微生物的无菌操作及接种技术教程文件
(完整版)微生物的接种技术
微生物的接种技术1 目的1.1学习掌握微生物的几种接种技术1.2 建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节2 实验说明将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。
接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。
无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。
接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可靠，影响下一步工作的进行。
3 实验器材3.1 器械和用品酒精灯，玻璃铅笔，火柴，试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管、移液管、三角型接种棒等接种工具。
3.2 菌种和培养基菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
培养基：普通琼脂斜面和平板,营养肉汤,普通琼脂高层(直立柱)。
4 实验流程斜面接种法→液体接种法→固体接种法→穿刺接种法。
5 操作步骤5.1 斜面接种法斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种。
通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面，肉汤中的纯培养物接种到斜面培养基上。
操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行，先点燃酒精灯。
将菌种斜面培养基(简称菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管)持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈45～0度角，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。
以右手在火焰旁转动两管棉塞，使其松动，以便接种时易于取出。
右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。
镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。
用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。
微生物实验室无菌操作技术规范
1.目的规范无菌操作流程，减少及避免发生染菌现象出现。
2.使用范围无菌室及洁净区的操作。
3.无菌操作技术原则3.1环境要清洁，在每次无菌操作结束后都需要对环境进行清理、清洗；且避免操作前进行清扫。
3.2做好个人卫生，进入无菌室前需修剪指甲、洗手，穿好无菌服，帽子需遮住所有头发，口罩遮住口鼻。
3.3在无菌操作时，不可讲话，打喷嚏，对怀疑染菌的无菌物品，不可使用。
4.内容4.1.1 准备：工作人员着装整洁，洗手、戴口罩、修剪指甲；备齐用物（如：接种针、接种环、酒精灯、斜面、平皿、摇瓶、75%酒精棉、无菌水等）；核对无菌用品，接种菌种的种类、型号。
4.1.2 所有实验使用的物品都需要进行消毒、灭杀；进入洁净区前需要经传递窗进行紫外表面消毒30min以上；4.1.3 开始实验前需要打开超净台的紫外灯，消毒半个小时以上；超净台避免放入过多的物品（一般只放入当次的实验所有的物品），所使用的试剂和耗材都需事先进行灭菌（灭菌日期超过4天的需重新消毒）。
4.1.4 进入洁净区前关闭紫外灯，并打开风机，等待半个小时以上，使臭氧尽量排放干净。
4.1.5 除去手腕等部位的饰品，穿好无菌服，戴好头套、口罩，做到“三不漏”：不暴漏头发，不暴漏口鼻，不暴漏躯干皮肤和衣物。
4.1.6 双手要进行清洗、消毒。
4.1.7 要经风淋室风淋30秒后再进入洁净室。
4.1.8 在局部百级区域操作要戴一次性无菌手套。
4.1.9 实验操作过程中应尽量减少进入洁净区的人员（不超过4人/间）并尽量减少人员走动。
4.1.10 所有要放入超净工作台的物品都需进过消毒液喷洒擦拭消毒。
4.1.11 无菌物品若取离超净台则视为已污染，不得放回再用；无菌液体在取离超净台前必须密封其开口；密封的无菌液体容器在放入超净台后，对其开口前须对开口在酒精灯火焰上烧烤。
4.1.12 在拆开任何一次性无菌使用耗材的包装时都要在超净台内完成，并须同时保证与细菌直接接触的使用端/面不得与超净台内的任何物品发生触碰。
微生物无菌操作技术
⑥接种
在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培 养基底部向上作“Z”形来回密集划线，勿划破培养基。有时也可用接种 针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不同 菌种的生长特点。
⑦塞管塞 取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将试管塞旋上。 ⑧将接种环灼烧灭菌。
桶内消毒； ⑧操作时禁止再培养物上方移动手臂；
（2）接种 1、接种的一般流程 接种工具灭菌 防止污染标本
接种工具冷却
沾取标本
接种
接种工具灭菌 防止污染环境
2、到平板
3、斜面接种技术 斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新鲜斜面 培养基上的接种方法。
用于好气性微生物的接种。
具体操作： ①贴标签：接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓 名等，贴在距试管口约2到3厘米处，也可使用记号笔标记。 ②点燃酒精灯。 ③接种： 1）手持试管 将菌种管和待接斜面的两支试管用大姆指和其他四指握在左手中，使中 指位于两试管之间部位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置。
②旋松管塞 先用右手松动试管塞，以便接种时拔出 ③接种环灼烧灭菌 右手拿接种环，在火焰上将环端灼烧灭菌，然 后将有可能伸入试管的其余部分均灼烧灭菌， 重复此操作，再灼烧一次 ④拔管塞 用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种试管和待接试管的试管塞 ，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫) ⑤取菌 待接种环冷却后，轻沾取少量菌体或胞子，然 后将接种环移出菌种试管，注意不要使接种环 碰到管壁，取出后带菌接种环不可通过火焰。
微生物实验无菌操作
微生物接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物 体内的过程。微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作 技能。
微生物无菌的操作流程
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实验3-微生物接种技术
实验三微生物接种技术一、实验目的1、掌握无菌操作在微生物接种过程中的重要性。
2、掌握几种常用的微生物接种方法。
3、掌握微生物微生物扩大繁殖的基本方法。
4、认识微生物接种工具二、实验原理微生物接种技术是生物科学研究中最基本的操作技术。
由于实验目的、培养基种类及容器等不同，所用接种方法不同，如斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种等，以获得生长良好的纯种微生物。
为此，接种必须在一个无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作；同时，因接种方法的不同，常采用不同的接种工具，如接种针、接种环、移液管和玻璃刮铲等。
三、实验器材主要仪器及设备无菌室、超净工作台、培养箱、振荡器、接种针、接种环、接种钩、接种铲，试管固体斜面培养基、培养基平板、三角瓶液体培养基，PDA平板及斜面，牛肉膏-蛋白胨-琼脂平板、斜面培养基、牛肉膏-蛋白胨液体培养基、试管半固体培养基。
菌种大肠杆菌（Escherichia coli)、青霉(Penicillium sp．)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)、细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)放线菌等。
四、操作步骤(一)斜面接种技术具体操作如下：1、贴标签接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。
贴在距试管口径2-3厘米的位置。
2、点燃酒精灯。
3、接种用接种环将菌种移接到贴好标签的试管斜面上。
无菌操作程序简述如下：⑴手持试管将菌种和用于接种的斜面两支试管用大拇指和其他四指握在左手中、使中指位于两试管之间。
斜面向上，并使它们位于水平位置(图a)。
⑵旋松棉塞先用右手将棉塞旋松，以便接种时易于拔出。
⑶取接种环右手拿接种环在火焰将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌。
⑷拔棉塞用右手的无名指、小指和手掌边先后拔出试管的棉塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)，如图b、c所示。
⑸环冷却将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。
微生物的接种技术
（二）穿刺接种
用接种针挑取菌种（针必须挺直），自培养基的 中心垂直地刺入半固体培养基中，直至接近管底， 但不要穿透，然后沿原穿刺线将针拔出，塞上试管 塞，烧灼接种针。
五、实验结果 1、待接种菌种培养长出后，看划线是否标准 2、观察穿刺接种生长状态 六、思考题 1、什么是无菌操作 2、接种时应注意的问题有哪些
实验七 微生物的接种技术
Hale Waihona Puke 一、实验目的熟悉微生物的无菌接种技术和方法
二、实验原理
微生物接种是将一种微生物移接到另一灭过菌 的新鲜培养基中，使其繁殖生长的过程。
方法有：斜面接种、液体接种、平板接种、穿 刺接种等。
无菌操作：培养基灭菌后，用灭过菌的无菌工 具将含菌材料接种于灭菌培养基上的过程。
三、实验材料 1、菌种：大肠杆菌（Ec） 2、培养基：营养琼脂斜面培养基、
4、右手拿接种环通过火焰烧灼灭菌，在火焰边用 右手的手掌边缘和小指/小指和无名指分别夹持 试管帽，将其取出，并迅速烧灼管口。
5、将灭菌的接种环伸入菌种试管内，先将环接触试 管 内壁或未长菌的培养基，达到冷却的目的，然后再 挑取少许菌苔。将接种环退出菌种试管，迅速伸入 待接种的斜面试管，用环在斜面上自试管底部向上 端轻轻地划直线，勿将培养基划破，也不要使环接 触管壁或管口。
牛肉膏蛋白胨半固体培养基 3、器材：接种环、接种针、酒精灯
四、操作步骤
（一）斜面接种
1、在斜面试管上，用记号笔写上 将接种的菌名、日期和接种者；
2、点燃煤气灯；
3、将菌种试管和待接种的斜面试 管，用大拇指和食指、中指、无 名指握在左手中，并将中指夹在 两试管之间，使斜面向上，成水 平状态，在火焰边用右手松动试 管塞，以利于接种时拔出。
微生物的无菌操作及接种技术
实验用品
实验用品如培养基、试剂 、玻璃器皿等应经过严格 灭菌处理，确保无菌状态 。
无菌操作原则与规范
操作前准备
实验人员应穿戴整洁的工作服，戴好口罩和帽子，修剪指 甲并洗净双手。同时，检查实验用品是否齐全、无菌状态 是否良好。
操作后处理
实验结束后，及时清理实验台面，将废弃物放入指定容器 内。对实验用品进行清洗和灭菌处理，确保下次实验的无 菌环境。
生长曲线测定
通过测定微生物的生长曲线， 了解其生长速度、延滞期、对 数生长期、稳定期等生长特点 。
代谢产物检测
检测微生物代谢产生的特定物 质，如酶、酸、气体等，以判
断其生长情况和代谢活性。
05
无菌操作在科研实验 中应用举例
遗传学实验：基因转化和表达分析
基因转化
在遗传学研究中，无菌操作是基因转化的关键步骤之一。通过无菌操作，可以将 外源基因导入到受体细胞中，实现基因的转移和整合。
环境微生物学研究
无菌操作在环境微生物学研究中也非常重要。通过无菌操作，可以研究环境微生物的生长、代谢和相互作用等方 面，揭示微生物在环境中的生态功能和水平，确保实验准确性
严格遵守无菌操作规范
在进行微生物实验时，必须严格遵守无菌操作规范，包括 穿戴实验服、戴口罩和手套、使用无菌器材等，以避免实 验过程中的污染。
注意事项
接种针需灼烧灭菌，避免污染；划线时力度要均匀，避免划 破培养基。
液体培养基接种法
操作步骤
在无菌条件下，用接种环沾取少量菌 液，在液体培养基中轻轻搅动，使菌 液均匀分布在培养基中。
注意事项
接种环需灼烧灭菌，避免污染；搅动 时要轻柔，避免产生气泡。
其他特殊无菌操作方法
穿刺接种法
用接种针沾取少量菌液，穿刺到半固体培养基内部，适用于厌氧菌 等需要特殊环境的微生物培养。
微生物实验中的接种分离和培养操作步骤
微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤一、目的要求1、掌握各种分离、接种方法。
2、掌握无菌操作基本环节。
二、实验说明微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。
在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。
微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。
然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。
三、实验材料1、恒温培养箱。
2、接种环、玻璃棒、吸管、酒精灯。
3、培养基（上次实验配制的）。
4、大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌。
四、方法步骤（一）接种的操作1、斜面接种（接金黄葡萄球菌）（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。
（2）将菌种管和斜面握在左手大姆指和其它四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处于水平位置。
（3）先将菌种和斜面的棉塞旋转一下，以便接种时便于拔出。
（4）左手拿接种环（如握钢笔一样），以火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌。
（5）用右手的无名指、小指和手掌将菌种管和待接斜面试管的棉花塞或试管帽同时拔出，然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧过烫）。
（6）将灼烧过的接种环伸入菌种管内，接种环在试管内壁或未长菌苔的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻刮取少许菌苔，再从菌种管内抽出接种环。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。
从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。
有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。
从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。
有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
（8）接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。
微生物的无菌操作及接种技术
无菌环境的要求与保持
2、超净工作台
超净工作台是为实验室工作提供无菌操作环境的设施，以 保护实验免受外部环境的影响，同时为外部环境提供某些程 度的保护以防污染并保护操作者。
原理：超净工作台的洁净环境是在特定的空间内，洁净空 气(进滤空气)按设定的方向流动而形成的。以气流方向来分， 现有的超净工作台可分为垂直式，由内向外式以及侧向式。
பைடு நூலகம்
垂直流超净工作台
垂直流超净工作台 水平流超净工作台
无菌环境的要求与保持
超净台的使用与维护
风速保持在0.32-0.48米/秒 使用前打开紫外灯照射40~60min 开启超净工作台工作电源，关闭紫外灯，并用75%的酒精或0.5%过氧乙
酸喷洒擦拭消毒工作台面。 使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布檫拭； 请保持超净台整洁、干燥，不要堆积杂物； 使用完毕，关闭煤气开关或酒精灯； 使用完毕后，用消毒液擦拭工作台面，关闭工作电源，重新开启紫外灯照
• 与斜面法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基时使 环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，塞上棉 塞再轻轻摇匀。 • 如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管 接种
2、常用的接种方法
※ 斜面接种
1) 标记：接种前在试管上注明菌名、接种日期、接种人姓名 2) 点燃酒精灯。 3) 接种： （1）手持试管 将菌种管和待接斜面管用大姆指和其他四指握
在左手中，中指位于两管之间。斜面向上，尽量放平。 （2）旋松管塞 （3）接种环灼烧灭菌
※ 斜面接种
（4）拔管塞： 用右手的无 名指、小指和手掌边先后 取下菌种管和待接试管的 管塞，让试管口缓缓过火 灭菌(切勿烧得过烫)
4无菌操作与接种技术
（二）接种环境
n 操作需在超净工作台或无菌 室内进行。
n 酒精灯
（三）细菌接种的基本程序
灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本 沾取标本 接种 灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境
细菌斜面接种
用于鉴定和保存菌种。
细菌斜面接种的基本程序
灭菌接种环
取菌种试管和待 接种的斜面试管
沾取标本
接种
接种后灭菌接种环
（四）平板分区划线法
n 目的：使混合的细菌呈单 个分散生长，形成单个菌 落，以便获得纯菌。
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
n 将上述已接种细菌的培养基置37℃恒温培养 箱中孵育18～24h，观察细菌的生长现象。
细菌在固体培养基中的生长现象
n 菌落
n 定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖， 形成单一肉眼可见的细菌集团。
n 菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、 透明度、湿润度、黏度、溶血性。
n 菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌 堆积物。菌落源自菌苔菌落与菌苔谢谢欣赏
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稀释法分 离纯化的 基本流程
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连续划线法
分区划线法
实验器材
白色葡萄球菌，大肠杆菌 接种环，酒精灯，斜面和平板培养基 恒温培养箱
实验方法
(一)接种工具
n 接种针和接种环：由三部分组组成，即环 （针）、金属柄和绝缘柄。
酒精灯灭菌接种环沾取标本接种灭菌接种环杀灭接种环沾染的细菌以免污染标本杀灭接种环沾染的细菌以免污染环境用于鉴定和保存菌种
无菌技术操作流程样本
无菌技术操作流程样本1.准备工作在开始进行无菌技术操作之前，需要保持整个操作区域的洁净。
必须彻底清洗并消毒所有的工作台面、试管架和工具，并准备所需的材料和试剂。
2.穿戴个人防护装备在进行无菌技术操作时，必须戴上适当的个人防护装备，包括实验服、手套、眼镜和口罩。
这可以防止个人细菌和其他微生物的传播。
3.消毒试管将要使用的试管放入无菌培养皿中，使用70%乙醇或其他合适的消毒剂将试管完全浸泡。
然后取出试管并在火焰中加热到红热状态，直到酒精完全燃烧殆尽。
让试管冷却后即可使用。
4.制备无菌培养基根据需要，准备适当的无菌培养基。
将培养基倒入试管中，并放入高压蒸汽锅或高温高压灭菌器中进行灭菌。
确保培养基完全无菌。
5.点火燃烧灯具将点火器点燃，并将焰火焰放在工作台或试验室内所需的位置。
确保火焰的稳定性和安全性。
6.消毒工作区域将试验台面擦洗干净，并用70%乙醇或其他消毒剂轻轻擦拭。
确保没有任何细菌存在。
7.穿戴手套在进行无菌技术操作之前，务必戴上无菌手套，以保持操作区域的洁净。
8.点火灼烧被灭菌工具将需要使用的工具，如镊子、培养皿和吸管，在火焰中进行灼烧，以杀灭上面的细菌。
9.开启试管盖使用无菌镊子或其他工具，轻轻开启试管盖。
注意不要接触到试管盖内部。
10.装填培养基用无菌吸管取出培养基，并轻轻滴入试管中。
确保培养基不触碰到外部地面或其他非无菌物质。
11.关闭试管盖将试管盖重新放回试管上，并确保盖子完全关闭。
确保试管内外环境的隔离。
12.出口火焰将试管盖和试管的出口部分经过火焰烘烤，以确保没有任何微生物存在。
13.清洁无菌区域在完成无菌技术操作后，必须清洁并消毒整个操作区域，以避免任何污染和细菌传播的风险。
《微生物接种和传代的无菌技术》 学历案
《微生物接种和传代的无菌技术》学历案一、学习目标1、理解微生物接种和传代中无菌技术的重要性。
2、掌握微生物接种和传代的无菌操作方法和步骤。
3、学会正确使用无菌操作所需的仪器设备。
4、培养严谨的科学态度和无菌操作意识。
二、学习重难点1、重点（1）无菌操作的基本原理和方法。
（2）微生物接种和传代的具体操作流程。
2、难点（1）如何确保在操作过程中始终维持无菌状态。
（2）应对可能出现的污染情况的处理方法。
三、知识链接1、微生物的基本特性：微生物个体微小、结构简单、繁殖迅速，容易受到外界环境的影响。
2、实验室安全规则：了解实验室中关于化学品、仪器设备使用的安全规定。
四、学习过程1、无菌技术的概念和重要性（1）无菌技术是指在微生物实验操作过程中，防止微生物被其他微生物污染，同时也防止操作人员被微生物感染的一系列操作方法和措施。
（2）重要性在于确保实验结果的准确性和可靠性，避免杂菌的干扰，保证培养物的纯度。
2、无菌操作所需的仪器设备（1）超净工作台：提供一个相对无菌的操作环境，通过过滤空气来减少空气中的微生物。
（2）接种环和接种针：用于挑取和转移微生物。
（3）培养皿和培养瓶：用于培养微生物。
（4）酒精灯：用于灼烧消毒接种工具。
（5）无菌吸管和移液器：用于准确量取和转移液体培养基或菌液。
3、无菌操作前的准备工作（1）清洁实验室台面和超净工作台，用 75%酒精擦拭消毒。
（2）将所需的仪器设备和培养基等放入超净工作台，打开紫外灯照射 20 30 分钟进行消毒。
（3）操作人员洗手、消毒，穿戴无菌工作服、帽子和口罩。
4、微生物接种的无菌操作方法（1）点燃酒精灯，对接种环或接种针进行灼烧灭菌，冷却后待用。
（2）打开培养皿或培养瓶的盖子，将盖子稍微倾斜，避免盖子内表面接触到其他物品。
（3）用接种环或接种针挑取少量微生物，迅速接入新的培养基中，注意不要碰到培养皿或培养瓶的边缘。
（4）接种完毕后，立即盖上盖子，标记好接种的微生物名称、日期等信息。
《微生物接种和传代的无菌技术》 学历案
《微生物接种和传代的无菌技术》学历案一、学习目标1、理解微生物接种和传代中无菌技术的重要性。
2、掌握微生物接种和传代过程中的无菌操作方法和要点。
3、能够正确进行微生物的接种和传代实验，并在实践中严格遵守无菌操作规范。
二、学习重难点1、重点（1）无菌操作的概念和原则。
（2）微生物接种和传代的具体操作步骤及注意事项。
2、难点（1）如何在实际操作中确保无菌环境的维持。
（2）理解并掌握不同类型微生物接种和传代方法的差异。
三、学习过程（一）知识铺垫1、微生物的基本概念和特点微生物是指肉眼难以看清，需要借助显微镜才能观察到的微小生物。
它们包括细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体等。
微生物具有体积小、结构简单、生长繁殖快、代谢类型多样等特点。
2、无菌技术的概念无菌技术是指在操作过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术。
（二）无菌操作的原则1、环境无菌操作应在经过消毒处理、洁净且相对封闭的环境中进行，如无菌室、超净工作台等。
2、人员无菌操作人员需做好自身清洁，穿戴无菌衣帽、口罩和手套。
3、物品无菌使用的器具、培养基等必须经过灭菌处理，确保无菌。
4、操作无菌操作过程应规范、迅速，避免微生物的污染。
（三）微生物接种的无菌技术1、接种工具的准备常见的接种工具包括接种环、接种针、移液管等。
这些工具在使用前需要进行灭菌处理，通常采用高温灼烧或高压蒸汽灭菌的方法。
2、接种方法（1）平板划线法通过在平板培养基表面多次划线，将微生物逐步稀释，从而分离得到单个菌落。
操作时，接种环在火焰上灼烧灭菌，冷却后蘸取菌液，在平板上进行划线。
每次划线后，接种环都要再次灼烧灭菌，冷却后再进行下一次划线。
（2）涂布平板法将菌液均匀涂布在平板培养基表面。
先将适量菌液加入无菌培养皿中，然后用无菌涂布器将菌液均匀涂布在培养基表面。
（3）斜面接种法用于保存菌种或扩大培养。
将待接种的菌种用接种环或接种针从原菌种斜面上挑取少量菌苔，在新的斜面培养基上自下而上划线接种。
《微生物接种和传代的无菌技术》 学历案
《微生物接种和传代的无菌技术》学历案一、学习目标1、理解无菌技术的概念和重要性。
2、掌握微生物接种和传代过程中的无菌操作方法。
3、能够正确使用无菌操作所需的仪器设备。
4、培养严谨的科学态度和无菌操作意识。
二、学习重难点1、重点（1）无菌操作的关键步骤和技术要点。
（2）微生物接种和传代的具体操作流程。
2、难点（1）如何确保在操作过程中始终维持无菌状态。
（2）对无菌操作中出现的问题进行分析和解决。
三、知识准备1、微生物的基本概念和特点。
2、实验室安全规则和注意事项。
四、学习过程（一）无菌技术的概念无菌技术是指在微生物实验操作过程中，防止一切微生物（包括细菌、真菌、病毒等）进入操作环境和实验材料的技术。
它是保证微生物实验结果准确性和可靠性的关键。
（二）无菌技术的重要性在微生物接种和传代过程中，如果不能严格遵守无菌技术，就可能引入杂菌，导致实验结果错误，甚至可能培养出有害微生物，对实验人员和环境造成危害。
（三）无菌操作所需的仪器设备1、超净工作台超净工作台是提供局部无菌环境的重要设备。
它通过高效过滤器过滤空气，使工作区域内的空气达到无菌状态。
使用超净工作台时，应提前开启紫外灯照射 30 分钟进行消毒，然后关闭紫外灯，开启风机，通风 5 10 分钟后再进行操作。
2、接种环和接种针接种环和接种针用于挑取和转移微生物。
它们通常由耐高温的金属制成，使用前需要在酒精灯火焰上灼烧灭菌。
3、培养皿和试管培养皿和试管是培养微生物的常用容器。
使用前需进行高压蒸汽灭菌处理。
4、移液器和移液管用于准确量取液体培养基或菌液，使用前需要进行灭菌处理。
（四）微生物接种的无菌操作1、准备工作（1）将所需的仪器设备和材料放置在超净工作台内。
（2）用 75% 的酒精擦拭双手和工作台面。
2、点燃酒精灯酒精灯火焰附近是无菌区域，操作应在火焰附近进行。
3、打开菌种管在火焰旁打开菌种管的棉塞，管口迅速通过火焰 2 3 次，以杀灭管口可能沾染的杂菌。
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二、 微生物接种技术
接种的准备工作
无菌环境的要求与保持 进入无菌室前的准备 无菌操作的要求
接种的操作方法
（一）接种的准备工作
无菌环境的要求与保持
无菌室 无菌环境 超净工作台
无菌环境的要求与保持
1、无菌室 （1）无菌室的结构： 应有更衣间、缓冲间、
操作间 应有良好的通风条件，
安装空调设备及过滤设 备
消毒桶内消毒。
无菌操作要求
无菌操作要求
（二）接种的操作方法
接种的基本程序 常用接种方法
斜面接种 划线接种 液体接种 穿刺接种
（二）接种的操作方法
1、接种的基本程序
灭菌接种环 杀灭接种环沾染的微生物，以免污染标本
沾取标本 接种
灭菌接种环
•操作需在无菌室或超净工作台内进行 •无菌室、超净工作台使用前后需进行 消毒。 •实验使用的物品使用前后需严格灭菌
精棉球将手擦干净。 （5）缓冲室内换上洗净并经紫外线灯照射过的工作衣、帽、
鞋。
无菌操作要求
（1）在操作中不应有大幅度或快速的动作； （2）使用玻璃器皿应轻取轻放。 （3）在火焰上方操作； （4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌； （5）在接种培养物时，协作应轻、准。 （6）不能用嘴直接吸吹吸管。 （7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的
垂直流超净工作台
垂直流超净工作台 水平流超净工作台
无菌环境的要求与保持
超净台的使用与维护
风速保持在0.32-0.48米/秒 使用前打开紫外灯照射40~60min 开启超净工作台工作电源，关闭紫外灯，并用75%的酒精或0.5%过氧乙
酸喷洒擦拭消毒工作台面。 使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布檫拭； 请保持超净台整洁、干燥，不要堆积杂物； 使用完毕，关闭煤气开关或酒精灯； 使用完毕后，用消毒液擦拭工作台面，关闭工作电源，重新开启紫外灯照
在左手中，中指位于两管之间。斜面向上，尽量放平。 （2）旋松管塞 （3）接种环灼烧灭菌
※ 斜面接种
（4）拔管塞： 用右手的无 名指、小指和手掌边先后 取下菌种管和待接试管的 管塞，让试管口缓缓过火 灭菌(切勿烧得过烫)
※ 斜面接种
（5）取菌: 接种环冷却，轻 沾取少量菌体或胞子， 然后将接种环移出菌种 管，注意不要使接种环 碰到管壁，取出后带菌 接种环不可通过火焰。
杀灭接种环沾染的微生物，以免污染环境
（二）接种的操作方法
2、常用的接种方法
斜面接种 划线接种 液体接种 穿刺接种
2、常用的接种方法
※ 斜面接种：
• 从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新鲜 斜面培养基上的接种方法。 • 用于好气性微生物的接种。
※ 斜面接种
1) 标记：接种前在试管上注明菌名、接种日期、接种人姓名 2) 点燃酒精灯。 3) 接种： （1）手持试管 将菌种管和待接斜面管用大姆指和其他四指握
无菌室的结构
无菌环境的要求与保持
（2）无菌室的消毒和防污染 无菌室内空气测试应基本达到无菌。 每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）. 每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）. 每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。 定期作实验室沉降菌计数，以检查无菌室微生物生长繁殖
动态。
(8) 将接种环灼烧灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。
斜面接种示意图
2、常用的接种方法
※ 液体接种
由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。 操作方法：
• 与斜面法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基时使 环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，塞上棉 塞再轻轻摇匀。 • 如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管 接种
微生物的无菌操作及接种技术
一、微生物无菌操作技术
无菌操作材料：
材料
器械和用品：酒精灯、记号笔、标签、火柴、灭菌培 养皿、无菌水、试管架
菌种 培养基：
微生物无菌操作技术与接种技术
二、原理：
无菌技术：指在微生物实验工作中， 控制或防止各类微生物的污染及其 干扰的一系列操作方法和有关措施。
接种：将微生物接到适于它生长繁 殖的人工培养基上或活的生物体内 的过程。
射15min. 定期做无菌试验，以测定净化台是否符合无菌要求。
无菌环境的要求与保持
3、无菌器材准备
灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等. 消毒器材：接种试管、无菌室内的凳子、试管架、天平、
工作台等
进入无菌室前的准备
（1）定期检查无菌环境的空气是否符合规定； （2）用紫外线灭菌处理30~60min； （3）检查无菌器材是否完备； （4）实验人员进入无菌室前先用肥皂洗手，然后用75％酒
2、常用的接种方法
※划线接种
目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得 纯菌、活菌计数。 方法：
★ 分区划线法：适用于含菌量较多的标本 ★ 连续划线法：适用于含菌量较少的标本
2、常用的接种方法
※划线接种
2、常用的接种方法
※划线接种
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
无菌环境的要求与保持
2、超净工作台
超净工作台是为实验室工作提供无菌操作环境的设施，以 保护实验免受外部环境的影响，同时为外部环境提供某些程 度的保护以防污染并保护操作者。
原理：超净工作台的洁净环境是在特定的空间内，洁净空 气(进滤空气)按设定的方向流动而形成的。以气流方向来分， 现有的超净工作台可分为垂直式，由内向外式以及侧向式。
2、常用的接种方法
※划线接种
连续划线法
2、常用的接种方法
※穿刺接种
用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到固体或半固体的 深层培养基中的接种方法。 • 用于厌气性细菌培养、检查细菌的运动能力、保藏菌种。 • 只适宜于细菌和酵母的接种培养
※ 斜面接种
（6）接种: 在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入待接斜面管。从 斜面培养基底部向上作“Z”形来回密集划线，勿划破培 养基。 有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作 斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。
※ 斜面接种
(7) 塞管塞： 取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞 旋上。不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁 空气。