高效液相色谱定性定量分析方法==
高效液相色谱简介及操作
HPLC和经典液相色谱法的比较
3.高效液相色谱法的分类
• 通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色 谱法和凝胶色谱法四大类。
4.如何阅读色谱图？？
tR：保留时间；tM：死时间； ：调整保留时间； W：峰宽
• 定性分析：在同一色谱系统中相同物质具 有相同的保留值 • 定量分析：组分含量与其响应值（峰高或 面积）成正比
2 色谱柱使用的注意事项
• 色谱柱在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动。 • 当分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存（一般 为甲醇）。 • 每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱。
3 其他注意事项
• 未经提取净化的蛋白样品、血样、生物样品绝对禁 止直接进样分析。 • 要注意流动相的脱气。 • 避免使用高粘度的溶剂作为流动相。 • 使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或缓冲液建 议不超过两天，最好每天更换。
（5）色谱柱平衡后，打开检测器（开灯） （6）测定样品 （7）清洗仪器
色谱柱及流路清洗 进样阀清洗 进样针清洗
四、主要注意事项
1 泵使用的注意事项
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防止任何固体微粒进入泵体（用0.22 um或0.45 um 的微孔滤膜过滤） 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲盐的流 动相不应保留在泵内更不允许留在柱内。 泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运 转一是会使大量空气进入柱内柱床崩塌、也会磨损柱塞、 密封圈，最终产生漏液。 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力。 流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量 的稳定性和分析结果。
c. 荧光检测器 (FLD) 只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基 酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定。
高效液相色谱仪的定性、定量分析(未知样品中苯甲酸含量的测定)
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量 分析方法。
二。实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法 和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒 多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力 流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入 口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似， 流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配 合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色 谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小 口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱 柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内 获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物， 更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化 合物。
三．仪器和试剂： 1． 高效液相色谱仪，VWD（254nm）检测仪。 2．色谱柱：C18 3．超声波发生器或水泵(用于过滤或排气) 4．注射器：50微升 5．容量瓶：100ml若干 6．移液管：2ml、4ml、8ml 7．流动相：甲醇：乙酸+乙酸氨（PH=3.5）=60：40， 制备前，先调节水(用酸或缓冲盐)的PH=3.5，进入系统 色谱前，用超声波发生器或水泵脱气。
四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂 ， 用 纯 水 或 去 离 子 水 溶 解 ， 定 容 到 100 毫 升 ， 浓 度 为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀 释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基 线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升 浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上 ），注入进样阀中。
高效液相色谱法3
2.内标法 内标法分为 工作曲线法 内标一点法 内标二点法 内标对比法 校正因子法 在HPLC中最常用内标对比法。 选择内标物的三个条件(纯、样品中不含有、保留时 间接近)，在HPLC中的要求与GC完全一致。一般可选择 一个化学结构与待测物质相似、物理性质相近的纯物质作 为内标物，加到待测样品溶液中，经过样品前处理后进样。 使用内标法可抵消因仪器稳定性差、进样量不够准确等原 因带来的实验误差。
(一) 多环芳烃的分析 一 多环芳烃的分析(图21－18) 多环芳烃的分析，可用反相或吸附色谱法分析。反 相色谱法用ODS柱，用乙腈−水或甲醇−水为流动相。但用 甲醇−水时，保留时间较长，因此多采用梯度洗脱。多环 芳烃也可用硅胶(YWG等)柱，以不含水的正己烷为流动相， 也能获得较好的分离效果，但需注意溶解样品的溶剂应与 流动相的性质相近。许多多环芳烃是致癌物质，其含量监 测在食品分析与环境保护监测中都有实用意义。
(1)内标对比法： 这种方法不需知校正因子又具有内标法的定量准确 度与进样量无关的特点，方法简便实用。在药物分析中分 析结果(含量)常用标示量％表示:
( Ai / As )样品 (ms )样品 W 标示量% = × × ×100% ( Ai / As )对照 (ms )对照 m
(21.13)
式中(ms)样品与(ms)对照分别是内标物在试样溶液及对照溶液 中的量，W为平均片重(或丸重等)，m是取样量，其它符 号的含义同GC章。若试样溶液与对照溶液中加人内标物 的量相等，所称取的样品重与平均片重相同，则上式的后 二项均等于1。
A的标示量％=(178024／202694)÷(154856／171222)×100％=97.l％ P的标示量％=(820968／202694) ÷(692272／171222)×100％=100.l％ C的标示量％=(407792／202694) ÷(372221／171222)×100％=92.5％
高效液相色谱方法及应用
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专属型检测器
它对不同组成的物质响应差别极大，因此只能选 择性的检测某些物质，如紫外检测器、荧光检测 器和电导检测器。
通用型检测器
它对大多数物质的响应相差不大几乎适用于所有 物质，如示差折光化学检测器 。但它的灵敏度低， 受温度影响波动大、使用时有一定局限性。
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紫外吸收检测器
简称紫外检测器（ ultraviolet absorption detector ， UV），是基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测 器。 因为大部分常见有机物质和部分无机物质都具有紫外吸 收性质，所以该检测器是液相色谱中应用最广泛的检测 器，几乎所有液相色谱仪都配置了这种检测器。 它不仅有较好的选择性和较高的灵敏度，而且对环境温 度、流动相组成变化和流速波动不太敏感，因此既可用 于等度洗脱，也可用于梯度洗脱。
1、适用于分离几乎所有类型的化合物。一方面通过控制化学键合反应， 可以把不同的有机基团键合到硅胶表面上，从而大大提高了分离的选 择性；另一方面可以通过改变流动相的组成合乎种类来有效地分离非 极性、极性和离子型化合物。 2、由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，这不仅解决了由于固定 液流失所带来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创 造了条件。 3、键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和 热稳定性。 4、固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。
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HPLC与GC差别
相同：兼具分离和分析功能 均可以在线检测 不同：
1．分析对象的区别 2．流动相的区别 3．操作条件区别
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HPLC与GC差别
1．分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但 对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测，占有机物的20% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、 难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均 可检测，用途广泛，占有机物的80%
高效液相色谱法的计算方法
高效液相色谱法的计算方法高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。
1、对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪。
色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定。
常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。
后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料，用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻色谱等。
注样量一般为数微升。
除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。
在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法（附录ⅣA）项下对溶剂的要求。
正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。
一般色谱图约于20分钟内记录完毕。
2、系统适用性试验按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。
(1) 色谱柱的理论板数(N，用于定量表示色谱柱的分离效率，简称柱效)。
在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半高峰宽(W h/2)，按n＝5.54(t R/W h/2)2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。
高效液相色谱法
正相色谱：以极性物质做固定相，非极性物质作
流动相，即流动相的极性<固定相的极性。正相色 谱适用于极性化合物的分离，极性小的先出柱， 极性大的后出柱。（反之为反相色谱）
高效液相色谱仪
压力表 储液器 高压泵
进样器
梯度洗 提装置
色 谱 柱
记录仪 检测器
馏分收集器
一 高压输液系统 1.贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni 合金)，其孔径约2 m，可防止颗粒物进行 泵内。 2.脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通 过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气 体透过膜从溶剂中除去。 3.高压泵： 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳 定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。
二 分离和进样系统 （一）进样系统 与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱 本身所产生的峰形展宽相对要小些。即， HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些 因素包括：进样系统、连接管道及检测器 的死体积。进样装置包括两种。 1. 隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装 置简单、死体积小。但进样量小且重现性 差。
2．化学发光检测器
是近年发展起来的高选择性、高灵敏度
（二）荧光检测器（FD） 早期的荧光检测器是具有滤光片的荧光 光度计，已基本淘汰。 目前使用的荧光检测器多是具有流通池 的荧光分光光度计（直角光路）。 检测限可达 1× 10-10g ／ ml ，比紫外检测 器灵敏，但只适用于能产生荧光或其衍生 物能发荧光的物质。
主要用于氨基酸、
多环芳烃、维生素、 甾体化合物、酶类、 黄曲霉素、卟啉类 化合物、农药等的 检测。
利用固定相与流动相之间对待分离组分子溶解
度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般 为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段
高效液相色谱法的计算方法
高效液相色谱法的计算方法高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。
1、对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪。
色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定。
常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。
后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料，用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻色谱等。
注样量一般为数微升。
除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。
在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法（附录ⅣA）项下对溶剂的要求。
正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。
一般色谱图约于20分钟内记录完毕。
2、系统适用性试验按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。
(1) 色谱柱的理论板数(N，用于定量表示色谱柱的分离效率，简称柱效)。
在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t R（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半高峰宽(W h/2)，按n＝5.54(t R/W h/2)2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。
(2) 分离度(R)定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。
高效液相色谱仪的定性、定量分析(未知样品中苯甲酸含量的测定)
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量 分析方法。
二。实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法 和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒 多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力 流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入 口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似， 流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配 合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色 谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小 口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱 柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内 获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物， 更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化 合物。
4．进样阀从装载转向进样位，同时按进样按扭，工作站 开始记录并出图11。 5．苯甲酸的色谱峰出完后，按照4-5步骤连续操作四次， 获得从最低浓度到最高浓度的标准试液的五张色谱图，分 别为11，12，13，14，15（15为流动相进样，设浓度为0 mg/ml）。 6．按照4-5步骤取25微升的未知样品，进样，出谱图W1。
四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂 ， 用 纯 水 或 去 离 子 水 溶 解 ， 定 容 到 100 毫 升 ， 浓 度 为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀 释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基 线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升 浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上 ），注入进样阀中。
高效液相色谱测定原理
高效液相色谱测定原理
高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分析方法，它基于样品在液相中的分配
行为以及在固定相上的吸附和解吸行为。
它能够对样品中的物质进行分离、定量和定性分析。
高效液相色谱的原理如下：
1. 选择性分离：高效液相色谱中，样品混合物被注入装有固定相（柱填充物）的色谱柱中。
不同物质在柱填充物上的吸附和解吸速度不同，因此可以通过调整流动相的组成、温度和流速等参数来实现对样品中物质的选择性分离。
2. 吸附-解吸过程：在高效液相色谱中，样品溶解于流动相中，与固定相表面发生相互作用。
这个过程涉及吸附和解吸，吸附过程发生在固定相表面，解吸过程发生在固定相表面和流动相中物质的分配行为。
通过控制流动相的性质和柱填充物的特性，可以实现对不同物质的选择性吸附和解吸。
3. 柱填充物：高效液相色谱柱的填充物通常是多孔性固体颗粒，如硅胶或石英。
填充物的选择与样品的性质和分离的目的有关。
柱填充物的粒径、孔径和表面性质将影响色谱分离的效果。
4. 检测器：高效液相色谱的结果通过检测器进行检测和记录。
常见的检测器包括紫外可见光检测器、荧光检测器、电化学检测器等，根据待分析物的性质和浓度选择适当的检测器。
总之，高效液相色谱是利用样品在液相中的分配和在固定相上的吸附解吸过程进行分离和定量分析的方法。
通过调整柱填充物、流动相和检测器等参数，可以实现对样品中不同物质的选择性分离和定量测定。
高效液相色谱分析方法的建立
样品预处理的种类
物理的分离与浓缩技术 过滤、沉淀分离、吸附、蒸馏、溶剂的挥发
溶剂萃取 回流、索氏提取、超声波提取
固相萃取（SPE） 吸附剂（硅胶、氧化铝）、高分子大孔树脂（
苯乙烯－二乙烯苯）、离子交换树脂、 键合硅胶等 超临界流体萃取 化学衍生化技术
OH
CH3
维生素
荧光检测器的优点
选择性提高 灵敏度提高（在 pg/fg 范围） 低背景技术
mV
0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 -0.10
5.00
6.00
6.894
CH3 H2NOBiblioteka O 9.639CH3
O
HN
H3C
O
MDA及MDMA
柱上200pg
Excitation =280
更准确的定量
更好地完成色谱峰纯度的确认
（较低的阈值）
N
常用液相色谱的检测器
常规检测器 示差折光检测器（Refractive Index） 紫外/可见光吸收检测器（UV-Vis） 荧光检测器（Fluorescence） 蒸发光散射检测器（Evaporative Light Scattering） 其他检测器（Other Detectors）
什么是高效液相色谱法？
High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC
是一种区别于经典液相色谱，基于现代仪器方法 的高效能分析方法：
高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以 及高灵敏度、高选择性的检测器…… 广泛应用于各个领域： 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业…… 在技术、理论及应用上已进入一个较高的水平， 并高速发展。
药学专业中药学的定性与定量分析方法探讨
药学专业中药学的定性与定量分析方法探讨药学专业中的中药学是研究中药的性质、成分、功效和应用的学科。
在中药学研究中，定性与定量分析是非常重要的方法。
本文将探讨药学专业中药学的定性与定量分析方法，以及其在中药研究中的应用。
一、定性分析方法定性分析是通过观察和比较样品的性质、形态、色泽等特征，来确定其成分和性质的方法。
在中药学中，定性分析常用于鉴别中药材的真伪和质量。
以下是几种常见的定性分析方法：1. 宏观鉴别法：通过观察中药材的外观特征，如形状、大小、颜色等，来判断其真伪和质量。
例如，黄芩的外观应为黄色，若发现颜色异常，则可能为假冒品。
2. 显微镜鉴别法：利用显微镜观察中药材的细胞结构和组织特征，来鉴别其真伪和质量。
例如，黄连的表皮细胞应有明显的蓝色细胞壁，若观察到细胞壁缺失或变形，则可能为假冒品。
3. 化学试剂鉴别法：通过与特定化学试剂的反应，来鉴别中药材的成分和性质。
例如，用碘液滴在地黄片上，若出现紫色或蓝色反应，则说明含有甾体类化合物。
二、定量分析方法定量分析是通过测定样品中特定成分的含量，来确定其质量和功效的方法。
在中药学中，定量分析常用于评估中药制剂的含量和药效。
以下是几种常见的定量分析方法：1. 薄层色谱法：将样品溶解后，在薄层色谱板上进行分离，然后用特定显色剂显色，并通过比色法测定色斑的强度，来计算样品中目标成分的含量。
2. 高效液相色谱法：将样品溶解后，通过高效液相色谱仪进行分离，然后根据峰面积或峰高来计算样品中目标成分的含量。
该方法具有灵敏度高、分离效果好的优点。
3. 气相色谱法：将样品挥发后，通过气相色谱仪进行分离，然后根据峰面积或峰高来计算样品中目标成分的含量。
该方法适用于挥发性物质的定量分析。
三、定性与定量分析方法的应用定性与定量分析方法在中药学研究中有着广泛的应用。
定性分析方法可以用于鉴别中药材的真伪和质量，确保中药材的安全有效；定量分析方法可以用于评估中药制剂的含量和药效，指导中药的合理使用。
高效液相色谱法定性定量分析
高效液相色谱法测定萘乙酸的含量一、实验目的1、学习高效液相色谱仪的操作。
2、了解高效液相色谱法测定萘乙酸的基本原理。
3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。
二、实验原理将已配制的浓度不同的萘乙酸标准溶液进入色谱系统。
如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间t R和峰高A后，可直接用t R定性，用峰面积A作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定未知浓度萘乙酸的含量。
三、仪器和试剂1、Agilent 1100高效液相色谱仪。
2、色谱柱：Zorbax C8，5µm，250×4.6mm，20μL定样环。
3、流动相：H2O和CH3OH4、萘乙酸标准溶液：精密称取萘乙酸标准品制成浓度(mg/L)分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、2、5、8、10、15、20 mg/L的对照品溶液，放入冰箱备用。
5、未知物萘乙酸6、平头微量注射器。
四、实验步骤1、开机(1) 检查流动相、废液瓶和色谱柱；(2) 打开打印机和计算机的电源；(3) 自上而下打开个组件电源，Bootp Server里显示有信号时（有六行字符）；(4) 打开工作站。
2、编辑方法(1) 选择“Method”菜单，然后“EDIT METHOD”依屏幕提示进入以下设定：(a）泵对话框：设定泵的流速：1.0mL/min；H2O和CH3OH线性梯度洗脱：H2O 0 min：10%；1 min：20%；3 min：30%；4 min：30%；(b）检测器对话框：设定波长337 nm。
(2) 单击“Method”菜单，选中“Save Method As…”，输入方法名，单击OK。
(3) 从“Run Control”菜单中选择“Sample Info…”选项，输入操作者名称，在“Data file”中选择“Manual”或“Prefix”。
(4) 单击Ok，等仪器Ready，基线平稳。
仪器分析实验的课后习题答案及讨论
高效液相色谱1．高效液相色谱法的特点特点：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量准确度高，应用围广。
适用于分析高沸点、大分子、强极性、热不稳定有机及生化试样的高效别离分析方法。
2.高效液相色谱与气相色谱的主要区别可归结于以下几点：(1)进样方式的不同：高效液相色谱只要将样品制成溶液，而气相色谱需加热气化或裂解；(2)流动相不同，在被测组分与流动相之间、流动相与固定相之间都存在着一定的相互作用力；(3)由于液体的粘度较气体大两个数量级，使被测组分在液体流动相中的扩散系数比在气体流动相中约小4~5个数量级；(4)由于流动相的化学成分可进展广泛选择，并可配置成二元或多元体系，满足梯度洗脱的需要，因而提高了高效液相色谱的分辨率〔柱效能〕；(5)高效液相色谱采用5~10Lm细颗粒固定相，使流体相在色谱柱上渗透性大大缩小，流动阻力增大，必须借助高压泵输送流动相；(6)高效液相色谱是在液相中进展，对被测组分的检测，通常采用灵敏的湿法光度检测器，例如，紫外光度检测器、示差折光检测器、荧光光度检测器等。
3.高效液相色谱的定性和定量分析的方法定性：〔1〕利用纯物质定性的方法利用保存值定性：通过比照试样中具有与纯物质一样保存值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。
不适用于不同仪器上获得的数据之间的比照。
利用参加法定性：将纯物质参加到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。
〔2〕利用文献保存值定性相对保存值r21：相对保存值r21仅与柱温和固定液性质有关。
在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保存数据，可以用来进展定性鉴定。
定量：有归一法、标法、外标法在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、标法或外标法等，但高效液相色谱在别离复杂组分式样时，有些组分常不能出峰，因此归一化法定量受到限制，而标法定量则被广泛使用。
4．高效液相色谱实验时，选择流动相时应注意的几个问题〔1〕尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
高效液相色谱定性定量分析方法
1
134.2
220.2
0 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 Counts vs. Mass-to-Charge (m/ z)
由分子量及其 质谱图可以确 定该代谢物为 乙酰化氨脒
定性分析—两谱联用定性
定性分析—其他方法
1 收集洗脱物后进行定性分析
` 收集色谱分离后的每一个分离组分 ` 对所得组分分别进行仪器、化学分析或其他物理
参数（如熔点、沸点、折光、旋光等）测定
定性分析—其他方法
收集组分时应注意
` 某些情形，如色谱分析，宜采用非破坏性检测器，电化 学检测器不可；
` 如使用破坏性检测器，则须在检测器前分流，使分离后 的一小部分组分进入检测器
` 可根据文献数据和对照品选用已知标准物 ，再用已知标准物进行定性
定性分析—保留值定性
3 利用已知物增加峰高法定性
将已知标准物质加到待测样品，若某一峰 增高，且改变色谱柱或流动相组成后仍能使 该峰增高，则可基本认定该峰与已知标准物 为同一物质
定性分析—保留值定性
4 用三维图谱检测器定性
` 如果HPLC仪配备有三维图谱检测器，除比较未 知组分与已知标准物保留时间外，还可比较两 峰的立体构形
条件下应该有相同的保留值； 但相反结论却不成立，即相同色谱条件下
，具有相同保留值的两个物质不一定是同一 个物质。尚需一些辅助技术 ` 利用两谱联用定性；
其他方法定性
定性分析—保留值定性
1 已知物保留值直接对照法定性
` 未知峰保留值(t’R或V’R)与某标准物完全 相同，可初步确定为同一物质
` 改变色谱柱或流动相组成，二者保留值仍 完全相同，则可认定为同一物质
高效液相色谱仪使用方法
高效液相色谱仪使用方法
高效液相色谱仪（HPLC）是一种常用的分析仪器，用于分离
和定量分析化合物的混合物。
以下是HPLC的基本使用方法：
1. 样品准备：将待分析的混合物或溶液准备好，通常需要进行前处理，例如过滤、稀释或提取。
2. 系统准备：打开色谱仪的电源，启动仪器，确保所有组件处于正常工作状态。
检查液相、气相和其他溶剂的供应，并确保其质量良好。
3. 进样：将样品注射器连接到色谱柱，并根据实验要求设置注射器体积。
将样品注射器插入进样口，并将样品注入到色谱柱。
4. 创建梯度：根据分析要求，创建一个梯度程序。
这涉及到设置流动相的组成和梯度变化的速率。
5. 运行分析：点击开始按钮，启动分析过程。
色谱系统将自动进行溶剂梯度变化，使样品中的化合物逐步从色谱柱中分离出来。
6. 数据采集和分析：在分离过程中，色谱仪将采集到一系列数据点，包括峰高、峰面积、保留时间等。
使用相关的数据处理软件，可以对这些数据进行处理和分析。
7. 清洗和维护：在分析完成后，需要进行系统的清洗和维护。
这包括冲洗色谱柱、清理进样器和其他组件，并储存色谱仪在
正确的环境条件下。
以上是高效液相色谱仪的基本使用方法。
具体的使用流程和操作步骤可能会有细微的差异，取决于具体的仪器品牌和型号。
建议在使用前仔细阅读和理解相关的操作手册和使用说明。
高效液相色谱定性定量分析方法
1 所选浓度范围使检测器的响应值超出了该检测器 响应值的线性范围；
2 实验数据的精密度太差，过于分散。
无论何种原因，都应重新绘制标准工作曲线 。
诚信
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改善
利他
为/客/户/生/产/满/意/商/品 为/社/会/培/养/有/益/人/才
• 在某些限定条件下，被测组分的浓度与检测器的 响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度 与峰面积不成线性，分别取对数后呈线性。）
• Ci=fiAi • Ci=fiHi
• 实际修饰公式为：y=ax+b
诚信
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为/客/户/生/产/满/意/商/品 为/社/会/培/养/有/益/人/才
定量分析方法
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为/客/户/生/产/满/意/商/品 为/社/会/培/养/有/益/人/才
面积归一化法
不能作为准确定量的方法、仅在特殊情况下使用
• •
公式： 特点：
C%
Ai Ai
100%
– 各组分要全部流出、全部被检测，要求所有响 应因子相当
– 进样量不要求严格
– 不需标样
– 无需做校正、简单、快速
诚信
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利他
为/客/户/生/产/满/意/商/品 为/社/会/培/养/有/益/人/才
内标法
• 选择适宜的物质作为欲测组分的参比物， 定量加到样品中去，依据欲测组分和参比 物在检测器上的响应值（峰面积或峰高） 之比和参比物加入的量进行定量分析的方 法。
• 内标法与标准曲线法相比，有利于消除色 谱条件不完全重现、进样量不准确等所带 来的误差。
高效液相色谱定性定量分析方法==
吸光度（ Absorbance UV/Vis）检测 • 目前实验室中最流行的选择 ▫ 多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是多 波长，25%是PDA） • 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 • 吸光度与样品浓度呈线性关系 • 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
吸光度检测器（ UV/Vis）－ 优点 • 这种检测器简单、可靠 • 多数人熟悉并喜欢这种技术 • 可以作梯度实验并且是非破坏性的 • 大多数有机化合物有一定程度的吸光度 • 一般来说灵敏度还可以
固定滞后体积，改善了梯度性能 梯度百分比 梯度曲线 好的梯度 滞后曲线 保留时间
普通的低压梯度系统 梯度百分比 不好的梯度 滞后曲线
保留时间
液相色谱的色谱柱
色谱柱的连接
Stop_depth长度不合适造成柱前死体积
色谱柱的连接
锥箍锥度不合适造成渗漏
可能提高柱效的方法
除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右)，再补充新的
泵的保养： • • • • • 使用流动相尽量要清洁； 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡； 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污 染；
柱的保养： • • • • • • • • • 柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净； 要注意流动相的脱气； 避免使用高粘度的溶剂作为流动相； 进样样品要提纯； 严格控制进样量； 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱； 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；
• 试剂:
分析纯
• 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要 求越高放置时间越短。
分析实验报告 高效液相色谱
华南师范大学实验报告学生姓名：杨秀琼学号：20082401129专业：化学年级班级：08化二课程名称：仪器分析实验实验项目：液相色谱分析混合样品中的苯和甲苯实验类型：综合实验时间：2010/416一、[实验目的:]1、掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法2、了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术二、[实验原理:]高效液相色谱法：以液体作为流动相的色谱法。
它是在经典液相色谱实验基础上，引入气相色谱的理论，在技术上采用高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的快速分离分析技术。
具有分离效能高，检出限低，操作自动化和应用范围广的特点。
其基本原理：利用欲分配的诸组分在固定相和流动相间的分配有差异（即由不同的分配系数），当两相做相对运动时，这些组分在此两相中分配反复进行，从几千次到百万次，即使组分的分配系数只有微小差异，随着液体流动相却可以有明显的差异，最后使这些组分都得到分离，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。
三、[仪器和试剂:]1.主要仪器：岛津液相色谱仪(LC-10AT)[配有紫外检测PhenomenexO柱]；10μL微量注射器2、试剂：甲醇、水苯和甲苯混合待测溶液苯标准溶液：2.0μL/mL甲苯标准溶液：2.0μL/mL苯、甲苯混合标准溶液：1.0μL/mL、2.0μL/mL、5.0μL/mL、10.0μL/mL 四、[实验步骤]1、按操作规程开机。
2、.选择合适的流动相配比，优化色谱条件通过调节溶剂甲醇和水的混合比例，从而来优化色谱调剂。
调好最佳色谱条件，控制流速为1ml/min 。
柱温30℃，检测波长354nm 3、苯、甲苯定性分析在最佳条件下，待基线走稳后，用10μL 微量注射器分别进样10μL 苯和 甲 苯混合待测溶液，10μL 苯标准溶液（2.0μL/mL）和10μL 甲苯标准溶液（2.0μL/mL）(微量注射器用甲醇润洗3～5遍)，观察并记录色谱图上显示的保留时间，确定苯和甲苯的峰。
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表现：系统压力波动大
措施： • 打开排液阀，以异丙醇为流动相输液 • 拆下单向阀，放入异丙醇中，超声波清洗
线路过滤器
故障：堵塞
线路过滤器
现象：系统压力波动大或压力 偏高
压力传感器
措施：5％稀硝酸，超声波清洗
判断依据：关闭排液阀，断开出 口管路，设定流速1mL/min，
排液阀 流动相
如压力>3kgf/cm2，则堵塞。
色谱柱柱内体积和平衡时间
色谱柱 尺寸 (mm)
4.6 x 50 4.6 x 30 4.6 x 15 4.6 x 150
柱内 体积 (Vm)
0.5 mL 0.3 mL间 流速 1.0 mL/min
5 min 3 min 1.5 min 15 min
色谱柱 尺寸 (mm)
选用适宜的容器
1．梯度洗脱的特点
（1）改善分离, 加快分析速度； （ 2 ）改善峰形 , 减少拖尾 , 有利于 痕量组分的检测； （3）增加峰容量；
（ 4 ）强烈滞留的组分不容易残留在
柱上, 保持柱性能长期良好； （ 5 ）下次分析时 , 流动相需要一段 平衡时间；不同溶剂的 UV吸收程度稍 有差异, 可能会引起基线漂移
图1；好的梯度系统
图2；一般的二元梯度系统
图3；一般的四元梯度系统
为何如此重要？
五个小肽的5ng进样，好的色谱系统非常容易鉴别出所有 峰。在不好的色谱系统中，第一个峰则消失在基线噪音中。
基线噪音对积分的影响
1.183
Caffeine @ 271 nm
1.183
1.224
维护流程图
线路过滤器
单向阀 柱塞密封圈 进样器
UV Spectrum of Eluents with 0.1% TFA Against HPLC Grade H2O Blank 背景吸收对紫外检测器噪音的影响
1.50 1.40 1.30 1.20 1.10 1.00 0.90 0.80 AU 0.70
H20 with 0.1% TFA 50% ACN with 0.1% TFA
泵的保养： • • • • • 使用流动相尽量要清洁； 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡； 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污 染；
柱的保养： • • • • • • • • • 柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净； 要注意流动相的脱气； 避免使用高粘度的溶剂作为流动相； 进样样品要提纯； 严格控制进样量； 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱； 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；
色谱柱清洗保存
• 反相色谱柱：用20%甲醇溶液清洗10个柱体积，保存在 90%的甲醇溶液中。 • 分子筛色谱柱：用纯水清洗10个柱体积，保存在5%叠氮 化钠水溶液中。 • 离子色谱柱：用0.02M盐，pH6.5溶液清洗10个柱体积， 保存在含5%叠氮化钠0.02M盐，pH6.5溶液中。短期保存 在低盐的流动相中。
滞后体积的不同会使方法转换麻烦
▫ 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现 ▫ 滞后体积的变化会导致梯度重现性不好
普通分析型液相色谱的滞后体积为2~4ml
滞后体积变化的影响 设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果： 梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好 用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性
检测器
吸滤头
• • • •
吸滤头－－定期清洗，更换溶剂时 单向阀－－定期清洗，压力波动大时 泵－－自动清洗 在线过滤器－压力大时清洗
吸滤头
材料：不锈钢烧结，孔径10um
故障：堵塞 表现：管路中不断有气泡生成
措施：用5％稀硝酸，超声波清洗，
再用蒸馏水清洗
单向阀
故障：宝石球或塑料垫片受污导致密封不好
高效液相色谱定性定量分析方法
基本原理和特点
基本原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固 定相时,由于与 固定相(stationary phase)发生作用(吸附, 分配,离子吸引,排阻,亲和)的大小,强 弱不同,在固定相中 滞留时间不同,从而先后从固定相中流出.
特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动
液相柱---保留值与pH的关系
pH变化值 0.1
RS变化值 1.6
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱
对溶剂的要求 • 水： 去离子水 纯净水 • 溶剂: 色谱纯（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，异丙醇） 自动纯水仪 商品瓶装水
化。
一些商品化仪器
检测器 柱温箱 流动相 脱气装置 样品盘
控温箱
四元泵
启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源 打开泵、自动进样器、检测器电源， 待设备通过自检后，打开计算机启动
色谱管理软件
准备流动相 过滤，脱气 色谱泵排气 用新配制的流动相灌注泵
高效液相色谱仪组成
▫ 输液系统 ▫ 进样系统 ▫ 分离系统
气泡对测定的影响：
1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积
2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形
3）检测器中的气泡产生基线波动
流动相的保存
有机溶剂流动相：
室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：
低温密封保存 防止有机相的挥发
理想的HPLC检测器 • 高灵敏度；可忽略的基线噪音 • 宽的线性范围 • 独立于流动相及操作参数的响应 ▫ 对压力、温度及流速等变化不敏感 • 长时间操作的稳定性 • 低死体积 • 非破坏性 • 选择性
灵敏度：信噪比
6:1 • 灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值 （S/N） • 检测限（LOD）：S/N = 2~4 • 定量限（LOQ）：S/N = 8~10 S • 好的信噪比有利于： ▫ 更好的色谱峰确认 ▫ 更好的定量 ▫ 更好地完成色谱峰纯度/均一性
准确性受影响 ▫ 滞后体积（系统
体积）设计合理
低 B 阻尼器 溶剂输送 压 A C 梯度滞后：系统体积的影响 混合器 系统(泵) 梯 D 度 比例阀 滞后(系统)体积
色谱柱 进样器 检测器
注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路 滞后(系统)体积 高 压 梯 度
溶剂输送 系统(泵)
死体积/谱带展宽体积 (无色谱柱时)
N
吸光度（ Absorbance UV/Vis）检测 • 目前实验室中最流行的选择 ▫ 多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是多 波长，25%是PDA） • 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 • 吸光度与样品浓度呈线性关系 • 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
吸光度检测器（ UV/Vis）－ 优点 • 这种检测器简单、可靠 • 多数人熟悉并喜欢这种技术 • 可以作梯度实验并且是非破坏性的 • 大多数有机化合物有一定程度的吸光度 • 一般来说灵敏度还可以
Parabens at 254 nm
0.15
0.10 AU 0.05 0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
Minutes
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
吸光度检测器（UV/Vis）－ 缺点 • 由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用检测器 • 对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器 • 样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要使用多波 长检测，或使用折衷的波长 • 受流动相组成的影响： ▫ 用截止波长以上至少5～10nm作为工作波长 ▫ 缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂也会有影响
固定相。
色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效将明显下降，选合适
的溶剂进行洗净。
采用梯度洗脱时，柱在重复使用前，用泵把几倍于柱体 积的起始溶剂压经柱子，以重新建立起始的平衡来得到再 生。
HPLC检测器应提供的功能 • 对样品有响应并有一个输出信号 • 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并 且所设计的校正技术应该促进这种关系
灯的保养：
• 在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成 后，马上关闭检测器。 • 样品池要保养
谢谢！
今天用的图片都为 摄影协会 王诏同学所拍摄
0.60
0.50 0.40
0.30
0.20 0.10 0.00 200.00 210.00 220.00 230.00 240.00 250.00 nm 260.00 270.00 280.00 290.00
色谱条件 溶剂混合的基线噪音
色谱柱： C18, 5 µm, 3.9x150mm at 35º C. 流动相： A: 0.1% TFA in Water. B: 0.1% TFA in Acetonitrile. 梯度： 5 - 40% B in 35 min. 流速： 1.0 mL/min. 样品： 水（10 µL inj. vol.） 检测： 214 nm
固定滞后体积，改善了梯度性能 梯度百分比 梯度曲线 好的梯度 滞后曲线 保留时间
普通的低压梯度系统 梯度百分比 不好的梯度 滞后曲线
保留时间
液相色谱的色谱柱
色谱柱的连接
Stop_depth长度不合适造成柱前死体积
色谱柱的连接
锥箍锥度不合适造成渗漏
可能提高柱效的方法
除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右)，再补充新的
2.1 x 50 2.1 x 30 2.1 x 15