性
c 假阳性
d 阴性
c+d
合计
a +c
b+d
* ISO 5725-1:1994 准确度（真实性和精密）的测量方法和结果-第 1 部分：总则和定义， ISO 5725-2:1994 准确度（真实性和精密）的测量方法和结果-第 2 部分：标准测量方法的重复 性和再现性的基本方法。
分类 菌落 形态 生理特性 生化特性 抑制 血清 化学分类 生态学
表 1 表型特征用于微生物分类学 特征特性
菌落形态, 菌落颜色, 形状和大小, 色素产生 菌体形态, 菌体大小, 菌体形状, 鞭毛类型, 储存物质, 革兰氏染色, 芽孢染色, 产孢情况
耐氧性, pH 范围, 最适温度和范围, 抗盐性 碳源利用, 碳水化合物氧化和发酵, 酶反应
微生物实验室规范指导原则
三、培养基的贮藏
商品化培养基应根据使用说明书上的要 求进行储存。
所采用的保藏和运输条件应使培养基最 低限度失去水分并提供机械保护。
自配培养基应标记培养基的名称、批号、 配置日期并在验证的条件下储存。
1、不得储藏在高压菌器中。
2 、制备好的培养基应保存在2～25℃、 避光的环境。
3 、保存于密闭容器中，可防止水分流失 以延长保存时间。
试验结果的判断
一、影响试验结果的因素 ⑴活微生物 ⑵受到外界影响因素较
实验结果分析与评价
1、对实验结果进行充分的分析和全面的评 价是十分重要的。
分析内容
⑴实验室环境 ⑵抽样区的防护条件 ⑶样品本身对微生物是否具毒性 ⑷实验操作是否规范
2、如果依据分析调查结果发现，试验
全过程中任何一个环节有错误，可判实 验结果无效，如果需要，重新抽样复试.
谢谢，再见！
4、培养基的有效期－是指已通过促生长 试验的培养基在整个有效期内均需符合 这些相应的标准。
5、对配制培养基的过程作详细的记录。
常用菌种管理和保存
菌种的保存
微生物实验过程中，实验菌株可能是最 敏感的，因为它们的生物活性和特性依 赖于合适的试验操作和贮藏条件。
菌种的保存和处理
1、实验室菌种的处理和保藏的程序应标 准化，使尽可能减少菌种污染和生长特性 的改变。
微生物实验室规范指导原则
影响药品微生物的检验结果的因素
1、实验人员在取样或试验过程中污染微生 微。
2 、生物学分析方法本身的误差。 3 、样品中或环境中微生物分布不均匀等因
素在药品检验中，为保证微生物试验数据 的可靠性和重现性，药品微生物实验室必 须使用经验证的检测方法并按良好的实验 室规范指导试验。
非无菌药品微生物限度检查指导原则
非无菌药品微生物限度检查指导原则微生物限度检查是药品质量控制中的重要环节，尤其对于非无菌药品而言更为重要。
本文将对非无菌药品微生物限度检查的指导原则进行详细介绍，旨在提高药品的质量安全性。
一、检验项目及标准非无菌药品微生物限度检查的主要检验项目包括总生菌数、大肠菌群、霉菌和酵母菌等。
每一项检验项目都有相应的标准来衡量合格与否。
以下是常用的标准：1. 总生菌数：根据药典要求，大部分非无菌药品每克不得超过1000 CFU（菌落形成单位）。
2. 大肠菌群：大肠菌群是肠道中的常见菌种，其存在可能暗示有肠源性污染。
检验结果一般要求不得检出大肠菌群。
3. 霉菌和酵母菌：霉菌和酵母菌是环境中广泛存在的微生物，在非无菌药品中的存在可能引发变质，甚至导致严重的药品质量问题。
一般情况下，每克药品中不得检出霉菌和酵母菌。
二、样品的选择和采集在进行微生物限度检查前，需选择合适的样品，并采取正确的样品采集方式。
以下是一些常用的样品选择和采集方法：1. 样品选择：根据药品的特性，选择代表性的样品进行检测。
选取多个批次的不同规格的样品进行检验更有利于全面评估该药品的微生物污染水平。
2. 样品采集：在采集样品前，先进行适当的表面消毒，以避免外源性污染。
采集时应遵循严格的无菌操作，确保样品的真实性和可靠性。
常用的样品采集方法包括划线法、切割法、稀释法等。
三、检验方法和操作流程微生物限度检查需要使用一系列严格的操作流程和检验方法，以保证结果的准确性和可比性。
以下是一般的操作流程：1. 样品预处理：根据药品的特性，选择适当的预处理方法，如溶解、稀释、震荡等，以提高微生物的检出率。
2. 培养基选择：根据不同的菌种需求，选择适宜的培养基进行菌落的培养。
常用的培养基有营养琼脂平板、大肠埃希菌选择平板、马铃薯葡萄糖琼脂平板等。
3. 培养条件：根据菌种的生长特性和检验项目的要求，设定适当的温度、时间和培养条件，以促进菌落的生长。
4. 菌落计数：通过目视或自动计数法，对培养基上的菌落进行计数。
药品微生物检验替代方法验证指导原则
药品微生物检验替代方法验证指导原则本指导原则是为所采用的试验方法能否替代药典规定的方法用于药品微生物的检验提供指导。
随着微生物学的迅速发展，制药领域不断引入了一些新的微生物检验技术，大体可分为三类：（1)基于微生物生长信息的检验技术，如生物发光技术、电化学技术、比浊法等；(2)直接测定被测介质中活微生物的检验技术，如固相细胞技术法、流式细胞计数法等；（3)基于微生物细胞所含有特定组成成分的分析技术，如脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。
这些方法与传统检查方法比较，或简便快速，或具有实时或近实时监控的潜力，使生产早期采取纠正措施及监控和指导优良生产成为可能，同时新技术的使用也促进了生产成本降低及检验水平的提高。
在控制药品微生物质量中，微生物实验室出于各种原因如成本、生产量、快速简便及提高药品质量等需要而采用非药典规定的检验方法（即替代方法）时，应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。
微生物检验的类型及验证参数药品微生物检验方法主要分两种类型：定性试验和定量试验。
定性试验就是测定样品中是否存在活的微生物，如无菌检查及控制菌检査。
定量试验就是测定样品中存在的微生物数量，如菌落计数试验。
由于生物试验的特殊性，如微生物检验方法中的抽样误差、稀释误差、操作误差、培养误差和计数误差都会对检验结果造成影响，因此，药品质量标准分析方法验证指导原则（附录XIX A)不完全适宜于微生物替代方法的验证。
药品微生物检验替代方法的验证参数见表1。
表1 不同微生物检验类型验证参数注：尽管替代方法的验证参数与药品质量标准分析方法验证参数有相似之处，但是其具体的内容是依据微生物检验特点而设立的。
替代方法验证的实验结果需进行统计分析，当替代方法属于定性检验时，一般采用非参数的统计技术；当替代方法属于定量检验时，需要采用参数统计技术。
进行微生物替代方法的验证时，若替代方法只是针对药典方法中的某一环节进行技术修改，此时，需要验证的对象仅是该项替代技术而不是整个检验方法。
微生物监测和控制指导原则
动、引起微生物污染的事故、日常操作记录反映出倾向性的数据
时应考虑修改监测频次。
2．监测标准
各洁净级别空气悬浮粒子的标准见表 3、微生物监测的动态
标准见表 4。
洁净度级别
A级 B级 C级 D级
表 3：各洁净级别空气悬浮粒子的标准
悬浮粒子最大允许数/立方米
静态
动态
≥0.5μm ≥5.0μm ≥0.5μm ≥5.0μm
本指导原则包括人员要求、初次使用的洁净实验室参数确 认、微生物监测方法、监测频次及监测项目、监测标准、警戒限 和纠偏限、数据分析及偏差处理、微生物鉴定和微生物控制。
人员 从事药品洁净实验室微生物监测和控制的人员应符合现行 《中国药典》附录中“药品微生物实验室指导原则”的相关要求。
确认 初次使用的洁净实验室应进行参数确认，确认参数包括物 理参数、空气悬浮粒子和微生物。洁净实验室若有人员流动、超 净工作台等重大设备运转、空气调节系统等重大变化时应重新进 行参数测试。 药品洁净实验室物理参数的测试应当在微生物监测方案实
9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则
本指导原则是用于指导药品微生物检验用的洁净室等受控 环境微生物污染情况的监测和控制。
药品洁净实验室是指用于药品无菌或微生物检验用的洁净 实验室、隔离系统及其它受控环境。药品洁净实验室的洁净级别 按空气悬浮粒子大小和数量的不同参考现行“药品生产质量管理 规范”分为 A、B、C、D 4 个级别。为维持药品洁净实验室操作 环境的稳定性、确保药品质量安全及检测结果的准确性，应对药 品洁净实验室进行微生物监测和控制，使受控环境维持可接受的 微生物污染风险水平。
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微生物鉴定指导原则
9204 微生物鉴定指导原则本指导原则为非无菌产品微生物限度控制菌检查中疑似菌的鉴定，以及药物原料、辅料、制药用水、中间体、终产品和环境中检出微生物的鉴定提供指导。
当微生物的鉴定结果有争议时，以《伯杰氏系统细菌学手册》 (《Bergey，s Manual of Systematic Bacteriology》)现行版的鉴定结果为准。
微生物鉴定是指借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程，它是药品微生物检验中的重要环节，药典附录相应章节中对检出微生物的鉴定做了明确规定，如“非无菌产品的微生物检查:控制菌检查” （通则1106）中选择培养基或指示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定； 对“无菌检查法”（通则1101）的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定，以判定试验是否重试；药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则（通则9203）中建议对洁净室和其他受控环境分离到的微生物进行鉴定，以掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查。
此外，在药品生产中，有时亦需对药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间产物和终产品中检出的微生物进行适当水平的鉴定。
微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定和菌株分型。
大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中，对所检出微生物的常规特征包括菌落形态学、细胞形态学(杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等)、革兰染色或其它染色法、及某些能够给出鉴定结论的关键生化反应(如氧化酶、过氧化氢酶和凝固酶反应)进行分析，一般即可满足需要；非无菌药品产品的控制菌检查应达到种的水平；无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装）失败时，对检出的微生物鉴定一般需达到菌株水平。
一、微生物的鉴定程序微生物鉴定的基本程序包括分离纯化和鉴定，鉴定时，一般先将待检菌进行初步的分类。
鉴定的方法有表型微生物鉴定和基因型微生物鉴定，根据所需达到的鉴定水平选择鉴定方法。
中国药典 药品微生物实验室规范指导原则
药品微生物实验室规范指导原则药品微生物实验室规范指导原则用于指导药品微生物检验实验室的质量控制。
药品微生物的检验结果受很多因素的影响，如样品中微生物可能分布不均匀、微生物检验方法的误差较大等。
因此，在药品微生物检验中，为保证检验结果的可靠性，必须使用经验证的检测方法并严格按照药品微生物实验室规范要求进行试验。
药品微生物实验室规范包括以下几个方面：人员、培养基、菌种、实验室的布局和运行、设备、文件、实验记录、结果的判断等。
人员从事药品微生物试验工作的人员应具备微生物学或相近专业知识的教育背景。
实验人员应依据所在岗位和职责接受相应的培训，在确认他们可以承担某一试验前，他们不能独立从事该项微生物试验。
应保证所有人员在上岗前接受胜任工作所必需的设备操作、微生物检验技术和实验室生物安全等方面的培训，经考核合格后方可上岗，同时，实验室应制定所有级别实验人员的继续教育计划。
检验人员必须熟悉相关检测方法、程序、检测目的和结果评价。
微生物实验室的管理者其专业技能和经验水平应与他们的职责范围相符。
如：管理技能、实验室安全、试验安排、预算、实验研究、实验结果的评估和数据偏差的调查、技术报告书写等。
实验室应通过参加内部质量控制、能力验证或使用标准菌株等方法客观评估检验人员的能力，必要时对其进行再培训并重新评估。
当使用一种非经常使用的方法或技术时，有必要在检测前确认微生物检测人员的操作技能。
所有人员的培训、考核内容和结果均应记录归档。
培养基培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。
适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证。
1．培养基的制备培养基可按处方配制，也可使用按处方生产的符合规定的脱水培养基。
在制备培养基时，应选择质量符合要求的脱水培养基或单独配方组分进行配制。
脱水培养基应附有处方和使用说明，配制时应按使用说明上的要求操作以确保培养基的质量符合要求，不得使用结块或颜色发生改变的脱水培养基。
微生物全基因组测序技术指导原则起草说明
附件2微生物全基因组测序技术指导原则起草说明一、制订的目的意义药品“全生命周期”质量控制的理念要求企业对药物原料、辅料、中间产品、终产品、制药用水、环境等中检测到的微生物进行鉴定和溯源分析。
《中国药典》2020年版以一代核酸测序技术（双脱氧链终止法，Sanger法）为基础，构建了药典分子生物学检测技术标准体系，其中通则1021对于细菌的鉴定可满足药典规定，能够实现大部分常见微生物的种属水平鉴定，但受限于特征核酸序列片段有限的分辨力无法实现近缘微生物鉴定以及分型溯源，仍需建立分辨力更高、覆盖范围更广的药品污染微生物鉴定溯源方法，完善药品污染微生物质量控制标准体系。
全基因组核酸测序可以获取最丰富、最全面的菌株遗传信息，在药品领域微生物近缘种属的精准鉴定、溯源调查分析和风险评估中展现出巨大优势，并且第二代、第三代高通量核酸测序技术逐渐发展成熟，已应用于检验检测、基础科学、临床诊断等各个领域，相关标准（GB/T30989-2014）和规范性文件已颁布实施。
因此，国家药典委员会微生物专业委员组织起草了《微生物全基因组测序技术指导原则》，旨在规范微生物全基因组核酸测序的方法流程和技术指标，确保测序结果的准确性。
二、起草过程《微生物全基因组测序技术指导原则》是在2018年国家药典会课题“微生物全基因组核酸测序技术用于药品质量控制指导原则的建立”（2018Y008）的支持下，由上海市食品药品检验研究院牵头，中国食品药品检定研究院、天津市药品检定研究院、辽宁省药品检验检测院、浙江现代生物技术发展中心、中国工业微生物菌种保藏中心等共同参与起草拟订的。
课题组通过广泛的文献标准规范调研分析、仪器运行参数试验验证，并邀请行业知名专家学者、仪器试剂生产厂家等多次研讨交流，拟定了全基因组核酸测序技术指导原则（草案）。
此外，为保证全基因核酸测序结果的准确性和相关参数设置的科学合理，课题组分别开展了全基因组核酸测序技术在药品微生物精准鉴定、污染微生物溯源调查及风险评估等领域的应用研究，探讨了拟订指导原则的实际应用场景和指导意义，并选择代表性试验菌株在不同类型的主流高通量测序平台开展鉴定、溯源分析研究，为药典标准中实验室要求、技术原理、主要技术指标、方法验证与应用等内容的制订提供实践和数据支撑。
中国药典版药品微生物检验指导原则
6.结果判断：计数结果与初始值（0时 菌数）的常用对数值比较，根据表2进行 判断。试验结果按有效数字的修约规则进 舍，保留一位小数。结果符合表2要求可 判断该产品抑菌效力符合规定。
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表
防腐剂抗菌效力标准
1类供试品 细菌 7天菌数下降不少于1.0 lg，14天菌数下降 不少于3.0 lg ，第14天到28天菌数不增加。 真菌 与初始值比，到7、14、28天菌数均不增加。 2 类供 试 品 细菌 14天菌数下降不少于2.0 lg ， 14天到28天菌数 不增加。 真菌 与初始值比，到14、28天菌数均不增加。 3类供试品 细菌 14天菌数下降不少于1.0 lg ， 14天到28天菌数均不增加。 真菌 与初始值比，14、28天菌数均不增加。 4类供试品 细菌，真 菌 与初始值比，14、28天菌数均不增长。 注：1、表中“不增加”是指对前一个测定时间，试验菌增加的数量不超 过0.5 lg。 2、0时菌数 供试品加入试验菌，摇匀，立即取样检查，培养，计数， 为0时 ，即初始值。
中国药典2010版药品微生物检查 指导原则
罗慧萍 四川省食品药品检验所
2010年3月
2010-03 1
我国微生物检查发展概况
抑菌剂效力检查法指导原则
药品微生物检验替代方法验证指导原则 微生物限度检查法应用指导原则
药品微生物实验室规范指导原则
2010-03 2
我国微生物检查发展概况
2010-03
320Leabharlann 0-03 72010版药典起草的基本原则 一、坚持保障药品质量、维护人民 健康的原则 二、坚持继承、发展、创新的原则 三、坚持科学、实用、规范的原则 四、坚持质量可控性原则 五、坚持标准先进性原则 六、坚持标准发展的国际化原则
微生物实验室菌型鉴定法规或指南
微生物实验室菌型鉴定法规或指南微生物实验室菌型鉴定是微生物学研究中至关重要的一环，为了确保实验室工作的准确性和可靠性，需要遵循一系列的法规和指南。
本文将从法规和指南的重要性、相关法规和指南的概述、鉴定方法的具体步骤以及质量控制等方面进行介绍。
一、法规和指南的重要性微生物实验室菌型鉴定法规和指南的制定，是为了确保微生物实验室工作的规范化、标准化和可控性，在实验过程中提高数据的可靠性和准确性。
通过遵守相关法规和指南，可以提高实验室的工作效率和质量，保障科学研究的进展和应用的可行性。
二、相关法规和指南的概述在微生物实验室菌型鉴定方面，国际上较为常用的法规和指南包括《美国药典》（USP）、《欧洲药典》（EP）、《中国药典》（CP）等。
这些法规和指南包括了实验室的组织管理、标本的采集、保存和运输、试剂和仪器的选择和使用、鉴定方法的具体步骤以及结果分析和报告等方面的要求和规定，对实验室的工作提供了非常重要的指导。
三、鉴定方法的具体步骤微生物实验室菌型鉴定的具体步骤包括了样本的准备、培养、鉴定和结果确认等几个关键环节。
首先是样本的准备，需要根据标本的来源和特点选择合适的采样方法，并对采集的标本进行适当的处理和保存。
其次是培养，通过不同的培养基和条件，促使菌株在实验室中迅速增殖，以便进行鉴定。
然后是鉴定，通过生理生化试验、分子生物学方法和形态学观察等手段，对培养出的菌株进行鉴定和分类。
最后是结果确认，通过对鉴定结果的分析和验证，确认菌型的种属和特性。
四、质量控制在微生物实验室菌型鉴定中，质量控制是非常重要的一环。
质量控制包括实验室内部的质量管理和外部的质量评价，通过标准化的操作流程和规范化的管理机制，确保实验室工作的准确性和可靠性。
同时，实验室需要参与外部的质量评价活动，接受第三方的审核和检验，提高实验室工作的透明度和公信力。
综上所述，微生物实验室菌型鉴定法规和指南的制定和执行，对于实验室工作的规范化和标准化具有重要的意义。
9653 药包材微生物检测指导原则
9653 药包材微生物检测指导原则
1. 检测方法选择：选择合适的微生物检测方法，如常规菌落计数、膜过滤法、快速培养法、分子生物学方法等。
根据样品特点和检
测目的选择适当的方法。
2. 样品处理：对于固体药包材，首先要进行样品处理，如切割、粉碎等，以获得代表性样品。
3. 样品预处理：对于液体药包材，可根据需要进行预处理，如
稀释、搅拌、过滤等，以提高检测灵敏度和准确性。
4. 菌落计数方法：采用菌落计数方法时，要选择适当的培养基
和培养条件，使得目标微生物能够生长并形成可数的菌落。
5. 快速培养法：根据需要，可以使用快速培养法，如生物化学
方法、光学方法、色谱法等，以快速获得结果。
6. 分子生物学方法：如PCR、荧光定量PCR等，可用于特定微生物的快速检测和鉴定。
7. 防止污染：在检测过程中要注意防止样品的污染，采取适当
的操作措施，如消毒、灭菌、无菌操作等。
8. 质控要求：必须建立质量控制体系，包括合理设置对照菌株、使用质控品、定期校准仪器设备等，确保检测结果的准确性和可靠性。
9. 结果解读：根据药品相关标准和规定，对检测结果进行解读
和判定，判断药包材是否符合要求。
10. 报告编写：编写详细完整的检测报告，包括样品信息、检测
方法、结果解读等内容，以便于药品生产或监管部门参考。
USP-35-1113 微生物鉴定、鉴别及菌株分型指导原则翻译稿.
〈1113〉微生物鉴定、鉴别及菌株分型指导原则前言药品原辅料，生产用水，生产环境，中间体以及终端产品等微生物检测时，需要对其特性进行确定。
需采用适当的鉴定及菌株分型（见章节末端表格）。
常规微生物特性确定包括菌落形态、细胞形态（杆菌、球菌、细胞排列方式、产胞结构），革兰氏染色或者其他染色方法，和特征生化反应（氧化酶，过氧化氢酶，凝固酶反应）。
在非无菌药品生产过程和一些无菌制剂的生产环境中，微生物鉴定到这个水平足以达到风险评估的目的。
有时，需要更精确的方法鉴定微生物到属或种水平。
另外，有些适宜的方法可以进行株水平鉴定，这有助于调查和确定微生物菌株的来源。
当某种微生物高频次出现或者超出产品使用限量时，鉴定该菌种是必须的。
另外，微生物鉴定有助于无菌过程控制，当无菌试验出现阳性反应时，需要评估可能的污染来源，如培养基倾注等环节。
微生物鉴定体系基于不同的分析方法，有时，鉴定结果受方法和数据库的限制。
微生物鉴定是通过与既定的标准或参考菌株（如模式菌株）比较，根据匹配特性（基因型和/或表型）确定其种属。
如果某种微生物在数据库中不存在，则得不到鉴定结论，制造商应根据应用需要不断扩充其数据库。
研究者应当考虑哪种鉴定系统数据库符合其需求。
根据需要鉴定的水平（属、种、株），研究者有时需要选择合适的方法进行常规微生物鉴定试验。
关于微生物鉴定试验，见USP 62章节“无菌产品的微生物检验”，该章提到通过微生物在选择培养基或者特征培养基上的形态特征鉴定微生物。
同样， USP 71章“无菌检验”提到，已经分离并鉴定的菌株，因为试验材料或者技术方法的原因不能再生长，判定试验无效。
USP 1116章“洁净室和其他受控环境的微生物评价”推荐分离微生物鉴定要达到一定比率以支持环境监测项目的需要。
菌株的分离与纯化菌种鉴定第一步是分离得到单个纯培养菌落。
一般采用平板划线法，通过四分之一区划线的方法，在适宜的固体培养基上划线，得到单个菌落。
微生物鉴定指导原则
9204 微生物鉴定指导原则本指导原则为非无菌产品微生物限度控制菌检查中疑似菌的鉴定，以及药物原料、辅料、制药用水、中间体、终产品和环境中检出微生物的鉴定提供指导。
当微生物的鉴定结果有争议时，以《伯杰氏系统细菌学手册》(《Bergey，s Manual of Systematic Bacteriology》)现行版的鉴定结果为准。
微生物鉴定是指借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程，它是药品微生物检验中的重要环节，药典通则相应章节中对检出微生物的鉴定做了明确规定，如“非无菌药品的微生物检查:控制菌检查”（通则1106）中选择培养基或指示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定； 对“无菌检查法”（通则1101）的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定，以判定试验是否重试；药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则（通则9203）中建议对洁净室和其他受控环境分离到的微生物进行鉴定，以掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查。
此外，在药品生产中，有时亦需对药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间产物和终产品中检出的微生物进行适当水平的鉴定。
微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定和菌株分型。
大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中，对所检出微生物的常规特征包括菌落形态学、细胞形态学(杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等)、革兰染色或其它染色法、及某些能够给出鉴定结论的关键生化反应(如氧化酶、过氧化氢酶和凝固酶反应)进行分析，一般即可满足需要；非无菌产品的控制菌检查一般应达到种属的水平；无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装）失败时，对检出的微生物鉴定至少达到种属水平，必要时需达到菌株水平。
一、微生物的鉴定程序微生物鉴定的基本程序包括分离纯化和鉴定，鉴定时，一般先将待检菌进行初步的分类。
鉴定的方法有表型微生物鉴定和基因型微生物鉴定，根据所需达到的鉴定水平选择鉴定方法。
《微生物鉴定指导原则》解读与介绍
微生物来源
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微生物表型的表达，除受 遗传基因控制外，还与分 离环境、培养基和生长条 件等因素有关。
表型微生物鉴定常需要大 量的纯培养物，一些从初 始培养物中刚分离出的受 损微生物还不能完整地表 达其表型属性。因此应注 意采用的培养基、培养时 间和传代次数。
非无菌产品的控制菌检查一般应达到种属的水平 无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装）失败时，
对检出的微生物鉴定至少达到种属水平，必要时需达到菌株水平
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微生物鉴定
微生物鉴定根据所需达到的鉴定水平选择鉴定方法：
表型微生物鉴定 基因型微生物鉴定 必要时采用多种鉴定方法确定
方法的局限性与数据库局限性息息相关：
— — 《微生物鉴定指导原则》
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微生物鉴定方法的确认
方法确认
确认（Validation）：对产品的各项相关事项作出科学性的评价 及书面记录的过程
验证（Qualification）：为确认的一个环节，目的是保证仪器在 使用的过程当中，符合原设计的要求并达到原拟的目的，亦即 产 生可信赖的量测结果
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溯源分析
菌株水平的鉴定非常重要：
在污染调查过程中，尤其是产品中的微生物数量高于建议水平或 出现异常高的微生物检出情况时
在无菌工艺中，尤其是无菌试验结果阳性和培养基灌装等模拟工 艺失败时
污染调查等应以基因型特征鉴定为主，表型特征鉴定为 辅。
同一地点同种菌表型和基因型特征是基本一致的 不同地点的同种菌表性特征可能基本一致，但保守及可变区域的
分类 培养物 形态学
生理学 生化反应 抑制性 血清学 化学分类 生态学
中国药典四部通则药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则
本指导原则是用于指导药品微生物检验用的洁净室等受控环境微生物污染情况的监测和控制。
药品洁净实验室是指用于药品无菌或微生物检验用的洁净实验室、隔离系统及其他受控环境。药品洁净实验室的洁净级别按空气悬浮粒子大小和数量的不同参考现行“药品生产质量管理规范”分为A、B、C、D 4个级别。为维持药品洁净实验室操作环境的稳定性、确保药品质量安全及检测结果的准确性，应对药品洁净实验室进行微生物监测和控制，使受控环境维持可接受的微生物污染风险水平。
偏差处理 当微生物监测结果超出纠偏限度时，应当按对纠正措施的有效性进行评估。
5. 微生物鉴定
建议对受控环境收集到的微生物进行适当水平的鉴定，微生物菌群信息有助于预期常见菌群，并有助于评估清洁或消毒规程、方法、清洁剂或消毒剂及微生物监测方法的有效性，尤其当超过监测限度时，微生物鉴定信息有助于污染源的调査。关键区域分离到的菌落应先于非关键区域进行鉴定。微生物鉴定参照微生物鉴定指导原则（通则9204）进行。
1. 监测方法
药品洁净实验室悬浮粒子的监测照《医药工业洁净室（区）悬浮粒子的测试方法》的现行国家标准进行；沉降菌的监测照《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行；浮游菌的监测照《医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法》的现行国家标准进行。
表面微生物测定是对环境、设备和人员的表面微生物进行监测，方法包括接触碟法和擦拭法。接触碟法是将充满规定的琼脂培养基的接触碟对规则表面或平面进行取样，然后置合适的温度下培养一定时间并计数，每碟取样面积约为 25cm2，微生物计数结果以cfu/碟报告；擦拭法是接触碟法的补充，用于不规则表面的微生物监测，特别是设备的不规则表面。擦拭法的擦拭面积应采用合适尺寸的无菌模板或标尺确定，取样后，将拭子置合适的缓冲液或培养基中，充分振荡，然后采用适宜的方法计数，每个拭子取样面积为约25cm2，微生物计数结果以cfu/拭子报告。接触碟法和擦拭法采用的培养基、培养温度和时间同浮游菌或沉降菌监测。表面菌测定应在实验结束后进行。
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微生物鉴定
微生物鉴定根据所需达到的鉴定水平选择鉴定方法：
表型微生物鉴定 基因型微生物鉴定 必要时采用多种鉴定方法确定
方法的局限性与数据库局限性息息相关：
未知菌鉴定是通过与微生物鉴定系统中的标准微生物（模式菌株） 的特征（表型和/或基因型）相匹配来完成的
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微生物鉴定程序
微生物鉴定的基本程序包括分离纯化、初筛和鉴定：
DNA-DNA杂交 DNA探针 限制性酶切片段图谱（Southern杂交） 16S rRNA序列 18S rRNA序列 多位点序列分型 聚合酶链反应 焦磷酸测序 核糖体分型分析
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基因型微生物鉴定
基因型微生物鉴定是否适合作为QC部门 普及的检测方法？ 基因型鉴定法不但技术水平要 保证，还需昂贵的分析设备和 实验条件（提取、扩增、杂交、 测序） 通常仅适合在关键微生物调查 中使用（如产品的不合格调查） ，若使用方法必须经过确认
溯源过程中为确保微生物为完全相同的菌株，需比对更 多的特征基因序列及片段，甚至是全基因组，如此可实 现既鉴定又溯源的目的。
《微生物鉴定指导原则》解读
梅里埃诊断产品（上海）有限公司 工业市场部
药典发布
第十届国家药典委员会根据 《中国药典》2015年版编制 大纲要求，开展了药典各部 附录整合、增修订及单独成 卷工作。 通过三次的意见征集，目前 已正式发布并实施了《中国 药典》2015年版，共四部内 容。 其中第四部新增章节9204《 微生物鉴定指导原则》。
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微生物鉴定方法的确认
确认试验所用的菌株应包括鉴定方法 供应商和药典推荐的适宜质控菌株 合适的鉴定系统，还应考虑其一致性 水平：试验菌株与模式微生物的一致 性水平通常应大于90% 微生物鉴定方法的确认应包括准确性、 专属性、重现性、灵敏性、阳性预测 值、阴性预测值
准确性%＝（结果正确的数量/总的结果数量）×100 重现性%＝（结果正确且达到一致性的数量/总的结果数量） ×100 用户考虑鉴定方法的适用性，应建立准确性和重现性接受标准
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表型微生物鉴定
全自动微生物鉴定及药敏系统：
基于金标准原理衍生出的全自动化系统，替代人工完成菌液配制、 试卡接种、孵育培养与结果判读
更全面的鉴定项目：除了按照传 统的革兰氏染色结果设置鉴定分 类，更针对制药业客户开发BCL、 CBC试卡 更适合的系统功能：极其简单直 观的可视化系统，协助用户轻松 储存及管理鉴定结果，针对制药 业客户的需求还可选择开通SRF、 21CFR11等功能
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表型微生物鉴定
表型鉴定全面解决方案：
系统名称 自动化程度 手工 手工比浊管 手工加样 自主孵育 菌悬液配制 试条/试卡 接种 培养条件 判读分析 肉眼判读 软件数据库 分析
自动 电子比浊仪 DENSIMAT 全自动 电子连续 加样枪 自主孵育 数读仪判读 软件数据库 分析
电子比浊仪 DensiCHEK Plus
——《微生物鉴定指导原则》
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微生物鉴定方法的确认
方法确认
确认（Validation）：对产品的各项相关事项作出科学性的评价 及书面记录的过程 验证（Qualification）：为确认的一个环节，目的是保证仪器在 使用的过程当中，符合原设计的要求并达到原拟的目的，亦即产 生可信赖的量测结果 鉴定方法供应商和用户协作完 成，QA、QC部门均参与
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微生物鉴定方法的确认
其他测定值：
∑＝100 所确认的 新方法
参照“金标准”方法 阳性 阳性 阴性 A B 阴性 C D
准确性＝(A＋D)/100×100% 灵敏（包容）性＝A/(A＋B)×100% 专属（排除）性＝D/(C＋D)×100% 阳性预测值（PPV）＝A/(A＋C)×100% 阴性预测值（NPV）＝D/(B＋D)×100% 分析准确度＝(A＋D)/(A＋B＋C＋D)×100% Kappa系数＝2(AD－BC)/[(A＋C)×(C＋D)×(A＋B)×(B＋D)]
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表型微生物鉴定
堪称表型鉴定的终极方法：
灵活易用：标品可来源于临床、食 品、洁净环境等，对标本状态、菌 龄要求不高，实验人员可灵活安排 工作 准确可靠：超强性能，系统对图谱 具有高分辨力 快速简便：手工操作极其简便（挑 取菌落、点板、加基质液），上机 后仅需45-90秒即可得到一个结果 节约环保：除了基质靶板2种耗材及 实验室配置的接种环、加样枪头， 无需其他投入，降低了平均成本； 产生的生物垃圾少
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表型微生物鉴定
微生物表型的表达，除受 遗传基因控制外，还与分 离环境、培养基和生长条 件等因素有关。 表型微生物鉴定常需要大 量的纯培养物，一些从初 始培养物中刚分离出的受 损微生物还不能完整地表 达其表型属性。因此应注 意采用的培养基、培养时 间和传代次数。
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表型微生物鉴定
手工微生物鉴定系统：
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溯源分析
菌株水平的鉴定非常重要：
在污染调查过程中，尤其是产品中的微生物数量高于建议水平或 出现异常高的微生物检出情况时 在无菌工艺中，尤其是无菌试验结果阳性和培养基灌装等模拟工 艺失败时
污染调查等应以基因型特征鉴定为主，表型特征鉴定为 辅。
同一地点同种菌表型和基因型特征是基本一致的 不同地点的同种菌表性特征可能基本一致，但保守及可变区域的 基因特征会有一定的差异
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表型微生物鉴定
依据表型特征（菌落形态、理化特征、化学成分）的表 达区分微生物的差异，是经典的分类鉴定法。
分类 培养物 形态学 生理学 生化反应 抑制性 血清学 化学分类 生态学 特征 菌落形态、菌落颜色、形状、大小和产色素 细胞形态/大小/形状、鞭毛类型、内容物、革兰染色、 芽孢/抗酸染色、孢子形成模式 氧气耐受性、pH范围、最适温度和范围、耐盐性 碳源利用、糖类氧化/发酵、酶的模式 胆盐耐受性、抗生素敏感性、染料耐受性 凝集反应、荧光抗体 脂肪酸构成、微生物毒素、全细胞组分 微生物来源
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表型微生物鉴定
常见表型及基因型霉菌鉴定 方法及数据库的比较
霉菌鉴定系统 分类 鉴定原理 蛋白组学 MALDI-TOF MS 80种真菌及80 种酵母菌 （第4版本） 专利
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数据库大小 数据库类型
表型微生物鉴定
表型微生物鉴定已广泛应用于药品微生物实验室。根据 适当比例的鉴定信息可掌握环境微生物菌群的变化并进 行风险评估，也可帮助调查人员进行污染调查并制定纠 正措施。
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表型微生物鉴定
手工微生物鉴定系统：
与时俱进：
-数据资料库是整套系统的心脏，在线运算使得结果显示有更大 的可能性 -用户可购买拥有5年使用权的 登录账号
历久弥新：
-进行了数据库和算法的全面升 级（最新版本3.1） -制药业用户需一系列的文件更 迭：软件及服务器认证文件、 apiweb的设计控制文件、更新 的ISO系统认证
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微生物鉴定
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微生物鉴定
微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定 和菌株分型。
大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境风险评估中，对 检出微生物进行常规特征（菌落形态、细胞形态、革兰染色、关 键生化反应）分析即可满足需要 非无菌产品的控制菌检查一般应达到种属的水平 无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装）失败时， 对检出的微生物鉴定至少达到种属水平，必要时需达到菌株水平
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微生物鉴定方法的确认
鉴定方法的确认注定是一个漫长而繁复 的过程？ 鉴定系统的确认试验按下述方法之一 进行：
采用现有方法和待确认方法对日常检验中 分离的微生物约50株进行平行鉴定试验， 结果的差异使用仲裁方法判定 使用12-15种已知的能代表常规分离到的 微生物的储备菌种，共进行50次鉴定试验 待确认方法对20-50株微生物（包括15-20 个不同的种）进行鉴定，结果与参照实验 室的鉴定结果一致
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微生物鉴定
微生物鉴定：指借助现有的分类系统，通过对未知微生 物的特征测定，对其进行分类的过程。
细菌、酵母菌和霉菌大类的区分 属、种及菌株水平的确定
•门 •纲 •目 •科 •属 •种
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微生物鉴定
关于鉴定的规定并非首次出现：
无菌检查法：若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判 供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效：供试品管中 生长的微生物经鉴定后确证是因无菌试验中所使用的物品和（或 ）无菌操作技术不当引起的 微生物限度检查法——控制菌检查法：若平板上生长的菌落与表 格所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜 检和适宜的鉴定试验 微生物限度检查法应用指导原则：若供试品检出疑似致病菌，确 证的方法应选择已被认可的菌种鉴定方法，如细菌鉴定一般依据 《伯杰氏细菌鉴定手册》
定性趋向性：
-具重复性的结果（不断重复出现的微生物种类）是一个有效合 理的环境监测的关键
定量趋向性：
-警戒水平：对于来自正常操作条 件下的潜在风险的警告，需要对 潜在的问题继续跟进 -行动水平：当超过了这个水平， 便会引发一个调查及基于该调查 而采取的措施
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基因型微生物鉴定
微生物基因型通常不受培养基和分离环境的影响。 涉及的方法很多：
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药典发布
检查法
无菌检查法 非无菌产品微生物检查：微生物计数法 非无菌产品微生物检查：控制菌检查法 抑菌效力检查法 灭菌法
指导原则
药品微生物检验替代方法验证指导原则 微生物检查法应用指导原则 药品微生物实验室质量管理指导原则 微生物鉴定指导原则 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则 无菌检查用隔离系统验证指导原则
基础培养基：含有细菌生长繁殖所需的基本营养物质，可供大多 细菌生长 营养培养基：在基础培养基中添加葡萄糖、富集因子等特殊成 分，供营养要求较高需特殊因子的细菌生长