微生物限度方法学验证PPT课件
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药品微生物限度检测技术PPT课件
检
喷雾剂供
查
试品
1.4.2供试品检查
非
无 菌
① 平皿法
平皿法包括倾注法和涂布法
产
品 微 生 物 限 度 检 查
除另有规定外， 取规定量供试 品，按方法适 用性试验确认 的方法进行供 试液制备和菌 数测定，每稀
培养和计数 ：除另有规定外， 胰酪大豆胨琼脂培养基平板 在30～35℃培养3天，沙氏葡 萄糖琼脂培养基平板在20～ 25℃培养5 天，观察菌落生 长情况，点计平板上生长的 所有菌落数，必要时可适当 延长培养时间至7 天进行菌落
微
生
1.3.3计数方法适用性试验
物
限
度
检
查
非 无
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
菌 1.3.1菌液制备及使用
产 品
菌种
微
试验用菌株的传代次数不得超过5
生
代（从菌种保藏中心获得的干燥菌
物
限
种为第0代），并采用适宜的菌种
度
保藏技术进行保存，以保证试验菌
检 查
株的生物学特性
检
查
非
② 薄膜过滤法
无
除另有规定外，按计数方法适用性试
菌
验确认的方法进行供试液制备。取相
产
当于1g、1ml 或10 cm²供试品的供试 液，若供试品所含的菌数较多时，可
品
取适宜稀释级的供试液，照方法适用
微
性试验确认的方法加至适量稀释液中， 立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜， 培养和计数：培养条件
生
菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基 和计数方法同平皿计数
值报告菌数
非
③ MPN 法
无
药品微生物限度检查法PPT教学课件
3
操作环境
• 检验全过程应严格遵守无菌操作，在环境洁 净度10000级和局部洁净度100级单向流空气 区域内进行，以防止再污染。单向流空气区 域、工作台面及环境应定期按中华人民共和 国国家标准GB/T 16292～16294-1996 《医药 工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降 菌的测试方法》进行洁净度验证。
• 取供试品5g(5ml)，加入司盘80 5g、单硬脂 酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g的无菌溶化 混合物（温度低于45℃）的烧杯中，用无 菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃左右的 稀释剂至100ml，边加边搅拌，使供试品充 分乳化，作为1:20供试液。
2020/12/10
9
特殊供试液制备方法
• 取供试品10g，加至含玻璃珠和20ml的 无菌十四烷酸异丙酯的容器中，充分振 摇，使供试品溶解，再加入约45℃的稀 释剂，振摇5-10分钟，萃取，待油水明 显分层，取其水层作为1:10供试液。
• 一个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一 个或多个菌细胞生长繁殖而成，因此供试 品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单 位数（colony forming unity, cfu）
• ·供试品检验的全过程必须符合无菌技术 要求。
• 培养基、稀释剂、实验器具等的灭菌，按 灭菌法（见附录）的要求采用验证合格的 灭菌程序灭菌。
2020/12/10
18
操作要点
• 作供试品稀释时，每一稀释级都要更换吸管。 • ·细菌培养48h，真菌培养72h，计数。如菌落极小，不
易辨认可适当延长培养时间。再点计菌落数。 • 含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定
• 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或 cm2）
• 一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小 包装单位）的3倍量供试品。
微生物限度和无菌检查法验证PPT教学课件
2020/12/09
2
中国药典2005年版对微生物限度检查法和无菌 检查法进行了修订完善，明确规定进行药微生物 限度和无菌检查法验证目的是确认试验中应选择 药典收载的何种供试液制备方法、何种测定方法， 以及验证确定的检测系统是否适用于该药品的检 验。如果供试品有抑菌性，影响测定结果，则应 采用适当的方法消除供试液的抑菌活性后再进行 检查。也就是说，只有通过方法验证，才能确定 针对具体品种的具体的检验方法，保证采用的方 法的科学性和检验结果的准确性。
适宜、简单有效的消除抑菌性的方法是当前验证 工作的关键。Βιβλιοθήκη 2020/12/096
方法验证的步骤与内容 1、制备验证试验用菌液 按药典无菌检查法中培养基灵敏度检查项中试验用 菌液的制备方法将规定需用的试验菌分别制成每毫 升中含10～100个菌（CFU）的供试菌液。 2、样品的前处理方法 样品的前处理方法是验证试验的一部分，需证明所 用的处理方法对各试验菌的生长无影响。
微生物限度和无菌检查法验证
2020/12/09
1
微生物限度和无菌检查法验证意义：
中国药典2000年版及以前的版本虽然收载了微生 物限度检查法和无菌检查法，但在如何保证检验方 法的科学性及检验结果的准确性方面存在一些问题， 与国外药典的相关要求比较有一定差距，关键是未 明确对检验方法进行必要的方法学验证。以前品种 的申报资料中一般仅提供微生物限度检查或无菌检 查的检查结果，无方法学验证内容。但从保证药品 安全性的实际出发，不同品种需要选择建立各自适 当的检查方法，即使是仿制药，由于不同生产企业 采用的工艺、辅料等的不同，其产品可能表现出不 同的抑菌特性，进行微生物限度检查或无菌检查时， 具体的检查方法也不能简单地照搬，需要通过试验 验证核实已有的试验方法和检测系统是否适用，因 此，也需要进行必要的方法验证。
无菌微生物限度检查及方法验证.ppt
• 非必要品禁止带入实验室，必要资料和记录应消毒后进入并应远离操作 台。
• 实验人员进入洁净室（无菌室）不得化妆、戴手表、戒指等首饰；不得 吃东西。应严格按更衣程序更衣。
• 记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微 生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将 报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌 室前，至少开启机房运转1小时以上。
菌种的传代和保藏
菌种的保藏方法
• 使菌种的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，从而在一定时间内 不发生变异并保持生命活力。
• 一般来说，低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的三个 重要因素
• 无论使用那种菌种保藏方法，都应进行验证，以确保在相应保存条 件下的菌种不会变异并且性能稳定。
• 菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代（GMP，药 典）
微生物实验室应制定菌种的保藏管理规程来规范菌种的来源、申购、保 管、转种传代、存储和领用等方面的要求，确保菌种的溯源性和稳定性； 防止试验用菌种因多次传代而失去典型生物学特征发生变异或死亡，保 证菌种长期正确、稳定，从而确保实验的灵敏度和重现性。
微生物实验室的质量管理
•菌种保存应有专人负责，加锁保存于冰箱中。 •实验室的标准菌株应来自CMCC（中国药品生物制品检定所医学菌种保 藏中心或ATCC（美国菌种保藏中心）等国际法定菌种保藏机构。有接 收、确认记录。 •菌种的转种等均应在超净工作台进行，以防污染。 •各种菌种应按规定时间接种，所有保藏的菌种均应贴有相应的标签，有 菌种清单。
• 培养箱、冰箱需在设备的每个腔室内放置经校准过的玻璃温度计，每天 检查设备腔室内的温度状况并且在日志上做好相应的记录。定期回顾每 个设备的温度记录数据，以考察设备的运行状态。
• 实验人员进入洁净室（无菌室）不得化妆、戴手表、戒指等首饰；不得 吃东西。应严格按更衣程序更衣。
• 记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微 生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将 报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌 室前，至少开启机房运转1小时以上。
菌种的传代和保藏
菌种的保藏方法
• 使菌种的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，从而在一定时间内 不发生变异并保持生命活力。
• 一般来说，低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的三个 重要因素
• 无论使用那种菌种保藏方法，都应进行验证，以确保在相应保存条 件下的菌种不会变异并且性能稳定。
• 菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代（GMP，药 典）
微生物实验室应制定菌种的保藏管理规程来规范菌种的来源、申购、保 管、转种传代、存储和领用等方面的要求，确保菌种的溯源性和稳定性； 防止试验用菌种因多次传代而失去典型生物学特征发生变异或死亡，保 证菌种长期正确、稳定，从而确保实验的灵敏度和重现性。
微生物实验室的质量管理
•菌种保存应有专人负责，加锁保存于冰箱中。 •实验室的标准菌株应来自CMCC（中国药品生物制品检定所医学菌种保 藏中心或ATCC（美国菌种保藏中心）等国际法定菌种保藏机构。有接 收、确认记录。 •菌种的转种等均应在超净工作台进行，以防污染。 •各种菌种应按规定时间接种，所有保藏的菌种均应贴有相应的标签，有 菌种清单。
• 培养箱、冰箱需在设备的每个腔室内放置经校准过的玻璃温度计，每天 检查设备腔室内的温度状况并且在日志上做好相应的记录。定期回顾每 个设备的温度记录数据，以考察设备的运行状态。
药品微生物限度检查法 共49页PPT资料
加热溶化 • 注皿时培养基应在45±1℃，高于45℃时易造成细菌受损或致死，
低于45℃时易凝固，影响混匀，因此使用前可用水浴保温效果较 好。 • 倾注培养基于平皿中与样品摇匀时，切勿溅到皿盖边和皿盖上， 以免影响实验结果。
03.11.2019
20
操作要点
采用薄膜过滤法时，水溶性供试液过滤前先将
03.11.2019
4
洁净级别
洁净级别
尘粒数/m3
浮游菌
个/m2
微粒直径 微粒直径
≥0.5um ≥5um
100
≤3,500
≤0
≤5
沉降菌 个/0.5h
≤1
10000 ≤350,000 ≤2000 ≤100 ≤3
100000
03.11.2019
≤3,500,000 ≤20,000 ≤500
≤10
5
检验量
3
操作环境
• 检验全过程应严格遵守无菌操作，在环境洁 净度10000级和局部洁净度100级单向流空气 区域内进行，以防止再污染。单向流空气区 域、工作台面及环境应定期按中华人民共和 国国家标准GB/T 16292～16294-2019 《医药 工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降 菌的测试方法》进行洁净度验证。
– 当仅有１个稀释级的菌落数符合上述规定， 以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报 告菌数。
03.11.2019
14
菌数报告规则
当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比 值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以 低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值 ）而定。若比 值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均 值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级 的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。当出现比值大 于5或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落 数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应 进行方法的重新验证。
低于45℃时易凝固，影响混匀，因此使用前可用水浴保温效果较 好。 • 倾注培养基于平皿中与样品摇匀时，切勿溅到皿盖边和皿盖上， 以免影响实验结果。
03.11.2019
20
操作要点
采用薄膜过滤法时，水溶性供试液过滤前先将
03.11.2019
4
洁净级别
洁净级别
尘粒数/m3
浮游菌
个/m2
微粒直径 微粒直径
≥0.5um ≥5um
100
≤3,500
≤0
≤5
沉降菌 个/0.5h
≤1
10000 ≤350,000 ≤2000 ≤100 ≤3
100000
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≤3,500,000 ≤20,000 ≤500
≤10
5
检验量
3
操作环境
• 检验全过程应严格遵守无菌操作，在环境洁 净度10000级和局部洁净度100级单向流空气 区域内进行，以防止再污染。单向流空气区 域、工作台面及环境应定期按中华人民共和 国国家标准GB/T 16292～16294-2019 《医药 工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降 菌的测试方法》进行洁净度验证。
– 当仅有１个稀释级的菌落数符合上述规定， 以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报 告菌数。
03.11.2019
14
菌数报告规则
当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比 值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以 低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值 ）而定。若比 值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均 值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级 的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。当出现比值大 于5或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落 数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应 进行方法的重新验证。
微生物限度检验PPT课件
- 表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有效性及 对微生物的生长和存活无影响。
- 供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小 时。
- 供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。 - 供试液的体积：100ml。
13
稀释剂（ 中国药典2005版）
（1） 氯化钠-蛋白胨缓冲溶液 （2） 无菌磷酸盐缓冲液 （3） 无菌磷酸盐缓冲液
中国药典2005版
菌株名称
CMCC编号
大肠埃希氏菌(E. coli)
CMCC(B)44102
金黄色葡萄球菌(Sta. aureus) CMCC(B)26003
枯草芽孢杆菌（Bac. subtilis）
CMCC(B)63501
白色念珠菌(Can. albicans) 黑曲霉菌(Asp. niger)
CMCC(F)98001 CMCC(F)98003
一次检出为准
第一次结果超过规定标准，复 试两次，三次结果平均报告
不符合标准规定，取大于25g的 样品复试
不符合标准规定，取大于25g的 样品复试
一次检出为准
测定结果在规定的限度标准5 倍以内均为合格
6
验证目的
- 在于确认（寻找）一种有效的检验方法，如果样 品（药品）中有一定数量的微生物存在，那么采 用此法可以使得样品（药品）中的微生物得以检 出。
过滤
5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
菌种组：
5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
过滤
空白样品组：
过滤
计数A 计数B （阴性对照） 计数C （阳性对照） 计数D
- 充分验证样品（药品）本身对微生物生长的影响。
7
验证目的
确认一种检验方法。 验证实验 检验条件
- 供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小 时。
- 供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。 - 供试液的体积：100ml。
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稀释剂（ 中国药典2005版）
（1） 氯化钠-蛋白胨缓冲溶液 （2） 无菌磷酸盐缓冲液 （3） 无菌磷酸盐缓冲液
中国药典2005版
菌株名称
CMCC编号
大肠埃希氏菌(E. coli)
CMCC(B)44102
金黄色葡萄球菌(Sta. aureus) CMCC(B)26003
枯草芽孢杆菌（Bac. subtilis）
CMCC(B)63501
白色念珠菌(Can. albicans) 黑曲霉菌(Asp. niger)
CMCC(F)98001 CMCC(F)98003
一次检出为准
第一次结果超过规定标准，复 试两次，三次结果平均报告
不符合标准规定，取大于25g的 样品复试
不符合标准规定，取大于25g的 样品复试
一次检出为准
测定结果在规定的限度标准5 倍以内均为合格
6
验证目的
- 在于确认（寻找）一种有效的检验方法，如果样 品（药品）中有一定数量的微生物存在，那么采 用此法可以使得样品（药品）中的微生物得以检 出。
过滤
5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
菌种组：
5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
过滤
空白样品组：
过滤
计数A 计数B （阴性对照） 计数C （阳性对照） 计数D
- 充分验证样品（药品）本身对微生物生长的影响。
7
验证目的
确认一种检验方法。 验证实验 检验条件
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菌液制备 (3)接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培
养基上， 23～28℃培养5～7天，加3～5ml0.9％无菌氯 化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取 1ml菌液加0.9％ 无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-
4～ 10-6，使菌数约为50～100cfu/ml。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
菌液组：测定所加的试验菌数。 平皿法：取试验用的1ml菌液（约50～100cfu），分别注 入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，按平皿法测定其菌落数。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定 供试品本底菌数。（和试验组采用同法）
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌 计数所规定的方法及要求进行。对各试验菌的回收率 应逐一进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行 试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌计数验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯 草芽孢杆菌。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化，中和、 离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组， 以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时， 可用相应的稀释剂替代供试品，加入试验菌，使最终菌 浓度为每1ml 供试液含50～100cfu，按试验组的供试液 制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
样品稀释级的选择：最低稀释级，1g或1ml。
培养基：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁培养基、 营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
菌液制备 (1)接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌
的新鲜培养物至10ml营养肉汤中，35～37℃培养18～24小 时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍 递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使菌数约为50～100cfu /ml。
微生物限度检查方法的验证
微生物限度检查方法的验证
• 细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证 ——准确性（回收率）
• 控制菌检查法的验证——专属性
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证的目的：
确认所采用的方法适合该药品的细菌、霉菌、酵母 菌数的测定。照此检查法和检验条件进行供试品细菌、 霉菌、酵母菌数检查能保证检验结果的准确、可靠。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
计数方法的验证——结果判断指标 试验组的菌回收率（≥70%） 稀释剂对照组的菌回收率（≥70%）
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组的菌回收率计算：
（试验组菌落计数-供试品对照组菌落计数）÷菌液组×%
稀释剂对照组的菌回收率计算： 稀释剂对照组菌落计数÷菌液组×% 每一验证菌株均应进行上述试验。 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计
试验组： 平皿法：取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～ 100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基， 每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组： 培养基稀释法（平皿法）：取试验可能用的最低稀释级 供试液1ml分别注入n个平皿，每个平皿再注入50～100 cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每 株试验菌平行制备2份，按平皿法测定其菌落数。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组： 薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液， 过滤，冲洗，应在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。至少要一张 膜。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组： 离心沉淀法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液， 如供试液含许多药渣，先以低速500r/min离心3～5min， 取上清液，再以3000 r/min离心10～30min，取下面1ml 液体（A)，并用适当的稀释剂洗涤管底，将洗涤液与液 体（A)一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。
霉菌、酵母菌计数验证用菌株：白色念珠菌、黑曲霉。
菌株选择的原则:代表性,普遍性,低或非致病性,标准 菌株(或该药品中常见的污染菌)。 菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。加菌 量:50～100cfu。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证方法选择：平皿法（包括稀释法）、薄膜过滤法、 中和法、离心沉淀法、联合方酵母菌计数方法的验证
验证细菌各平皿倾入营养琼脂培养基。 验证霉菌、酵母菌各平皿倾入玫瑰红钠琼脂培养基。 置规定温度培养48或72h,菌落计数。计算回收率。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
回收率测定举例 供试液不用特殊制备方法 常规法 菌液组：1ml菌液 /平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平均菌 数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液1ml/平皿，平行2个平皿 （计算供试液平均菌数：B） 试验组：最低稀释级供试液1ml+ 1ml菌液/平皿，平行2个平皿 （计算供试液平均菌数：A） 回收率=(A－B)÷C×%
供试品的处理： 固体：10g 供试品+稀释剂至100ml 液体：10ml供试品+稀释剂至100ml 抑菌性供试品可采用加中和剂、自然沉降、离心或
薄膜过滤。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
• 菌液组 • 供试品对照组 • 试验组 • 稀释剂对照组 每一验证菌株均应进行上述试验（顺序）。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证的步骤：
• 根据样品特性，制定检验方法和检验条件。 • 保证验证试验所用的仪器、培养基和试剂等均符合试
验要求。 • 按制定的方法进行试验。 • 根据验证结果，判断是否符合验证的标准。若符合,按
验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不 符合，应重新设立验证方案，再进行验证，直至验证 结果符合设立的验证标准。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
菌液制备 (2)接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养
基中，23～28℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％ 无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～ 10-7，使菌数约为50～100cfu/ml。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
养基上， 23～28℃培养5～7天，加3～5ml0.9％无菌氯 化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取 1ml菌液加0.9％ 无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-
4～ 10-6，使菌数约为50～100cfu/ml。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
菌液组：测定所加的试验菌数。 平皿法：取试验用的1ml菌液（约50～100cfu），分别注 入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，按平皿法测定其菌落数。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定 供试品本底菌数。（和试验组采用同法）
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌 计数所规定的方法及要求进行。对各试验菌的回收率 应逐一进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行 试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌计数验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯 草芽孢杆菌。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化，中和、 离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组， 以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时， 可用相应的稀释剂替代供试品，加入试验菌，使最终菌 浓度为每1ml 供试液含50～100cfu，按试验组的供试液 制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
样品稀释级的选择：最低稀释级，1g或1ml。
培养基：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁培养基、 营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
菌液制备 (1)接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌
的新鲜培养物至10ml营养肉汤中，35～37℃培养18～24小 时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍 递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使菌数约为50～100cfu /ml。
微生物限度检查方法的验证
微生物限度检查方法的验证
• 细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证 ——准确性（回收率）
• 控制菌检查法的验证——专属性
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证的目的：
确认所采用的方法适合该药品的细菌、霉菌、酵母 菌数的测定。照此检查法和检验条件进行供试品细菌、 霉菌、酵母菌数检查能保证检验结果的准确、可靠。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
计数方法的验证——结果判断指标 试验组的菌回收率（≥70%） 稀释剂对照组的菌回收率（≥70%）
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组的菌回收率计算：
（试验组菌落计数-供试品对照组菌落计数）÷菌液组×%
稀释剂对照组的菌回收率计算： 稀释剂对照组菌落计数÷菌液组×% 每一验证菌株均应进行上述试验。 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计
试验组： 平皿法：取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～ 100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基， 每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组： 培养基稀释法（平皿法）：取试验可能用的最低稀释级 供试液1ml分别注入n个平皿，每个平皿再注入50～100 cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每 株试验菌平行制备2份，按平皿法测定其菌落数。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组： 薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液， 过滤，冲洗，应在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。至少要一张 膜。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组： 离心沉淀法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液， 如供试液含许多药渣，先以低速500r/min离心3～5min， 取上清液，再以3000 r/min离心10～30min，取下面1ml 液体（A)，并用适当的稀释剂洗涤管底，将洗涤液与液 体（A)一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。
霉菌、酵母菌计数验证用菌株：白色念珠菌、黑曲霉。
菌株选择的原则:代表性,普遍性,低或非致病性,标准 菌株(或该药品中常见的污染菌)。 菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。加菌 量:50～100cfu。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证方法选择：平皿法（包括稀释法）、薄膜过滤法、 中和法、离心沉淀法、联合方酵母菌计数方法的验证
验证细菌各平皿倾入营养琼脂培养基。 验证霉菌、酵母菌各平皿倾入玫瑰红钠琼脂培养基。 置规定温度培养48或72h,菌落计数。计算回收率。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
回收率测定举例 供试液不用特殊制备方法 常规法 菌液组：1ml菌液 /平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平均菌 数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液1ml/平皿，平行2个平皿 （计算供试液平均菌数：B） 试验组：最低稀释级供试液1ml+ 1ml菌液/平皿，平行2个平皿 （计算供试液平均菌数：A） 回收率=(A－B)÷C×%
供试品的处理： 固体：10g 供试品+稀释剂至100ml 液体：10ml供试品+稀释剂至100ml 抑菌性供试品可采用加中和剂、自然沉降、离心或
薄膜过滤。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
• 菌液组 • 供试品对照组 • 试验组 • 稀释剂对照组 每一验证菌株均应进行上述试验（顺序）。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证的步骤：
• 根据样品特性，制定检验方法和检验条件。 • 保证验证试验所用的仪器、培养基和试剂等均符合试
验要求。 • 按制定的方法进行试验。 • 根据验证结果，判断是否符合验证的标准。若符合,按
验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不 符合，应重新设立验证方案，再进行验证，直至验证 结果符合设立的验证标准。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
菌液制备 (2)接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养
基中，23～28℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％ 无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～ 10-7，使菌数约为50～100cfu/ml。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证