SOD活性测定
SOD活性的测定
SOD活性的测定一、酶液的制备：称取0.5g样品放入研钵中，加2毫升0.05M PH=7.8的磷酸缓冲液及少量石英砂，冰浴研磨，匀浆倒入10毫升离心管中，再加3毫升磷酸缓冲液冲洗研钵，4℃冷冻离心20分钟（若做可溶性蛋白，转速为4000转/分钟，若不做，则10000转/分钟），上清液（酶液）倒入试管中，置于0~40C下保存待用。
二、S OD的测定：1.SOD反应液的配制：母液的配制：（1）0.05M 磷酸缓冲液（PH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml;(2) 130mM Met(甲硫氨酸)：取1.9399克Met 用磷酸缓冲液定容至100ml；现配现用。
（3）750μM四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml；现配现用,避光保存。
(4) 100μM EDTA-Na2: 取0.0372g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml，同上(5) 20μM FD (核黄素): 0.00753gFD用蒸馏水定容至1000ml。
避光保存。
同上SOD反应混液：磷酸缓冲液：Met：NBT：EDTA-Na2：H2O的比例为1.5：0.3：0.3：0.3：0.25，按母液顺序配制，然后依次加入核黄素0.3ml和酶液50微升。
2.SOD的测定：取型号相同的试管，吸取50微升的酶液，4000Lux照光30分钟，同时取两支试管，一支做对照，一支做空白（对照、空白不加酶液，以缓冲液代替）；空白置暗处，对照（CK）与酶液同置于4000Lux条件下照光30分钟，反应后遮光保存，以空白调零，560nm比色。
每个试验重复三次（3试验+3空白+3对照）3.结果计算SOD总活性（吸光度/g·FW）=（A CK—A E）×V／（W×0.5 ×Vt×A CK）单位：NBT光还原50%为单位SOD 比活性（酶单位/mg蛋白）= SOD总活性/蛋白质浓度SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；A ck为照光对照管的吸光度；A E为样品管的吸光度；V为样品液总体积；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。
SOD活性测定
氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。
（三）试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2.130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet,用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑(NBT)溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4.100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5.20μmol/L 核黄素溶液：称取0.00753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。
三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml 预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。
取1.5～2ml于10000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。
2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05 mol/L磷酸缓冲液 1.5130 mmol/L Met溶液0.3 13 mmol/L750 μmol/L NBT溶液0.3 75μmol/L100 μmol/L EDTA－Na2液0.3 10μmol/L20 μmol/L核黄素0.3 2.0μmol/L酶液0.05 对照2支管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积 3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。
3. SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管560nm波长下的吸光度。
SOD活性测定(连苯三酚自氧化法)
SOD(超氧化物歧化酶)活性测定连苯三酚自氧化法(邓碧玉，袁勤生，李文杰．改良的连苯三酚自氧化测定超氧化物歧化酶活性的方法[J]．生物化学与生物物理进展．1991，18(2)：163) 一、原理超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD)普遍存在动、植物的体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下面的反应：o 2.-H++HO 222+O反应产物H 2O 2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
二、材料、仪器设备及试剂(一)材料植物器官(花瓣、叶片等) (二)仪器设备冰箱、低温高速离心机、微量加样器 (1mL 、20μL 、 100μL)、移液管、精密电子天平、UV-752型紫外分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子(三)试剂(1) A ：Tris(三羟甲基氨基甲烷)0.2mol/L (121.14)：取24.228g 定溶至1000mL (2) B ：HCl (分析纯36-38％) 12当量：即12mol/L 取8.3mol/L 定溶至1000mL (3) 250mL A +200mL B 定溶至1000ml PH=8.3三、试验步骤 (一)酶液的制备(1)称取植物材料0.2g ，加50mmo·L -1的Tris-HCl 缓冲液(pH=8.3)1mL(分三次加) (2)2~4℃下研磨，12000r/m 离心15min ，制备粗酶液(每个样品设三个重复) (3)在25℃保温20min 的8mL50mmol/L(PH=8.3)Tris-Hcl 缓冲液中加入25℃预热的10µL 50mmol/L 的连苯三酚(对照管用10mmol/L 的Hcl 代替)先加酶液再加连苯三酚(二)酶活力的测定酶活性单位的定义：在1mL 反应液中每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50﹪的酶量定义为一个活性单位。
取两个石英比色杯(带盖)，按下表加入反应物试剂对照管样品管Tris-Hcl缓冲(pH=8.3) 8mL 8mL粗酶液－15μL连苯三酚溶液－10μLHCl 10μL －总量8mL 8mL从加入连苯三酚开始计时，迅速摇匀，使酶与底物充分反应,倒入比色杯，在752型分光光度计上每隔30s读取反应液的325nm处OD值，连续读6min。
SOD_测定方法
SOD_测定方法SOD（Superoxide Dismutase）是一种重要的抗氧化酶，它可以将有害的超氧自由基转化为氧和过氧化氢，从而保护细胞免受氧化损伤。
SOD的测定方法有多种，下面将介绍常用的几种方法。
1.超氧根自由基抑制法：该方法通过测定SOD对超氧自由基的抑制能力来测定SOD的活性。
超氧根自由基在存在特定底物的条件下，可以引起化学反应的颜色变化，通过测量这种变化的幅度可以得出样品中SOD的活性。
超氧根自由基抑制法具有可操作性强、结果可靠的特点，是常用的SOD活性测定方法之一2.X射线法：该方法利用X射线产生的自由基对辅酶A的氧化程度来测定SOD活性。
辅酶A在被氧化前后，有很大的吸收差别，可以通过比较吸收光谱来计算SOD活性。
3.含氮蓝法：含氮蓝为特定底物，可以在碱性条件下与还原型NBT（硝基蓝）产生紫色的还原型NBT。
SOD能够阻止NBT的还原反应，因此通过测量样品和对照组在一定时间内的吸光度差值，可以计算出SOD的活性。
4.电化学法：该方法利用电化学生物传感器对SOD的电化学反应进行测定。
在电极表面，SOD催化还原型O2为H2O2，而H2O2又在电极表面电催化为电流。
通过测量电流的大小，可以得出样品中SOD的活性。
这些方法各有优缺点，选择合适的测定方法应根据实验条件和目的来确定。
无论采用何种方法，都需要严格控制实验条件，如温度、时间、pH 值等，以确保测定结果的准确性和可重复性。
鉴于SOD活性在不同组织和物种之间有所差异，建议在研究中同时采用多个测定方法进行验证，以获得更可靠的结果。
抗氧化酶活性测定方法
抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类对抗氧化反应具有重要作用的酶。
其主要功能是清除体内的自由基，抑制过氧化物形成和脂质氧化反应，从而保护细胞免受氧化应激的伤害。
测定抗氧化酶活性有助于评估生物体内的氧化应激水平，为疾病的诊断和治疗提供重要的指导。
本文将介绍几种常见的抗氧化酶活性测定方法。
1.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法：SOD能够催化超氧阴离子（O2-）的还原反应，将其转化为较为稳定的氧气和过氧化氢。
常见的SOD活性测定方法有：-标准醛缩法：根据SOD催化的还原反应，利用NBT（硝基蓝盐）和醛缩剂的变色反应来测定SOD活性。
-自动化测定法：利用包含其中一种还原物质和pH染料的较为稳定的底物，通过测定底物的氧化程度来确定SOD活性。
-XTT法和WST-1法：由于SOD具有还原型的性质，可以通过测定细胞培养基中的还原型琼脂糖（XTT）或水溶性四硝基噻唑盐（WST-1）的还原动力学来测定其活性。
2.过氧化氢酶（CAT）活性测定方法：CAT主要参与还原过氧化氢（H2O2），将其转化为氧和水。
常见的CAT活性测定方法有：-色素法：利用黄曲霉素作为还原剂，观察黄曲霉素的消费量来测定CAT活性。
-光度法：通过测定样品中H2O2浓度的下降程度来间接测定CAT活性。
-氧化还原电极法：通过测定样品中H2O2浓度的下降速度来测定CAT活性。
3.过氧化物酶（POD）活性测定方法：POD主要参与氧气与还原型供体之间的氧化还原反应，转化为过氧化物（ROO-）。
常见的POD活性测定方法有：-色谱法：利用酚类底物的氧化反应，测定产生的醌类产物的含量来测定POD活性。
-酶标法：POD催化氧化反应会形成有色产物，通过测定产物的吸光度来测定POD活性。
4.谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性测定方法：GPx主要参与还原过氧化物，将其转化为相对稳定的醇和水。
常见的GPx活性测定方法有：-碳酸盐法：根据GPx还原底物中的碳酸盐，观察样品溶液pH值的变化来测定GPx活性。
SOD活性的测定-邻苯三酚自氧化法
SOD活性的测定-邻苯三酚自氧化法定义：25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%时所需的SOD量为一个活力单位。
按照GB/T5009.171-2003中邻苯三酚自氧化的方法测定酶活力，利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。
反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。
加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm处测定溶液的吸光度。
酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。
一、试剂：1、pH 7.8, 0.05mol/L的磷酸缓冲液：A液: 称取17.9g Na2HPO4•12H2O于容量瓶中定容至1L；B液: 称取 7.8g NaH2PO4•2H2O于容量瓶中定容至1L；取A液91.5mL和B液体8.5mL混匀得到pH 7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液。
2、C液: pH 8.20 ，0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)- 盐酸缓冲液(内含1mmol/L EDTA•2Na)：称取1.2114gTris和37.2mg EDTA•2Na溶于62.4mL 0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100mL。
3、 0.lmol/L盐酸溶液:量取2.lmL 12mol/L盐酸，蒸馏水定容至250mL。
4、.10mmol/L盐酸溶液:量取10mLO.lmol/L盐酸，蒸馏水定容至l00mL。
5、D液:4.5mmol/L邻苯三酚盐酸溶液：称取邻苯三酚(A.R)56.7mg溶于少量的10mmol/L的盐酸溶液，并定容至100mL。
二、仪器：1.冷冻离心机2.水浴锅；3．电子天平；4．紫外-可见分光光度计；5．精密酸度计，精确到0.01pH；6．10mL比色管；7．10mL离心管；8．玻璃乳钵。
三、实验步骤1．SOD粗酶液的提取称取叶片1g，置于研钵中研磨，加入3mL 0.05mol/L磷酸缓冲液，加入少量石英砂，继续在冰浴中的研钵内研磨成匀浆，取4mL至离心管中，于4℃10000r/min离心20min，上清液即为SOD粗提液。
SOD活性测定
超氧化物歧化酶（SOD）活力测定POD过氧化物酶（英文：Peroxidase）广泛存在于植物体中,是活性较高的一种酶.它与呼吸作用,光合作用及生长素的氧化等都有关系.在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化.一般老化组织中活性较高,幼嫩组织中活性较弱.这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素,增加木质化程度,而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加,所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标.此外,过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视.过氧化物酶能催化过氧化氢氧化酚类,产物为醌类化合物,此化合物进一步缩合或与其他分子缩合,产生颜色较深的化合物.一、目的学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。
二、原理SOD是含金属辅基的酶。
高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应：由于超氧自由基（O2.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。
并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。
核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还原生成二甲月替，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。
当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替生成速度减慢。
通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT 光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据SOD 抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。
找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50％时的酶量作为一个酶活力单位（U）。
三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料小麦、玉米、水稻、棉花等新鲜叶片2．主要仪器（1）722型或其他型号的可见分光光度计（2）万分之一分析天平（3）高速冷冻离心机（4）冰箱（5）光照箱：4 500Lux（6）带盖瓷盘 1个/处理（7）移液管架（8）研钵（9）离心管 5mL数个（10）微烧杯 10～15mL 8个/处理（11）移液管或加样器 0.5mL×4；1mL×2；2mL×2；5mL×1（12）微量进样器50μL×2；100μL×2（13）烧杯 50mL×3；100mL×5；500mL ×1；1 000mL×2（14）量筒 50mL×1；100mL×2（15）容量瓶 50mL×1；100mL×5；250mL×1；1 000mL×2（16）细口瓶 125mL×53．试剂（1）0.1 mol/L pH7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液A液（0.1 mol/L Na2HPO4溶液）：准确称取Na2HPO4· 12H2O（MW=358.14）3.5814g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。
超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法
超氧化物歧化酶（SOD ）活性的测定方法
一、试剂
1. 0.1mol/L HCl
2. 10mmol/L HCl
3. 0.1mol/L Tris 标准溶液：12.114g 三羟甲基氨基甲烷溶于蒸馏水，并定容至1000ml.
4. 50mmol/LTris 缓冲溶液：50ml0.1mol/L Tris 标准溶液中加入0.1mol/L HCl 19.9～22.0ml,定容至100ml ，PH 为8.20。
5. 30mmol/L 邻苯三酚盐酸溶液：3.7833g 邻苯三酚溶于10mmol/LHCl 中，并用10mmol/LHCl 定容至1000ml.
二、仪器
1. 紫外分光光度计
2. 酸度计
3. 恒温水浴锅
三、操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率测定
在试管中加入4.5ml 50mmol/LTris 缓冲溶液，于25℃保温20min,加入10～20ul 30mmol/L 邻苯三酚，立即计时并摇匀，倾于比色杯内，于325nm 下，每隔1min 测吸光值一次，空白以10mmol/L HCl 代替邻苯三酚，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min 左右。
%1004
min 1min 5⨯值值－第第自氧化速率＝OD OD 2.SOD 活性测定
将样液加入到Tris 缓冲溶液中，其余步骤同自氧化速率测定方法。
活力单位定义：将一定条件下使每毫升反应液自氧化速率抑制50%的酶量定义为一个单位（u ）。
样品质量样液体积样品稀释倍数自氧化速率速率自氧化速率－样液氧化＝活力（⨯⨯⨯⨯5.4%50%100)/SOD ml u。
SOD的活性测定
SOD活力测定（NBT还原法）植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。
这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。
近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。
过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。
自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。
生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。
植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。
抗坏血酸（VC）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。
SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2－、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。
超氧自由基（O2.－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。
自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。
如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2。
H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。
一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。
其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。
测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。
本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。
1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。
常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。
羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。
2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。
酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。
常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。
离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。
上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。
蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。
SOD酶活性测定方法
SOD酶活性测定方法SOD（超氧化物歧化酶）是一种重要的抗氧化酶，通过催化O2.-的自动氧化为O2和H2O2来清除有害氧自由基。
SOD的活性能够反映生物体内清除氧自由基的能力，因此SOD活性的测定对于研究氧自由基相关疾病以及抗氧化剂的评价具有重要意义。
以下是目前常用的几种SOD活性的测定方法：1. Nitroblue tetrazolium (NBT)法：这是最早用于测定SOD活性的方法之一、该方法基于超氧自由基能够氧化NBT成为紫色的甲胺蓝（blue formazan）。
SOD能够阻止NBT的氧化过程，从而减少blue formazan的产生。
测定时，试样中的NBT和蛋白质混合后加入酶底物，通过测定产生的blue formazan的吸光度来评估SOD的活性。
2. epinephrine autoxidation法：该方法基于SOD能够催化抑制肾上腺素自动氧化反应，从而测定其活性。
肾上腺素在氧气存在下会自动氧化生成可见光吸收的产物，而SOD的存在能够阻止这个自动氧化过程，减少可见光吸收的产生。
通过测定反应体系中可见光吸收的变化来评估SOD的活性。
3. Pyrogallol autoxidation法：该方法与上述方法类似，基于SOD能够催化抑制邻二氧苯酚（pyrogallol）自动氧化反应，从而测定其活性。
邻二氧苯酚在氧气存在下会自动氧化生成氧的产物，而SOD的存在能够阻止这个自动氧化过程。
通过测定反应体系中氧的产生速率或者邻二氧苯酚消耗速率来评估SOD的活性。
4. Xanthine oxidase法：该方法基于SOD能够催化脲酶氧化邻位双黄嘌呤（xanthine）生成尿酸，而脲酶则通过XOD（xanthine oxidase）作用于氧气生成邻位双黄嘌呤的过程来实现。
由于SOD能够清除产生的超氧自由基，从而减少尿酸的生成。
通过测定尿酸产生的速率来评估SOD的活性。
这些方法各自具有一定的优缺点，研究者们需要根据实际需要选择合适的方法来测定SOD活性。
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）L磷酸缓冲液(PBS，：A母液：L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量）71.7g；B母液：L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
L PBS（）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) ，B母液(NaH2PO4) ，用蒸馏水定容至1000ml。
参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。
（2）甲硫氨酸溶液：取 Met用磷酸缓冲液（）定容至1000ml。
（3）30μM EDTA-Na2溶液：取用磷酸缓冲液定容至100ml。
（4）60μM核黄素溶液：取核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。
（5）氮蓝四唑(NBT)溶液：取NBT用PBS定容至100ml，避光保存。
酶液制备：取（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。
2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液，磷酸缓冲液，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。
（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。
（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。
植物组织中SOD活性MDA含量的测定方法
植物组织中SOD活性MDA含量的测定方法超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量是评价植物细胞的氧化应激程度和损伤程度的重要指标。
下面将介绍常用的测定植物组织中SOD活性和MDA含量的方法。
一、SOD活性测定方法：1. 混合植物组织提取液：将适量的植物组织（如叶片、根部等）加入冰冻磨碎器中，加入适量的冰冷提取液（Tris-HCl缓冲液，pH 7.8或其他适宜缓冲液），按比例加入少量酒石酸、酚酸、DTT等，然后将混合物离心10分钟。
2.处理提取物：将上述所得的植物组织提取液加入活性溶液，如NBT、PIP等，混匀后放置在37°C水浴中反应一定时间。
3. 停止反应：将反应液加入组织破壁液（甘油、NaCl、Tween-20等混合物），混匀后放置一段时间，离心10-15分钟。
4.测定光密度：取上清液用比色计测定光密度（OD）值，以反映SOD的活性，活性越高，OD值越低。
二、MDA含量测定方法：1.组织提取：将适量的植物组织加入冰冷提取液（如磷酸盐缓冲液，pH7.4），用冷磨具磨碎并移至离心管中，离心5分钟收集上清液。
2.加入TBA液：取上清液与TBA液（三硝基苞球菌素溶液）按比例混合，混匀后在水浴中加热（100°C，10分钟），然后迅速冷却至室温。
3.离心沉淀：将样品离心10分钟，取上清液。
4.测定光密度：分别取上清液测定OD值，OD值越高，MDA含量越高。
三、优化与改进：1.提取液的选择：根据不同植物组织的特点选择合适的提取液，以提高SOD活性和MDA含量的测定效果。
2.比色反应的时间和温度的调整：根据植物组织中SOD活性的变化调整反应时间和温度，以保证测定结果的准确性。
3.重复测量：为了提高实验结果的可靠性，可以重复测量同一样本，并取平均值作为最终结果。
4.与对照的比较：将测定样本与对照组进行比较，以评估SOD活性和MDA含量的变化，进一步分析植物组织的氧化应激程度和损伤程度。
超氧化物歧化酶SOD活性测定
Fe-SOD的活性中心 是由一个铁离子构成 的。
Mn-SOD的活性中心 是由一个锰离子构成 的。
03
SOD活性测定的方法
化学发光法
总结词
灵敏度高、检测范围广
详细描述
化学发光法是一种通过化学反应产生光子的方法，其灵敏度高，可以检测到超低浓度的超氧化物歧化 酶活性。该方法具有较宽的检测范围，适用于不同来源和不同浓度的超氧化物歧化酶活性测定。
3
反应时间
根据实验要求，控制反应时间，以便准确测定酶 活性。
数据处理与分析
数据记录
01
详细记录实验过程中的数据，如反应速率、吸光度等。
数据处理
02
对记录的数据进行适当的处理，如计算酶活性、绘制图表等。
结果分析
03
根据实验结果，分析超氧化物歧化酶的活性变化，并得出结论。
05
SOD活性测定的应用
医学领域
SOD活性测定可以用于某些疾 病的辅助诊断和防治。例如， 在一些疾病中，SOD活性可能 会降低，导致生物体抗氧化能 力下降，加速细胞损伤。通过 对SOD活性进行测定，可以为 疾病的诊断和防治提供依据。
药物研发与评价
SOD活性测定可以用于药物研 发和评价。一些药物可能会影 响SOD活性，通过对SOD活性 进行测定，可以评估药物对生 物体抗氧化系统的影响，从而 为药物研发和评价提供参考。
电化学法
总结词
快速、便携
详细描述
电化学法是一种通过测量电化学信号来测定 超氧化物歧化酶活性的方法。该方法具有快 速、便携的特点，适用于现场检测和实时监 测。电化学法可以通过设计不同的电极和电 化学反应，实现对超氧化物歧化酶活性的快 速、准确测定。
04
SOD活性测定的实验步骤
实验五植物组织中SOD活性测定
实验五SOD 活性的测定一、实验目的学习并掌握氮蓝四唑（NBT）法测定植物体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的基本原理和操作方法。
二、实验原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
测定SOD 活性的方法很多，简便且常用的是NBT （氮蓝四唑）光还原法。
该方法的原理是超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
当反应体系中有可被氧化的物质存在时，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生氧气，氧气被单电子还原产生氧自由基，氧自由基则可将氮蓝四唑还原为蓝色的化合物，后者在560nm 处有最大吸收。
而SOD 可清除氧自由基，当反应体系中有SOD 存在时可抑制NBT 的还原，于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
因此可通过测定A560 来计算SOD 的活性，以抑制NBT 光还原反应50%所需的酶量为一个酶活性单位。
三、实验材料、试剂与仪器1. 实验材料：小白菜叶片。
2. 实验试剂：（1）0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；（3）750卩mol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；（4）100 卩mol/LEDTA-Na2 溶液：称取0.03721g EDTA-Na2 用磷酸缓冲液定容至1000ml；（5）20卩mol/L核黄素溶液：100卩mol/L核黄素溶液稀释5倍即实验所需的20卩mol/L核黄素溶液；（6）SOD提取介质：50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）内含1%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、3. 实验仪器：高速台式离心机，可见分光光度计，光照培养箱，专用试管，研钵等。
四、实验步骤1 、粗酶液提取将小白菜叶片放置在冰箱中冷处理3min，用作胁迫对照。
SOD活性测定
SOD活性测定：SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。
阻止中间物的积累而测定其酶活性。
1、试剂及仪器(1)邻苯三酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。
(2)UV－754紫外分光光度计。
2、测定方法：(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。
在25度、45ml`50mmol/L、PH值、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在mm 左右。
(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。
－A325mm/min----------------------------------------＊100％度样液稀释倍数样液稀释倍数酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------50％样液体积3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。
蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。
4、比活(u/mg蛋白)的计算：单位活力(u/ml) 总活力比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。
SOD测定方法
SOD测定方法SOD（超氧化物歧化酶）是一种抗氧化酶，主要作用是通过催化超氧自由基（O2-）的歧化反应，将其转化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2），从而保护细胞免受氧化损伤。
由于SOD在生理病理过程中起着重要作用，因此测定SOD活性对于研究氧化应激反应及疾病机制具有重要意义。
下面将介绍几种常见的SOD测定方法。
1.氧化还原法氧化还原法是目前应用较广泛的SOD测定方法之一、该方法基于SOD活性的表现为它能阻止自由基与还原型化合物（如亚硝酸钠）之间的反应。
通过测定反应体系中亚硝酸钠的降解速率可计算出SOD的活性。
这种方法简单易行，但可能受到其他抗氧化酶和化合物的干扰。
2.锰硞合成法锰硞合成法是一种经典的SOD测定方法，它利用SOD对超氧自由基的清除作用而催化锰硞的合成。
反应结束后，通过测定合成的锰硞的吸光度变化来计算SOD的活性。
这种方法比较准确，但操作较繁琐，不适合大规模高通量实验。
3.硝苯蓝法硝苯蓝法基于硝苯蓝的还原能力受SOD活性影响的原理。
在碱性条件下，硝苯蓝与NADH反应生成可溶性复合物，其吸光度与SOD的活性成负相关关系。
通过测定反应体系的吸光度变化可以计算出SOD的活性。
该方法操作简便，但对于抗氧化剂和金属离子敏感，可能会引起误差。
4.含乙酰亚胺百日咳法该方法利用含乙酰亚胺的百日咳试剂来测定SOD活性。
该试剂在碱性条件下能与过氧化氢反应，生成已知稳定的有色化合物。
SOD活性越高，生成的有色化合物越少，通过测定反应体系的吸光度变化可以计算出SOD 的活性。
该方法操作简单，结果可重复性好，但对于有机溶剂和金属离子敏感。
5.X-射线发射荧光法X-射线发射荧光法是一种新型的SOD测定方法。
该方法通过测定SOD 催化超氧自由基与荧光染料之间的作用，计算出SOD的活性。
这种方法灵敏度高，精度好，同时能够快速高效地测定多个样品，适用于大规模高通量实验。
综上所述，SOD的测定方法有很多种，选择适合自己研究的方法需要综合考虑测定条件、样本的特点以及所需的准确度和灵敏度等因素。
抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法
抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法抗氧化酶SOD（超氧化物歧化酶）、POD（过氧化物酶）和CAT（过氧化氢酶）是植物体内重要的抗氧化酶，在植物的抗逆境应对中起着重要的作用。
因此，对这些抗氧化酶的活性进行测定和分析是研究植物生理生化过程的重要方面之一测定抗氧化酶活性的方法一般分为两类：直接法和间接法。
直接法是通过测定一些特定底物的降解速率来反映酶的活性；间接法是通过测定酶催化底物形成的产物的生成速率来间接反映酶的活性。
下面将分别介绍抗氧化酶SOD、POD和CAT活性的测定方法。
1.SOD活性测定方法：SOD活性测定方法主要分为NBT法和EPX法两种。
（1）NBT法：这是一种直接法，其基本原理是SOD将还原型的NBT 还原成穆尔蓝染色形成具有最大吸收峰值的NBT离子。
实验步骤如下：a.首先准备SOD底物溶液，其组成为：50mM磷酸缓冲液（pH7.8）+13mML-甲硫氨酸+75μM硝基蓝硝酸盐（NBT）。
b.将样品加入上述的SOD底物溶液中，混匀。
c.加入适量的酶抑制剂，使停止酶的活性，并将其放在冰上。
d.使上述反应在37℃下进行10分钟。
e.加入已经冷却的硝酸亚铁和磷酸以停止反应，并将其放在冰上10分钟。
f. 测定变色液的吸收光谱在560 nm波长处的吸光度。
（2）EPX法：这也是一种直接法，其基本原理是SOD将乙酸型形成的4-无水乙烯甲基-3-硝基噻吩染色。
实验步骤如下：a. 首先在试管中加入1 ml乙酸型测定液。
b.分别加入适量的SOD样品。
c.在30分钟内使试管中乙酸型完全消除。
d. 测定出试管中产生的4-乙烯基-3-硝基-5-硝基噻吩的吸收光谱在260 nm波长处的吸光度。
2.POD活性测定方法：POD活性测定方法可分为直接法和间接法。
（1）直接法：这种方法基于过氧化反应的特点，利用dianisidine 与过氧化氢在催化剂POD作用下形成有色产物的现象来测定POD的活性。
实验步骤如下：a.在试管中加入0.1M磷酸盐缓冲液（pH6.0）。
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SOD活性测定：SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。
阻止中间物的积累而测定其酶活性。
1、试剂及仪器(1)邻苯三酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。
(2)UV－754紫外分光光度计。
2、测定方法：(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。
在25度、45ml`50mmol/L、PH值8.3、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在0.0700d/mm 左右。
(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。
0.0700－A325mm/min----------------------------------------＊100％度0.70样液稀释倍数样液稀释倍数酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------50％样液体积3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。
蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。
4、比活(u/mg蛋白)的计算：单位活力(u/ml) 总活力比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。
离子(O2-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。
由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2-)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。
按金属辅基成分的不同可分成3种类型。
最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。
每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。
第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。
第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。
Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。
[原理]SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。
其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。
在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。
其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。
化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。
Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定，重复性好。
但专一性和灵敏度不够理想，而且需要特殊仪器，实际应用受到限制。
亚硝酸盐形成法与CN—抑制剂或SDS处理相结合，应用于Mn-SOD测定，灵敏度比Cyte还原法提高数倍，而且专一性强，重复性好，操作方便，不需要特殊仪器和设备，易于实际应用和推广，是目前较好的测定方法之一。
在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。
本实验采用邻苯三酚自氧化方法。
邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2 -，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。
这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长出有强烈光吸收。
当有SOD存在时，由于它能催化O2 -与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。
酶活力单位定义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。
[试剂和器材]1、试剂（1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl称取Tris 0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用双蒸水溶解至80mL左右，用HCl调节pH =8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。
（2）10mmol/L HCl（3）50 mmol/L邻苯三酚称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。
（4）SOD样液2、器材（1）恒温水浴槽（2）紫外分光光度计（3）试管、刻度吸管、微量注射器[方法和步骤]1、邻苯三酚自氧化速率的测定取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。
要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。
试剂空白管（mL）自氧化管（mL）pH8.2、50mmol/L2.98 2.98Tris-HCl10mmol/L HCl 0.02 0.0150 mmol/L邻苯三酚- 0.012、SOD样液的活性测定样品管取代自氧化管。
样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。
其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。
试剂空白管（mL）样品管（mL）pH8.2、50mmol/L2.98 2.98Tris-HCl10mmol/L HCl 0.02 -SOD样液- 0.0150 mmol/L邻苯三酚- 0.01（3）计算实验二十六植物体内多酚氧化酶活性的测定一、目的通过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。
二、原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。
用分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。
反应式如下：多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2 ——————→ 邻醌＋H2O三、材料、仪器及试剂1. 材料：马铃薯块茎等2. 仪器：UV－1206或UV－1240分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。
3. 试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.01mol•L－1 pH 6.5磷酸缓冲液；0.1m mol•L－1pH6.5磷酸缓冲液；0.05 mol•L－1 pH5.5磷酸缓冲液；30%饱和度硫酸铵；0.1 mol•L－1儿茶酚；20％三氯乙酸。
四、实验步骤1. 粗酶液的制备称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1mol•L－1pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。
将所得沉淀溶于2～3ml 0.01mol•L－1 pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。
2. 活性酶的测定在试管中加入3.9ml 0.05 mol•L－1 pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol•L－1儿茶酚在37℃恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1～2min内测定吸光度变化（A）值。
五、酶活性的计算以每min内A525值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。
A 酶提取液总量（ml）酶活力（0.01A•min－1）＝———————×———————————0.01×反应时间测定时酶液用量（ml）A 酶提取液总量（ml）酶的比活性(0.01A•g－1Fw•min)＝—————————×——————————0.01×W×反应时间测定时酶液用量（ml）公式中：A —为反应时间内吸光度的变化值；W为样品鲜重（g）。
原理]SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。
其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。
在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。
其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。
化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。
Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定，重复性好。
但专一性和灵敏度不够理想，而且需要特殊仪器，实际应用受到限制。
亚硝酸盐形成法与CN—抑制剂或SDS处理相结合，应用于Mn-SOD测定，灵敏度比Cyte还原法提高数倍，而且专一性强，重复性好，操作方便，不需要特殊仪器和设备，易于实际应用和推广，是目前较好的测定方法之一。
在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。
本实验采用邻苯三酚自氧化方法。
邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2 -，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。
这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长出有强烈光吸收。
当有SOD存在时，由于它能催化O2 -与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。