去内毒素实验方法介绍

去内毒素质粒提取Protocol

内毒性也称为脂多糖或LPS，是革兰氏阴性（如大肠杆菌，E.coli）胞膜上一种成分。细菌外膜的外部脂质成分完全由内毒素分子组成。一个E.coli包含约2百万个LPS分子，每个LPS 分子又由疏水性的脂质A、复杂的多糖链以及带负电荷的磷酸基团组成。因此每个内毒素既包含疏水区域也包含了亲水和带电区域，从而赋予其与其它分子相互作用的独特性质。

图1. 内毒素结构图。

细菌在其活跃生长时表面的内毒素成分较少，而一旦其死亡则会释放大量内毒素。在质粒提取的裂解过程中，内毒素会从细菌的外膜释放到裂解液中。内毒素的存在会严重的影响质粒转染细胞的效率，此外会激活造血细胞（如B细胞、巨噬细胞等）的非特异免疫反应，造成实验的假阳性，所以转染级质粒的提取纯化必须去除内毒素。

内毒素如何测定？

历史上，内毒素测定主要是基于内毒素与鲎（一种海洋节支动物，也称马蹄型蟹）血液中的变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时可发生凝血反应。鲎试剂与细菌内毒素产生凝胶反应的机理是：鲎的血液及淋巴液中有一种有核的变形细胞，胞浆内有大量的致密颗粒，内含凝固酶及凝固蛋白原。当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时，可激活凝固酶原，继而使可溶性的凝固蛋白原变成凝固蛋白而使鲎变形细胞冻融物呈凝胶状态。现在已经发展出更加灵敏的光度计测试方法，该方法主要基于鲎试剂以及一种人工合成的可产生颜色反应的底物。

LPS污染通常用内毒素单位（Endotoxin Units, EU）表示，通常情况下，1ng LPS对应于1到10个EU。

Protocol

常用的试剂盒选择包括Qiagen、Sigma都挺好用的。或者omega、天根等。在选择取出内毒素的质粒提取试剂盒的时候有一个小窍门，就是有的盒子上写着“Endofree”字样，这种试剂盒是专门用来提取用于细胞转染实验的质粒的。一般这种质粒提取试剂盒采用独特的硅胶膜吸附技术，高效专一地结合质粒DNA。同时采用特殊的溶液P4和过滤柱CS，可以有效的去除内毒素、蛋白等杂质。没有这个字样的试剂盒，对于常规的分子克隆实验，如，PCR，酶切，克隆等完全够用了。

如果不是特别的试验，建议采用手工方法，丁香园战友推荐以下的protocol提的质粒免疫动物没有问题，曾用于制备DNA疫苗，可进行大量的去内毒素质粒提取。

1）挑取一个新鲜菌落接种于含5ml LB及相应抗生素的试管，37℃培养8-12小时。

2）用上述新鲜培养物小提质粒鉴定后，剩余的菌液接种于含相应抗生素的400ml LB培养基中，37℃培养12-16小时。

3）用500ml离心筒收集菌液，5000rpm离心10分钟，弃上清。

4）用40ml预冷的STE重悬菌体，转移至2支30ml离心管中，6000rpm 5分钟，弃上清。

5）用3ml预冷的溶液I重悬菌体，再加入6ml新鲜配制的溶液II，轻轻颠倒混匀；再加入4.5ml预冷的溶液III，轻轻颠倒混匀。

6）4℃12000rpm离心10分钟，将上清转移至另外的30ml管中。

7）加等体积的异丙醇，颠倒混匀，置于－20℃20分钟以上。

8）4℃12000rpm离心15分钟，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀，37℃蒸发至沉淀边缘透明。

9）加入5ml TE使DNA溶解后，加入5mol/L的LiCl溶液5ml，轻轻混匀，-20℃放置5-10分钟。

10）4℃12000rpm离心15分钟，转移上清，加入等体积的异丙醇，-20℃放置20分钟以上。

11)4℃12000rpm离心15分钟，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，倒置控干后，37℃蒸发至沉淀基本透明。

12）用2ml TE溶解沉淀，并加入50μl/管的RNase（5mg/ml），37℃消化过夜。

13）分装质粒DNA至1.5ml微量离心管中，加入等体积的酚－氯仿，混匀后12000rpm离心5分钟，转移上层水相至另外的微量离心管中。

14）重复步骤13）一次。

15）加入1/10体积的3mol/L的NaAc（pH5.2）和2倍体积的无水乙醇，-20℃放置20分钟以上。

16）12000rpm离心15分钟，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，弃乙醇后，37℃干燥至沉淀基本透明。

17）将质粒DNA以干燥的沉淀形式保存于-20℃，使用前按需要溶解DNA。

参考资料丁香园等