去内毒素实验方法介绍
高效去内毒素亲和填料FF
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高效去内毒素亲和填料 FF
一、 简介
内毒素在生物样品中用常规的方法很难去除，而且有的时候它还会和生物制品结合，
这样去除就变得非常复杂，尤其是用原核表达的产品，内毒素含量有时候高达上万 EU/mg，
这样更增加去除的困难。
国际公认最好的方法就是把某些物质偶联到琼脂糖凝胶上做成特异吸附内毒素的亲和
填料，这样它可以特异吸附内毒素，而样品本身不损失，我们就是把这类物质偶联到高度交
结果：
浓度（mg/ml） 内毒素 (Eu/mg)
处理前的样品 2.90
5000-7000
处理后的样品 2.90 <5
四、 亲和填料应用的注意事项： 1、 该亲和填料每次使用前都需用 Buffer 1 处理，包括第一次使用时。 2、 配制缓冲液要用无内毒素的注射级用水，配制过程要防止引入内毒素。 3、 适当延长填料与样品溶液的处理时间可以加大内毒素的吸附量。 4、 如果用磁力搅拌要注意转速别太快，避免搅碎填料。 5、 样品如果本身是带负性电荷，为增加样品回收率，样品中可以加<0.2M NaCl。 6、 样品 pH 可以在 7-9 范围内。 7、 样品内毒素太高，超过填料处理量，需要稀释样品找到内毒素的范围，和经去除后内毒
去内毒素质粒提取原理
去内毒素质粒提取原理内毒素质粒提取原理。
内毒素质粒提取是一种常用的生物实验技术，用于从细菌中提取内毒素质粒，以便进行后续的实验操作。
内毒素是一种存在于细菌细胞壁中的有毒物质，其存在会对实验结果产生干扰甚至影响实验结果的准确性，因此需要将其从细菌中去除。
下面将介绍内毒素质粒提取的原理及操作步骤。
1. 原理。
内毒素质粒提取的原理主要是利用离心技术和化学试剂的作用，将细菌细胞壁破裂并去除，从而得到内毒素质粒的提取物。
首先，通过离心将细菌培养液离心沉淀，得到含有细菌细胞的沉淀物。
然后使用化学试剂（如SDS、蛋白酶K等）对细菌细胞进行破裂和去除内毒素的处理，最终得到内毒素质粒的提取物。
2. 操作步骤。
（1）培养细菌，首先需要在含有适当营养物的培养基中培养目标细菌，使其达到适当的生长状态。
（2）离心沉淀，将培养好的细菌培养液进行离心，得到细菌细胞的沉淀物。
（3）破裂细胞，使用化学试剂（如SDS）对细菌细胞进行破裂，使内部的内毒素质粒暴露出来。
（4）去除内毒素，使用蛋白酶K等化学试剂去除内毒素，得到纯净的内毒素质粒提取物。
3. 注意事项。
在进行内毒素质粒提取实验时，需要注意以下几点：（1）操作环境要保持清洁，避免外源性内毒素的污染。
（2）化学试剂的使用要按照安全操作规范进行，避免对人身和实验物质造成伤害。
（3）离心操作要注意转速和离心时间的控制，以保证细菌细胞的充分沉淀。
（4）内毒素质粒提取物的保存要在低温条件下，避免其降解和污染。
4. 应用领域。
内毒素质粒提取技术主要应用于生物学实验中，如基因工程、蛋白表达等领域。
通过去除内毒素质粒，可以减少实验结果的干扰，提高实验的准确性和可重复性。
总之，内毒素质粒提取是一项重要的生物实验技术，其原理简单而有效，操作步骤清晰明了。
在实际应用中，需要严格按照操作规范进行，以确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文介绍的内容对您有所帮助，谢谢阅读！。
《内毒素及其去除》课件
利用某些微生物将内毒素作为营养物 质降解，从而降低其毒性，这些微生 物通常被称为“内毒素降解菌”。
05
CATALOGUE
内毒素去除技术的研究进展
新技术的研发与应用
生物膜过滤技术
利用生物膜的吸附作用去 除内毒素，具有高效、低 成本的优势。
免疫亲和技术
利用抗体与内毒素的特异 性结合，实现内毒素的特 异性去除。
纳米材料技术
利用纳米材料对内毒素的 吸附和捕获作用，实现内 毒素的去除。
现有技术的改进与优化
优化活性炭吸附技术
通过改进活性炭的孔径和表面性质，提高其对内毒素的吸附能力 。
强化超滤技术
通过提高超滤膜的孔径和膜材料的亲水性，提高超滤去除内毒素的 效果。
离子交换技术
通过优化离子交换剂的离子配比和粒径，提高其对内毒素的去除效 果。
02
内毒素的致死剂量因人而异，与机体的免疫状态、 健康状况等因素有关。
03
及时诊断和治疗内毒素中毒，可有效降低死亡率， 提高治愈率。
03
CATALOGUE
内毒素的检测与鉴定
内毒素检测的方法
01
02
03
04
鲎试验法
利用鲎变形细胞溶解物与内毒 素反应的原理，通过显色反应 或凝固反应来检测内毒素。
显色基质法
06
CATALOGUE
内毒素去除的实际应用
在医疗领域的应用
医疗设备消毒
通过去除内毒素，可以有效地降 低医疗设备上细菌的数量，从而
降低感染的风险。
药品生产
在药品生产过程中，去除内毒素可 以确保药品的安全性和有效性。
血液透析
在血液透析过程中，去除内毒素可 以降低患者体内的毒素水平，提高 治疗效果。
生物制剂中内毒素去除方法概述
性 能 [D].杭 州 :浙 江 大 学 ，2012 （作者单位：华北制药集团股份有限公司生物技术分公司）
生物制剂中内毒素去除方法概述
作者： 作者单位： 刊名：
英文刊名： 年，卷(期)：
马莹博 华北制药集团股份有限公司生物技术分公司
河北企业 Hebei Qiye 2015(4)
参考文献(4条) 1.焦炳华 分子内毒素学 1995
98
２０15 年第 4 期
LPS 血症中的 LPS。 免疫亲和具有高度特异性，但是这种配基 制备困难，应用范围狭窄，同时还有价格昂贵、洗脱困难的问 题。
（2）多粘菌素 B(PM 降解革兰氏阴性细菌的细胞壁，其阳离子与类脂 A 的磷酸基 团之间的静电作用力和疏水作用力使其能识别不同来源的 LPS 分子。 采用固定 PMX-B 的纤维素（或琼脂糖）载体 去 除 LPS，有良好的效果和稳定性。但是 PMX-B 的价格昂贵，且有 肾毒性和神经毒性，应谨慎应用。
版社，1995: 2-5 [2]秦 峰.生 物 医 药 制 剂 中 内 毒 素 的 去 除 研 究 进 展 [J]. 药
物 生 物 技 术 ，2003,10(1):53-56 [3]张媛媛.用于内毒 素 去 除 的 新 型 亲 和 吸 附 剂 的 制 备 及
中国药典内毒素检测方法
中国药典内毒素检测方法内毒素是革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖组分，只有在细菌死亡裂解后才被释放出来。
内毒素对人体细胞产生的危害较小，但可刺激机体产生非特异性炎症反应，如微循环障碍、寒战、发热、血栓形成等。
因此，内毒素的检测对于药品质量控制具有重要意义。
本文将介绍中国药典中规定的内毒素检测方法，包括凝胶法、动态浊度法和终点显色法等。
一、凝胶法凝胶法是一种经典的内毒素检测方法，具有操作简便、快速、经济等优点。
该方法的基本原理是根据内毒素与限量革兰阴性菌细胞中的脂多糖抗原起反应而产生凝集现象。
操作步骤如下：1.将稀释的内毒素样品与标准品同时加入凝胶反应管中，摇匀。
2.将反应管放入37℃恒温器中，保温30分钟。
3.观察反应结果，记录凝集情况。
凝胶法适用于注射剂、滴眼剂等药品的内毒素检测，但不适用于供局部用药的制剂。
该方法的准确性和灵敏度相对较低，但可满足一般药品制剂的质量控制要求。
二、动态浊度法动态浊度法是一种较灵敏的内毒素检测方法，适用于各类注射剂、输液等药品的内毒素检测。
该方法的基本原理是根据内毒素在试管中产生的浊度变化来计算内毒素含量。
操作步骤如下：1.将稀释的内毒素样品与标准品分别加入动态浊度反应管中。
2.将反应管放入37℃恒温器中，保温30分钟。
3.观察浊度变化情况，记录反应终点时的时间和吸光度值。
4.根据吸光度值计算内毒素含量。
动态浊度法具有操作简便、快速、准确性和灵敏度高等优点，可满足高精度内毒素检测的需求。
但需要注意的是，该方法易受到杂质、样品颜色等因素的影响，因此需进行空白校正和标准曲线绘制等操作以提高准确性。
三、终点显色法终点显色法是一种高灵敏度的内毒素检测方法，适用于各类药品制剂的内毒素检测。
该方法的基本原理是根据内毒素与限量革兰阴性菌细胞中的脂多糖抗原起反应而产生颜色变化来计算内毒素含量。
操作步骤如下：1.将稀释的内毒素样品与标准品分别加入终点显色反应管中。
2.将反应管放入37℃恒温器中，保温30分钟。
去内毒素质粒提取原理
去内毒素质粒提取原理
内毒素质粒提取是一种常用的实验方法，用于从细菌中提取纯化内毒素质粒。
内毒素质粒是一种含有内毒素基因的质粒，可以通过将其转化到宿主细菌中，利用宿主细菌合成内毒素，从而得到内毒素的高产物。
内毒素质粒提取的原理是基于以下步骤进行的：
1. 提取细菌：首先，从含有内毒素质粒的宿主细菌中提取细菌。
这可以通过培养液基样或者固体培养基上的细菌混悬液得到。
2. 细菌破碎：将提取的细菌进行破碎，使得内毒素质粒释放到溶液中。
破碎细菌的方法有多种，包括超声波破碎法、高压破碎法等。
3. 除去胞外物质：通过高速离心将破碎细菌溶液进行离心，将胞外物质与内毒素质粒分离。
离心后，胞外物质会沉淀在管底，而内毒素质粒则分散在上清中。
4. 滤过纯化：通过滤膜将上清进行滤过，除去残留的固体颗粒和细菌等杂质，得到较为纯净的内毒素质粒溶液。
5. 纯化内毒素质粒：最后，可以采用各种柱层析等方法对内毒素质粒进行纯化。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析等，以获得高纯度的内毒素质粒溶液。
总结而言，内毒素质粒提取的原理利用细菌破碎和纯化方法，
从宿主细菌中提取纯化内毒素质粒。
这种方法可以应用于研究内毒素的性质、制备高纯度内毒素样品等实验需求。
以TritonX114液相分离法去除质粒溶液中的内毒素
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日ｕｓｔ 苗 ｎｓ ａｈｉ薛ｌｙｐｒ触．ｔｉｖｅａｎｔｉ一Ｈｅ门犯．，ｉｍＰｌｅｘｖｉ心 １画 ｕｎｉｔｙｌ习‘ Ｊｈ ｕ ｋ倪 少 Ｅｉｏｉ，ＺＩＨ】５，７８：１７８ １５１ 刘建文，施用晖，乐国伟，等．外源质较ＤＮＡ经胃肠道途径对小鼠 免疫 功 能 的影响【Ｊ］ 世界华人消化杂志，２以润，１双１１）泛６１４ ！日 孙树汉，戴建新，张平武，等一核酸疫苗「Ｍ］．上海：第二军医大学
内毒素除去填料操作流程
内毒素除去填料操作流程内毒素除去填料操作流程内毒素是细菌细胞壁分解产生的一种有害物质，可以导致人体免疫系统失调、炎症反应，甚至休克、多器官功能障碍综合征等危重症状。
在生物技术制药生产过程中，许多制剂和工艺均需要去除内毒素，以保证生产质量和生产安全，其中内毒素除去填料操作是重要的一环。
以下是该流程的详细过程。
一、装备准备1.1 验证设备清洁状态，确认无杂质和残留；1.2 确定用于内毒素除去的填料类型、数量与规格；1.3 检查系统的肝素或其他抗凝剂的添加和有效性；1.4 确定后续操作的条件和参数，如温度、pH值等。
二、填料投入和平衡2.1 将干燥的填料通过口径合适的漏斗、箱、塔等设备中填充到提前清洗并灭菌的内毒素除去设备（如脱色树脂、离子交换树脂、高效蛋白等）中；2.2 使用预定容积的缓冲液洗数组，直到液体流出无色；2.3 使用预定容积的样品处理液洗数组以平衡填料。
二次洗涤、平衡的次数及洗涤液配比必须按照操作手册中的要求执行，以确保填料质量和操作效率。
三、样品处理和内毒素除去3.1 使用灭菌的取样器、管和工具采集待处理样品；3.2 将样品送到内毒素除去装置中，按照操作手册中给定的操作流程，并根据生产要求严格控制洗柿剂、缓冲液的质量和色度；3.3 保持填料床深度，并注意搅拌速度和时间，冷却系统应该及时跟进；3.4 所处理的样品通过滤器或其他装置从除去装置中收集；四、检测与结果分析4.1 将处理后的样品送往实验室，对样品内毒素含量进行检测；4.2 根据检测结果，分析数据；4.3 对于不符合要求的样品通过重复操作，重新进行去除内毒素的操作；4.4 处理效果和操作过程记录在操作手册中。
以上为内毒素除去填料操作流程的详细介绍，有效、规范的操作可以保证产品质量和生产效率，在生物技术制药等生产过程中有着广泛的应用。
如何去除内毒素
3.2.1原本法用于去除实验用玻璃器皿上的内毒素。
将玻璃器皿置于烤箱中，加热到250℃，持续30min，即可去除内毒素。
3.2.2方法与步骤1、内毒素去除效率的评估（1）制备浓度分别为1000和1000EU/mL 的CSE溶液。
按内毒素测量方法检测这些溶液。
（2）向所有待去除内毒素的玻璃器皿滴入1mL的CSE溶液。
（每种类型的玻璃器皿至少有3EU的CSE）。
（3）将玻璃器皿置放烤箱中，在60℃下，干烤持续30min，烘干，然后在烤箱中，250℃下，干烤30min。
（4）加入适量的LAL水，剧烈振荡5min，以清洗玻璃器皿，然后测量清洗后的LAL水中的内毒素的浓度。
（5）比较原来的内毒素含量和现存的内毒素浓度。
当内毒素含量至少减少了3—log时，该方法有效。
必要时，重复操作，去除内毒素。
用鲎度验法计算内毒素去除的百分比。
2、去除实验玻璃器皿上的内毒素确定可使内毒素玻璃器皿上的内毒素对于用来配置无同一内毒素溶液的玻璃器皿，重复操作，直至内毒素含量下降3—log。
（例如，1000 IEU和10000 10EU）数个加热循环后，用前述的鲎试验法，测定内毒素含量。
3、对照阴性对照：用只盛有LAL水的玻璃器皿，在250℃下，干烤30min并用LAL法测量内毒素的含量。
阳性对照：干燥（60℃，30min）每种玻璃器皿中的内毒素溶液，不经过干烤（250℃，30min）去内毒素的操作，然后测定其内毒素质量。
3.2.3质控与提示（1）保烤箱散热均匀，为此，在操作过程中，可将玻璃器皿放置在烤箱中的每一层上，当温度在250℃后，温度的波动不要超过±15℃。
（2）用含100EU的内毒素过行的检测，可用来确定去内毒素的效率。
用含10000EU的内毒素进行的检测，可用来确定对内毒素含量较高的器皿去除内毒素的效率。
（3）如果如果不理想，可增加每一次操作的时间和操作次数。
（4）其他技术适用于培养基的内毒素，例如，超滤，反向渗透，但比较昂贵。
除去细菌内毒素的方法
除去细菌内毒素的方法
除去细菌内毒素的方法有多种，包括以下几种：
1. 加热法：细菌内毒素对热不稳定，加热可以破坏其结构，从而去除内毒素。
例如，通过高压蒸汽灭菌法、干热法等方法进行加热处理。
2. 酸碱处理法：细菌内毒素对酸碱的耐受性较弱，通过酸或碱处理可以破坏其结构，从而去除内毒素。
3. 吸附法：利用活性炭、硅藻土等吸附剂吸附细菌内毒素，从而将其从溶液中去除。
4. 酶解法：利用专一性酶对细菌内毒素进行酶解，从而将其分解为无毒或低毒的物质。
需要注意的是，不同的去除方法适用于不同的场合和具体情况，需要根据实际情况进行选择和应用。
内毒素去除的方法总结及注意事项
内毒素去除的方法总结及注意事项内毒素基本性质：内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的脂多糖。
内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。
内毒素位于细胞壁的最外层、覆盖于细胞壁的黏肽上。
各种细菌的内毒素的毒性作用较弱，大致相同，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。
所有能引起热原反应的物质称为热原。
药品中的热原主要是细菌内毒素。
一般可以认为：细菌内毒素是热原，但热原不等于细菌内毒素。
细菌内毒素的理化性质：耐热性：彻底灭活需250高温干烤一小时水溶性：可溶于水，生产中可用无热原水冲洗以除去热原。
被吸附性：可被活性碳吸附被酸碱破坏：0.1M HCl或0.1M NaOH 浸泡4小时被氧化剂破坏：30%双氧水浸泡4小时，可完全破坏不挥发性器皿中内毒素的去除:1干热法：适用对象：耐热物品如玻璃制品、金属制品等生产过程中所用的容器处理方法：180℃3～ 4h 或250℃ 30min～ 2h注意事项：1.在干烤前，被加热的玻璃器皿上最好不要有水珠，否则可能会使玻璃器皿损坏。
2.烘烤结束后，玻璃器皿不要马上从电热烘箱中拿出，要等温度适度降低之后才可以拿出，以免因温差太大而造成玻璃器皿损坏。
3.器皿上不能含有纸质或塑料制品，以免烘烤时燃烧或熔化。
2化学降解法：适用对象：主要用于去除玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上的内毒素。
处理方法：常用3～5％双氧水、重铬酸钾硫酸清洁液（重铬酸钾∶硫酸∶水常用配比1∶1∶10 或1∶2∶8 ）、0.1M HCl或0.1 M NaOH 浸泡去除。
一般处理4h以上。
注意事项：佩戴防护用具，防止皮肤直接接触。
溶液中内毒素的去除：方法原理优点缺点液相分离法一些去污剂，如Triton X-114，脱氧胆酸钠能够和内毒素的脂质部分结合，通过液相分离的方法萃取内毒素从而使后者有效地去除。
对内毒素的去除率高，且不影响有效成份的活性。
该法简单高效、价格低廉、适合大规模应用，在我们日常的蛋白纯化中较为常用。
去内毒素质粒小提试剂盒说明书
去内毒素质粒小提试剂盒说明书试剂盒组成50次100次RNase A 100ul 200ul内毒素清除剂20ml 40ml溶液P1 10ml 20ml溶液P2 10ml 20ml溶液P3 10ml 20ml结合液30ml 60ml漂洗液15ml 15ml×2洗脱液10ml 20ml吸附柱50个100个收集管50个100个说明书1份1份注：该试剂盒置于室温（15℃-25℃）干燥条件下可保存12个月，更长时间的保存可置于2℃-8℃。
产品简介：本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的特性提取质粒DNA。
离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物，同时加入Solarbio公司特制的内毒素清除剂，可最大限度地去除内毒素。
从1-5ml大肠杆菌LB培养液中，可快速提取5-15μg纯净地高拷贝质粒DNA，提取率达85-90％。
使用本试剂盒提取的质粒DNA纯度高，可直接用于细胞转染等要求较高的试验，以及其它一些常规试验如酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。
本试剂盒无需使用酚、氯仿等有毒试剂，操作安全。
操作步骤：使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。
溶液P1在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的RNaseA全部加入），混匀，置于2-8℃保存。
如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
1、取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
2、向留有菌体沉淀的离心管中加入200μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。
3、向离心管中加入200ul溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
内毒素的检测和去除
内毒素的检测和去除1 内毒素及其来源1.1内毒素内毒素（endotoxin）是存在于革兰氏阴性菌细胞壁外膜表面的一种大分子物质，一般只有在细胞死亡或分解时自行释放到周围介质中，特殊条件下也可以从活细胞中直接泄漏出来。
内毒素又被称为热原，是一种脂多糖物质，具有耐热性，不易被去除。
若疫苗中存在一定浓度的内毒素，接种动物后，可引起动物发热，休克等，严重时甚至造成死亡。
1.2内毒素的来源因为革兰氏阴性菌无处不在，所以内毒素几乎存在于任何地方。
在疫苗生产中一定要重视和尽可能减少内毒素的污染。
生产用水中内毒素的含量是导致疫苗安全性的关键因素之一。
大量研究表明，疫苗生产过程中内毒素主要来源于培养液和配制用水，其在贮存过程中易受到革兰氏阴性菌的污染。
贮水罐，纯水系统的过滤器和连接管道，以及培养液容器等都可能受到革兰氏阴性菌的污染。
工作人员进出车间携带的物品，以及空气净化系统久不维护，都有可能造成生产车间内的空气尘埃浓度升高，导致内毒素污染。
生产用具、管道、泵、阀门、滤器等的清洗消毒不彻底也会造成内毒素污染。
生产原料的污染，如血液制品，细胞培养基。
人为操作不规范也会引起内毒素污染。
2内毒素的检测目前，内毒素的检测方法较多，但是各存在利弊，因此，选取检测方法要根据实际需求，不建议采取单一的检测方法。
2.1鲎试验法鲎试验法是通过酶的级联反应而实现，内毒素在二价阳离子的参与下激活C因子（FC），然后激活其它酶原，产生一系列凝集酶反应。
该方法是目前检测内毒素最特异和最灵敏的方法。
2.2重组C因子法重组C因子法是使用一个单一的蛋白（重组C因子）作为有效活性成分。
反应中内毒素激活重组C因子，活化的重组C因子将荧光底物裂解，产生荧光复合物，定量检测荧光复合物来量化内毒素。
这种方法可有效避免假阳性的产生。
该方法可用于药品生产，环境，器械生产中的内毒素检测。
2.3热原试验法该方法是比较广泛的检测热原的方法，利用微量内毒素可引起动物体温升高的特性来测试其含量。
去内毒素的方法及检查方法
去内毒素的方法及检查方法注：这部分内容为内毒素的检测方法及去除方法。
热原(pyrogen)是微生物产生的内毒素，是由磷脂、脂多糖和蛋白质组成的复合物，微量即可引起恒温动物体温异常升高。
其中脂多糖具有很强的热原活性。
由革兰氏阴性杆菌产生的热原致热能力最强，真菌、病毒也可以产生热原。
【相关链接】热原的危害一、热原的性质及除去热原的方法1．高温法热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底破坏。
因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。
但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。
2．吸附法热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。
由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。
3．超滤法热原分子量为1×106左右，体积较小，约1～5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用 3.0～15nm超滤膜可将其除去。
4．蒸馏法热原能溶于水但不挥发，但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，，并加有隔沫装置，单次蒸馏往往效果不理想。
5．酸碱法热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。
玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，破坏热原。
6．其它包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。
二、热原的检查方法《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。
1．热原检查法由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。
《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。
内毒素及其去除
构建生物经济体系
打造生物经济旗舰
疏水与分子筛
疏水层析法利用高盐增加蛋白疏水性与介质结合，而在 高盐体系中内毒素由于脂质 A部分有很强的疏水性发凝 集，无法与层析介质结合，因此能够有效去除内毒素
分子筛是利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的 一种方法。一般抗体分子量为几万道尔顿,而内毒素分子 量为几十万至上百万道尔顿,常是多聚体,因此利用分子筛 可以有效去除内毒素,但其处理量小,处理时间较长。
适用于亲水性蛋白的内毒去除，会使一些有毒的 Triton X-114 残存在蛋白溶液中
构建生物经济体系
打造生物经济旗舰
阴离子交换层析
离子交换层析的速度快、载量高、浓缩效应好 ,在早期下游纯化中担当重要角色。一般而言, 内毒素比蛋白质在阴离子交换介质上的结合强 很多,分子量越小的内毒素结合得越强,多数要 在柱再生(1M氯化钠) 或在位清洗(1M氢氧化钠 )时才从介质上洗脱下来
内毒素去除方法存在选择性差，样品回收率低等问题。下面主要介 绍几种生产中常用的方法
一
相分离法Triton X-114
二
阴离子交换层析
三
疏水层析与分子筛
四
亲和层析
构建生物经济体系
打造生物经济旗舰
相分离法Triton X-114
此法用于较大重组蛋白质（rCK-bb、Rck-mb）中LPS的去除 ，经过三次相分离后，LPS从104 EU/ml降到了几个EU/ml， 去除率超过97%，蛋白的回收率大于90%。
内毒素在pH〉2时都是带负电。阴离子层析填料自身带 正电能够吸附内毒。可使用流穿模式，上样前样品PH控 制在目的蛋白PI以下，使其带正电。这样内毒素结合在 填料上，目的蛋白直接流穿
如二乙胺乙基（DEAE）阴 离子交换介质适于从碱性蛋 白质（即带正电的蛋白质， 如尿激酶）中去除内毒素，
内毒素实验凝胶法
鲎试剂灵敏度复核试验
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何
可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度
复核试验。
鲎试剂灵敏度复核试验
根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内
毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋
涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、1λ、0.5λ和
0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均 应在旋涡混合器上混匀30秒钟。
凝胶法的试验步骤
下面我们结合中国药典2010、 GB 14233.2医
用输液、输血、注射器具检验方法 以及GB 15810
一次性无菌注射器 来看下具体试验方法： a）管类和容器类器具用细菌内毒素检查用水 浸泡器具内腔，在（37±1） ℃恒温箱中孵育不少 于1h，取浸提液进行试验； b）小型配件或实体类样品置无热源玻璃器皿 内，加入细菌内毒素检查用水振荡数次，在 （37±1） ℃恒温箱中孵育不少于1h，取浸提液进 行试验。 制备的供试液储存不应该超过2h。一般要求 供试液的PH值在6.0~8.0之间，如不在该范围内， 可用鲎试剂厂家提供的PH缓冲液调节浸提液的PH 值。
休克。 6、 Shwartzman反应。 7、刺激淋
巴细胞有丝分裂，等等 。
细菌内毒素的耐热性
细菌内毒素具很强的耐热性，一般的高压灭菌
不能使其灭活，需250℃30分钟以上的干热灭菌才
能使其灭活 。
实验用器具的处理
内毒素试验中使用的器皿都要经过处理去除可
能存在的外源性内毒素。
耐高温的玻璃器皿等置于电热干烤箱内180℃
鲎试剂灵敏度复核试验
结果观察
将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，若管 内形成凝胶，且不从管壁滑脱者为阳性；若不形成凝胶，或 形成凝胶但倒转180°后从管壁滑脱者为阴性。
热源、内毒素相关说明
去除水中的内毒素（热源），可以选用超纯水系统来去除。
特别是在做细胞和组织培养、蛋白质分析和蛋白质纯化等实验时，内毒素（热源）的存在会直接导致培养物的污染而失败，为此，应该用超纯水系统来除实验室用水中的热源。
如果进水为自来水，则一般的顺序是：1、预处理2、R O （反渗透）3、初级纯化（离子交换）4、双波长UV 灯消毒5、超滤柱（去内毒素）6、终端过滤器（最后一道过滤）。
这样得出的水就是实验室级超纯水，一定会符合你的需要。
我们昨天药剂课刚学的，水中内毒素的消除方法有：离子交换法、凝胶过滤法、蒸馏法和反渗透法制药用水热源的去除去除热原是制药用水系统设计建造的重要目标之一。
自水的预处理开始，直到注射用水的使用点，水处理的许多工艺环节都考虑了去除热原的要求，如活性炭过滤、有机物去除器、反渗透、超过滤及蒸馏。
中国及美国现行版药典中，对纯化水尚没有控制内素的标准，但在欧洲药典2000 增补版中，已作出了“细菌内毒素低于0.25EU/mL ”的规定，这意味着对制药用水内毒素的控制将会更加严格。
至于对注射用水，中国药典和欧美药典对细菌内毒素的控制标准已完全一致。
现拟对制药用水系统去除热原常见的方法作一简单介绍。
1、反渗透反渗透膜的孔径最小，按其阻滞污染物（包括热原）的分子量大小计，一般在100~200之间。
由于热原的分子量在5X104以上，其直径大小一般在1~50 am之间，因此能被有效去除。
美国药典将反渗透作为注射用水的生产方法，意味着反渗透技术在去除热原方面的成熟。
2、超过滤微孔滤膜过滤有某种去除热原的功效。
它利用筛分、静电吸附、架桥，利用微孔滤膜拦截直径比较大的那一部分热原物质。
应当指出，这种去除是很不完全的，直径比较小的热原物质会通过0.22 的微孔滤膜，微小的热原可以透过0.025 z的滤膜，最小的热原体可以穿透所有的微孔滤膜，污染水体。
由于热原分子量越大，致热作用就越强，因此利用微孔滤膜进行除菌过滤时，客观上可能会起到某些截留热原的积极作用，但它不能作为去除热原的可靠方法而单独使用。
内毒素实验操作流程
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以下是内毒素实验的操作流程：一、实验准备1. 试剂和材料：鲎试剂：根据实验需求选择合适的鲎试剂，如鲎试剂凝胶法试剂盒或鲎试剂比色法试剂盒。
去内毒素质粒提取原理
去内毒素质粒提取原理内毒素质粒提取原理。
内毒素是一种存在于细菌细胞壁中的一种有毒物质，它可以引起机体的免疫反应，导致发热、休克等严重症状。
在进行蛋白表达和纯化的过程中，需要从细菌中提取目标蛋白，但内毒素的存在会对蛋白的纯化和功能造成影响。
因此，去除内毒素是蛋白表达和纯化过程中非常重要的一步。
去除内毒素的方法有很多种，其中一种常用的方法是利用内毒素质粒进行表达。
内毒素质粒是一种特殊的质粒，它含有内毒素基因的突变体，可以在细菌中表达目标蛋白的同时，将内毒素的合成降至最低，从而达到去除内毒素的目的。
内毒素质粒提取的原理主要包括以下几个步骤：1. 质粒构建，首先需要构建含有内毒素基因突变体的质粒。
这种质粒通常包含了目标蛋白的表达元件，如启动子、编码序列等，同时还含有内毒素基因的突变体，使得细菌在表达目标蛋白的同时不产生内毒素。
2. 转化细菌，将构建好的内毒素质粒导入到大肠杆菌等表达宿主中，利用热激转化或电穿孔等方法将质粒导入到细菌内。
3. 表达目标蛋白，在转化成功后，细菌开始表达目标蛋白，同时由于质粒中含有内毒素基因的突变体，内毒素的合成被抑制，从而减少内毒素的产生。
4. 收获目标蛋白，经过培养和诱导表达后，细菌中的目标蛋白得以表达并积累。
此时，目标蛋白可以通过细菌裂解和纯化的方法进行提取。
通过上述步骤，利用内毒素质粒进行表达可以有效地去除内毒素的干扰，得到纯净的目标蛋白。
这种方法不仅能够保证目标蛋白的纯度和活性，同时也能够减少内毒素对实验结果的干扰，是蛋白表达和纯化过程中常用的一种策略。
总的来说，内毒素质粒提取的原理是通过构建含有内毒素基因突变体的质粒，在细菌中表达目标蛋白的同时抑制内毒素的合成，从而达到去除内毒素的目的。
这种方法简单、高效，对于蛋白表达和纯化实验具有重要的意义。
希望本文的内容能够对相关领域的研究者有所帮助。
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去内毒素质粒提取Protocol
内毒性也称为脂多糖或LPS，是革兰氏阴性（如大肠杆菌，E.coli）胞膜上一种成分。
细菌外膜的外部脂质成分完全由内毒素分子组成。
一个E.coli包含约2百万个LPS分子，每个LPS 分子又由疏水性的脂质A、复杂的多糖链以及带负电荷的磷酸基团组成。
因此每个内毒素既包含疏水区域也包含了亲水和带电区域，从而赋予其与其它分子相互作用的独特性质。
图1. 内毒素结构图。
细菌在其活跃生长时表面的内毒素成分较少，而一旦其死亡则会释放大量内毒素。
在质粒提取的裂解过程中，内毒素会从细菌的外膜释放到裂解液中。
内毒素的存在会严重的影响质粒转染细胞的效率，此外会激活造血细胞（如B细胞、巨噬细胞等）的非特异免疫反应，造成实验的假阳性，所以转染级质粒的提取纯化必须去除内毒素。
内毒素如何测定？
历史上，内毒素测定主要是基于内毒素与鲎（一种海洋节支动物，也称马蹄型蟹）血液中的变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时可发生凝血反应。
鲎试剂与细菌内毒素产生凝胶反应的机理是：鲎的血液及淋巴液中有一种有核的变形细胞，胞浆内有大量的致密颗粒，内含凝固酶及凝固蛋白原。
当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时，可激活凝固酶原，继而使可溶性的凝固蛋白原变成凝固蛋白而使鲎变形细胞冻融物呈凝胶状态。
现在已经发展出更加灵敏的光度计测试方法，该方法主要基于鲎试剂以及一种人工合成的可产生颜色反应的底物。
LPS污染通常用内毒素单位（Endotoxin Units, EU）表示，通常情况下，1ng LPS对应于1到10个EU。
Protocol
常用的试剂盒选择包括Qiagen、Sigma都挺好用的。
或者omega、天根等。
在选择取出内毒素的质粒提取试剂盒的时候有一个小窍门，就是有的盒子上写着“Endofree”字样，这种试剂盒是专门用来提取用于细胞转染实验的质粒的。
一般这种质粒提取试剂盒采用独特的硅胶膜吸附技术，高效专一地结合质粒DNA。
同时采用特殊的溶液P4和过滤柱CS，可以有效的去除内毒素、蛋白等杂质。
没有这个字样的试剂盒，对于常规的分子克隆实验，如，PCR，酶切，克隆等完全够用了。
如果不是特别的试验，建议采用手工方法，丁香园战友推荐以下的protocol提的质粒免疫动物没有问题，曾用于制备DNA疫苗，可进行大量的去内毒素质粒提取。
1）挑取一个新鲜菌落接种于含5ml LB及相应抗生素的试管，37℃培养8-12小时。
2）用上述新鲜培养物小提质粒鉴定后，剩余的菌液接种于含相应抗生素的400ml LB培养基中，37℃培养12-16小时。
3）用500ml离心筒收集菌液，5000rpm离心10分钟，弃上清。
4）用40ml预冷的STE重悬菌体，转移至2支30ml离心管中，6000rpm 5分钟，弃上清。
5）用3ml预冷的溶液I重悬菌体，再加入6ml新鲜配制的溶液II，轻轻颠倒混匀；再加入4.5ml预冷的溶液III，轻轻颠倒混匀。
6）4℃12000rpm离心10分钟，将上清转移至另外的30ml管中。
7）加等体积的异丙醇，颠倒混匀，置于－20℃20分钟以上。
8）4℃12000rpm离心15分钟，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀，37℃蒸发至沉淀边缘透明。
9）加入5ml TE使DNA溶解后，加入5mol/L的LiCl溶液5ml，轻轻混匀，-20℃放置5-10分钟。
10）4℃12000rpm离心15分钟，转移上清，加入等体积的异丙醇，-20℃放置20分钟以上。
11)4℃12000rpm离心15分钟，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，倒置控干后，37℃蒸发至沉淀基本透明。
12）用2ml TE溶解沉淀，并加入50μl/管的RNase（5mg/ml），37℃消化过夜。
13）分装质粒DNA至1.5ml微量离心管中，加入等体积的酚－氯仿，混匀后12000rpm离心5分钟，转移上层水相至另外的微量离心管中。
14）重复步骤13）一次。
15）加入1/10体积的3mol/L的NaAc（pH5.2）和2倍体积的无水乙醇，-20℃放置20分钟以上。
16）12000rpm离心15分钟，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，弃乙醇后，37℃干燥至沉淀基本透明。
17）将质粒DNA以干燥的沉淀形式保存于-20℃，使用前按需要溶解DNA。
参考资料丁香园等。