微生物的无菌操作及接种技术教程文件

二、 微生物接种技术ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
接种的准备工作
无菌环境的要求与保持 进入无菌室前的准备 无菌操作的要求
接种的操作方法
（一）接种的准备工作
无菌环境的要求与保持
无菌室 无菌环境 超净工作台
无菌环境的要求与保持
1、无菌室 （1）无菌室的结构： 应有更衣间、缓冲间、
操作间 应有良好的通风条件，
安装空调设备及过滤设 备
※ 斜面接种
（6）接种: 在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入待接斜面管。从 斜面培养基底部向上作“Z”形来回密集划线，勿划破培 养基。 有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作 斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。
※ 斜面接种
(7) 塞管塞： 取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞 旋上。不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁 空气。
消毒桶内消毒。
无菌操作要求
无菌操作要求
（二）接种的操作方法
接种的基本程序 常用接种方法
斜面接种 划线接种 液体接种 穿刺接种
（二）接种的操作方法
1、接种的基本程序
灭菌接种环 杀灭接种环沾染的微生物，以免污染标本
沾取标本 接种
灭菌接种环
•操作需在无菌室或超净工作台内进行 •无菌室、超净工作台使用前后需进行 消毒。 •实验使用的物品使用前后需严格灭菌
微生物的无菌操作及接种技术
一、微生物无菌操作技术
无菌操作材料：
材料
器械和用品：酒精灯、记号笔、标签、火柴、灭菌培 养皿、无菌水、试管架
菌种 培养基：
微生物无菌操作技术与接种技术
二、原理：
无菌技术：指在微生物实验工作中， 控制或防止各类微生物的污染及其 干扰的一系列操作方法和有关措施。
接种：将微生物接到适于它生长繁 殖的人工培养基上或活的生物体内 的过程。
垂直流超净工作台
垂直流超净工作台 水平流超净工作台
无菌环境的要求与保持
超净台的使用与维护
风速保持在0.32-0.48米/秒 使用前打开紫外灯照射40~60min 开启超净工作台工作电源，关闭紫外灯，并用75%的酒精或0.5%过氧乙
酸喷洒擦拭消毒工作台面。 使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布檫拭； 请保持超净台整洁、干燥，不要堆积杂物； 使用完毕，关闭煤气开关或酒精灯； 使用完毕后，用消毒液擦拭工作台面，关闭工作电源，重新开启紫外灯照
2、常用的接种方法
※划线接种
目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得 纯菌、活菌计数。 方法：
★ 分区划线法：适用于含菌量较多的标本 ★ 连续划线法：适用于含菌量较少的标本
2、常用的接种方法
※划线接种
2、常用的接种方法
※划线接种
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
在左手中，中指位于两管之间。斜面向上，尽量放平。 （2）旋松管塞 （3）接种环灼烧灭菌
※ 斜面接种
（4）拔管塞： 用右手的无 名指、小指和手掌边先后 取下菌种管和待接试管的 管塞，让试管口缓缓过火 灭菌(切勿烧得过烫)
※ 斜面接种
（5）取菌: 接种环冷却，轻 沾取少量菌体或胞子， 然后将接种环移出菌种 管，注意不要使接种环 碰到管壁，取出后带菌 接种环不可通过火焰。
杀灭接种环沾染的微生物，以免污染环境
（二）接种的操作方法
2、常用的接种方法
斜面接种 划线接种 液体接种 穿刺接种
2、常用的接种方法
※ 斜面接种：
• 从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新鲜 斜面培养基上的接种方法。 • 用于好气性微生物的接种。
※ 斜面接种
1) 标记：接种前在试管上注明菌名、接种日期、接种人姓名 2) 点燃酒精灯。 3) 接种： （1）手持试管 将菌种管和待接斜面管用大姆指和其他四指握
2、常用的接种方法
※划线接种
连续划线法
2、常用的接种方法
※穿刺接种
用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到固体或半固体的 深层培养基中的接种方法。 • 用于厌气性细菌培养、检查细菌的运动能力、保藏菌种。 • 只适宜于细菌和酵母的接种培养
无菌室的结构
无菌环境的要求与保持
（2）无菌室的消毒和防污染 无菌室内空气测试应基本达到无菌。 每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）. 每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）. 每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。 定期作实验室沉降菌计数，以检查无菌室微生物生长繁殖
动态。
(8) 将接种环灼烧灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。
斜面接种示意图
2、常用的接种方法
※ 液体接种
由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。 操作方法：
• 与斜面法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基时使 环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，塞上棉 塞再轻轻摇匀。 • 如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管 接种
射15min. 定期做无菌试验，以测定净化台是否符合无菌要求。
无菌环境的要求与保持
3、无菌器材准备
灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等. 消毒器材：接种试管、无菌室内的凳子、试管架、天平、
工作台等
进入无菌室前的准备
（1）定期检查无菌环境的空气是否符合规定； （2）用紫外线灭菌处理30~60min； （3）检查无菌器材是否完备； （4）实验人员进入无菌室前先用肥皂洗手，然后用75％酒
精棉球将手擦干净。 （5）缓冲室内换上洗净并经紫外线灯照射过的工作衣、帽、
鞋。
无菌操作要求
（1）在操作中不应有大幅度或快速的动作； （2）使用玻璃器皿应轻取轻放。 （3）在火焰上方操作； （4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌； （5）在接种培养物时，协作应轻、准。 （6）不能用嘴直接吸吹吸管。 （7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的
无菌环境的要求与保持
2、超净工作台
超净工作台是为实验室工作提供无菌操作环境的设施，以 保护实验免受外部环境的影响，同时为外部环境提供某些程 度的保护以防污染并保护操作者。
原理：超净工作台的洁净环境是在特定的空间内，洁净空 气(进滤空气)按设定的方向流动而形成的。以气流方向来分， 现有的超净工作台可分为垂直式，由内向外式以及侧向式。