考马斯亮蓝R-250及G-250染料
考马斯亮蓝G浓度测定蛋白
实验三、考马斯亮蓝G-250比色法测定蛋白质含量一. 目的学习和掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法二. 原理考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量属于一种染料结合法。
考马斯亮蓝G-250是一种蛋白染料，其结构如下图。
它在游离状态下最大吸收波长为464nm 。
其中： R= H 时，为R-250 （R 指红蓝色）R=CH 3时，为G-250 （G 指蓝绿色）由于它所含的疏水基团与蛋白质的疏水微区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合。
当它与蛋白质结合后形成蓝色的蛋白质-染料复合物，其最大吸收波长变为595nm 。
这种结合在2分钟左右达到平衡，生成的复合物在1小时内保持稳定。
在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在595nm 处的光吸收与蛋白质含量成正比，所以可用于蛋白质含量的测定。
该方法非常灵敏，蛋白质最低检测量为5，而且此法操作简便、快速，干扰物质少，是实验室常用的蛋白质定量方法。
但染料易吸附在比色杯上（注意，不可用石英比色杯）而造成误差，操作时应及时用酒精清洗。
NHSO 3-C H 25SO 3-C H 25C H 25CH 2CH 2CO RR N +N三. 实验材料及设备1. 材料三鹿纯牛奶2. 仪器分光光度计电子天平3. 器材普通试管： 20mL×１０容量瓶： 100mL×1 ５00mL×1移液管： 1mL×4 5mL×1烧杯： 250mL×1 50mL×1滴管： 2洗耳球： 2坐标纸研钵、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1四. 试剂的配制1. 牛血清白蛋白标准液（100）精确称取0.0100g牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至100mL。
2. 考马斯亮蓝G-250染色液取0.10g考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 95%的乙醇中，加入100mL 85%的正磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL。
过滤待用。
考马斯亮蓝G250与R250的区别
考马斯亮蓝G250，又名Xylene brilliant cyaninG。比考马斯亮蓝R250多二个甲基。MW=854；λmax=590―610nm。染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。
3．将待测样本溶于100~1缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。
4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30rain。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min．
6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。
考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。
R-250是电泳专用的
G250和R250都可以染蛋白，一般用R250，G250染色后背景较深不易脱色。
一般R250 染蛋白，G250 一般测蛋白浓度，也可染胶，敏感性更高但较慢脱色较难。
染料考马斯亮蓝有G250 和R250 两种形式，在颜色索引（Colour Index）中给出了不同的编号（42655和42660）。亮蓝G和亮蓝R在冷水中分别为微溶和不溶，在热水和乙醇中分别为可溶和微溶。两种染料均能对固定的蛋白有效地进行染色，使用浓度为溶于甲醇:冰醋酸:水（50:10:40）的0.05%溶液。
又称Bradford法，由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250max λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重) =）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μSDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
图1 考马斯亮蓝标准法根据线性拟合公式y=a x+b计算所测溶液的蛋白质的含量。
（二）SDS干扰数据和图表2 考马斯亮蓝SDS干扰实验表格根据表2，以A595为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图2。
酶工程实验
实验一考马斯亮蓝G-250测蛋白含量一、实验目的：学习常用的测定蛋白质含量的方法。
二、原理考马斯亮蓝G250（R250）具有红色和蓝色两种色调。
在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质中碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族的氨基酸残基通过疏水作用结合后变为蓝色，染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm。
它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。
反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。
在0.01 ～1.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与A595值成正比。
所以常用来测定蛋白质含量。
三、试剂与仪器①标准蛋白溶液（牛血清蛋白1.0mg/ml）②考马斯亮蓝溶液：考马斯亮蓝G-250 100ｍg溶于50mL95%乙醇中，加100mL85%磷酸混匀，配成原液。
临用前取原液15mL，加蒸馏水至100mL，用粗滤纸过滤后，最终浓度为0.01%③仪器：分光光度计，旋涡混合器四、实验步骤1、配制标准蛋白溶液（牛血清清蛋白BSA：2.0mg/ml），每组10ml，2、考马斯亮蓝G-250溶液（终浓度0.01%），3、取12支试管，分为三组平行，按表中顺序加入标准蛋白溶液，水和试剂：即分别向各管中加入标准蛋白溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5ml；然后补充去离子水到0.1ml；最后各管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250。
每加完一管立刻在旋涡混合器上混匀（注意不要太剧烈）。
4、放置5min后，在分光光度计上测定样品的光吸收值A595（1号管为空白对照）。
5、用标准蛋白的量为横坐标，用A595为纵坐标，作标准曲线图，由此曲线，根据后续试验测出的未知样品的A595值，可查出未知样品的蛋白质含量。
6、实验结果分析：误差分析，为什么出现这样的结果，什么原因导致的？实验二3,5－二硝基水杨酸（DNS）法测定酶活力一、实验目的：学习DNS测定还原糖的方法二、实验原理：还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250m ax λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重)=）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μ以蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
计算出回归方程。
如Y=aX+b让后把待测样品的吸光值代入回归方程，算出待测样品浓度 SDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
考马斯亮蓝
考马斯亮蓝R-250及G-250染料考马斯亮兰G-250；名称：考马斯亮兰G-250别名：考马斯亮兰G250，酸性蓝90，考马斯亮蓝G，康美赛蓝G-250，亮蓝G英文：COOMASSIE BRILLIANT BLUE G-250CAS：6104-58-1相对分子量：854.04分子结构：性状：暗蓝-紫-棕色结晶粉末。
水中溶解度：40 g/L （20℃），溶于甲醇、乙醇；介绍及用途：考马斯亮兰G-250用于凝胶电泳和蛋白质染色。
不用渗透到胶里就比萘酚蓝黑B1（Naphthol Blue Black B1）灵敏度高3倍，简单而又灵敏；可以进行各种蛋白检测，和劳里反应相牵连的化学物质和游离氨基酸对此蛋白染色检测无任何影响。
也是P2X7嘌呤能受体激动剂。
考马斯亮兰法（Bradford法）测定蛋白浓度（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin―酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。
考马斯亮蓝染色中G250与R250的区别
考马斯亮蓝染色中G250与R250的区别考马斯亮蓝染色中G250与R250的区别Update:2009-03-15From: Hot:594R250属于慢染，脱色脱的完全，G250属于快染，脱色脱的不彻底。
R250(Coomassie brilliant blueR250).C45H44O7H3S2Na,MW=824,λmax=560―590nm.染色灵敏度比氨基黑高5倍.尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色.但蛋白质浓度超出一定范围时,对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律,用作定量分析时要注意这点.G250, 又名Xylene brilliant cyaninG.比考马斯亮蓝R250多二个甲基.MW=854;λmax=590―610nm.染色灵敏度不如R250,但比氨基黑高3倍.优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体,能选择地染色蛋白而几乎无本底色.所以常用于需要重复性好和稳定的染色,适于作定量分析.G250中的G就是Green，偏绿，R250中的R代表Red，偏红，在进行小分子量蛋白的Tricine电泳是常用G250染色，至于加热，染和脱色都可以加热，但都是在急需知道结果的情况下采用，加热后染的背景色很重脱色时间就长而且很难将背景色脱干净，脱色液经常加热会导致固定剂的会发，很快脱色剂就没用了，脱色效果很差，而且加热挥发出来的甲醛对呼吸道有刺激作用因此尽量不要加热！Coomassie G (green)-250 is greenish, stains bright blue, is less soluble and used in colloidal form (stain enters a protein better than the acrylamide, so background is minimized). Coomassie R (red)-250 dye is reddish, stains dark blue and is more soluble, usually resulting in high background.。
考马斯亮蓝G250染料试剂
仅供科研版本号：170313考马斯亮蓝G250染料试剂【产品组成】【保存条件】室温,避光,3个月【产品概述】Bradford法是常用的蛋白浓度检测的方法，与传统方法相比，更简单、更稳定、兼容性更好。
Bradford 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。
样品中β-巯基乙醇的浓度可高达1M，DTT的浓度可高达5mM。
但受高浓度的去垢剂的影响明显，故在用BradfordProteinAssayKit进行蛋白定量时，需确保SDS低于0.01%，TritonX-100低于0.05%，Tween20,60,80低于0.015%，含高浓度去污剂的蛋白定量，建议采用BCAProteinAssayKit。
考马斯亮蓝G250染料试剂由考马斯亮蓝G250、乙醇、磷酸组成，用于考马斯染料结合(Bradford)分析的总蛋白测量，其特点在于对蛋白样品中可能存在的大多数盐、溶剂、缓冲液、硫醇、金属螯合剂、还原性物质等均不排斥。
检测浓度下限达到25μg/ml，最小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1～20μl，在50~1000μg/ml浓度范围内有较好的线性关系。
【使用方法】1、稀释蛋白标准(一般为BSA5mg/ml)使其终浓度为0.5mg/ml。
注意：蛋白样品在什么溶液中，蛋白标准也应用什么溶液稀释，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释蛋白标准。
2、将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的蛋白标准孔中，加蛋白标准稀释液补足至20μl。
3、加适当体积样品到96孔板的样品孔中，补加标准品稀释液至20μl。
4、各孔加入200μl考马斯亮蓝G250染料试剂，室温放置3～5min。
5、酶标仪测定595nm波长处的吸光值，560~610nm之间的波长也可。
6、根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。
【注意事项】1、待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也应溶解于什么样的稀释液中，否者待测蛋白与蛋白标准中所含非蛋白成分不一致，有可能导致测定不准确。
考马斯亮蓝G250与R250的区别
3．将待测样本溶于100~1缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。
4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30rain。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min．
但考马斯亮蓝R250尤其适用于SDS-PAGE电泳微量蛋白质的染
R250中的R代表Red，偏红，R250属于慢染，脱色脱的完全，主要用于电泳染色
λmax=560―590nm.染色灵敏度比氨基黑高5倍.尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色.但蛋白质浓度超出一定范围时,对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律,用作定量分析时要注意.
G250中的G就是Green，偏绿，G250属于快染，脱色脱的不彻底，主要用于蛋白测定
比考马斯亮蓝R250多二个甲基.;λmax=590―610nm.染色灵敏度不如R250,但比氨基黑高3倍.优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体,能选择地染色蛋白而几乎无本底色.所以常用于需要重复性好和稳定的染色,适于作定量分析.
考马斯亮蓝G250与R250的区别Molecular Biolog 2009-09-18 17:46:00 阅读1168 评论1 字号：大中小 订阅
考马斯亮蓝G250与R250的区别
考马斯亮蓝
Coomassie brilliant blue G-250
coomassie blue staining
考马斯亮蓝G250，又名Xylene brilliant cyaninG。比考马斯亮蓝R250多二个甲基。MW=854；λmax=590―610nm。染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。
考马斯亮蓝染色法
考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法——标准方法1．电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。
加入5倍于凝胶体积的0．25％考马斯亮蓝R—250(溶解于50％甲醇和10％乙酸中)。
2．室温下振摇温育4h至过夜。
3．去除染色液，收集保存可重复使用20～40次。
4．依次在25％甲醇、7．5％乙酸中室温振摇下脱色。
灵敏度为0．1～0．5ttg蛋白／每条带。
注：①使用加热的染液或脱色液可以缩短染色或脱色的时间。
将染液或脱色液在微波炉或水浴中加热(大约50-6013)。
染色时间可缩短至20min，脱色时间约1—2h。
②加入泡沫橡胶(海绵)、羊毛状物或其他物品吸收染料，可以加快脱色时间，特别是在室温下脱色时。
考马斯亮蓝染色法——快速方法1．将凝胶放入一洁净的玻璃或塑料培养皿中加入5倍于凝胶体积的0．25％考马斯亮蓝R-250(溶解于50％三氯乙酸中)。
2．室温下振摇温育20min。
3．去除染色液，收集保存可重复使用多次，用水洗去未与凝胶结合的染料。
4．加入数倍体积的脱色液(25％甲醇、7％乙酸)。
必要时更换脱色液，将凝胶加温或在脱色液中放入海绵、滤纸片等吸收残余的染料，有助于加快脱色。
灵敏度为1．0ug蛋白／每条带。
考马斯亮蓝染色法——最高灵敏度1．染色前，考马斯亮蓝G-250(系考马斯亮蓝R-250的二甲基化衍生物)必须纯化。
因为商品制剂中的杂质可增强染色背景。
在250m17．5％乙酸中溶解4g染料，加热到70℃；加入44g硫酸铵，溶解后，冷却过滤或置室温离心(3000g，10min)，去除上清液，让染料干燥。
2．配制染色液：在500m1 2％磷酸中溶解30g硫酸铵，待其完全溶解后，加入溶于10m1水中的0．5g 纯化的考马斯亮蓝G—250。
室温保存。
3．电泳后，将凝胶放入一洁净的玻璃或塑料容器中加入5倍于凝胶体积的12．5％三氯乙酸。
4．室温下振摇温育1h或更长时间。
5．排干液体。
摇动考马斯亮蓝G—250染液，使大颗粒胶体分散，加至凝胶内。
考马斯亮蓝染色的原理和方法
考马斯亮蓝染色的原理和方法
在蛋白质染色方法中，目前以考马斯亮蓝染色最为常用。
因为它既克服了氨基黑染色灵敏度不高的限制，又比银染简便易操作。
考染的历史通过考染条带的深浅粗细，可以大致判断该条带有多少蛋白，如在8.6某6.8cm（W某L）.75mm厚的胶上15~20μg蛋白大约是下面这样的条带：考马斯亮蓝染料的种类
考马斯亮蓝分为R-150、R-250、R-350、G-250等。
其中R-350最为灵敏，R为红蓝色，G为绿蓝色。
R-250即三苯基甲烷，每个分子含有两个SO3H基团，偏酸性，与氨基黑一样也是结合到蛋白质的碱性基团上。
G-250即二甲花青亮蓝，是一种甲基取代的三苯基甲烷。
推荐一种考染的方法
⑴电泳后的凝胶立即浸泡在固定液（500ml乙醇，100ml冰醋酸，400ml蒸馏水）中至少30min，如有必要可在固定液中浸泡过夜；
⑵将固定后的凝胶在热的染色液（0.29g考马斯亮蓝溶解在250ml脱色液中，在使用前边搅拌边加热至60℃）中浸泡10min，然后用蒸馏水将凝胶淋洗一次；
⑶多次变换脱色液（250ml乙醇，80ml冰醋酸，加蒸馏水至1L），直至凝胶背景脱净为止，为加快脱色，可略加温度；以上各步最好用振荡器（摇床）震荡染色皿。
⑷为了防止凝胶干燥后的龟裂，脱去背景色的凝胶在保存液（25ml87%甘油加225ml脱色液）中浸泡30min。
然后将凝胶放在玻璃板上，再用保存液浸湿玻璃纸包住凝胶在室温下晾干。
需要声明一点，考马斯亮蓝染色的方法不是唯一的，你可以参考几种之后总结一个适合自己的方案出来。
考马斯亮蓝G250与R250的区别
考马斯亮蓝G250与R250的区别Mole cular Biol og 2009-09-18 17:46:00 阅读1168评论1 字号：大中小订阅考马斯亮蓝G250与R250的区别考马斯亮蓝Co omass ie br illia nt bl ue G-250co omass ie bl ue st ainin g又称Bra dford法，由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
考马斯亮蓝G-250（Co omass ie br illia nt bl ue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法是1976年Bra dford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lo wry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
考马斯亮蓝有G250和R250两种。
其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。
考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。
考马斯亮蓝G-2
实验一 考马斯亮蓝G-250比色法测定蛋白质含量一. 目的学习和掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法二. 原理考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量属于一种染料结合法。
考马斯亮蓝G-250是一种蛋白染料，其结构如下图。
它在游离状态下最大吸收波长为464nm 。
其中： R= H 时，为R-250 （R 指红蓝色）R=CH 3时，为G-250 （G 指蓝绿色）由于它所含的疏水基团与蛋白质的疏水微区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合。
当它与蛋白质结合后形成蓝色的蛋白质-染料复合物，其最大吸收波长变为595nm 。
这种结合在2分钟左右达到平衡，生成的复合物在1小时内保持稳定。
在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在595nm 处的光吸收与蛋白质含量成正比，所以可用于蛋白质含量的测定。
该方法非常灵敏，蛋白质最低检测量为5 g ，而且此法操作简便、快速，干扰物质少，是实验室常用的蛋白质定量方法。
但染料易吸附在比色杯上（注意，不可用石英比色杯）而造成误差，操作时应及时用酒精清洗。
三. 实验材料及设备1. 材料君乐宝纯牛奶2. 仪器分光光度计 电子天平 3. 器材普通试管： 20mL ×１０容 量 瓶： 100mL ×1 ５00mL ×1 移 液 管： 1mL ×4 5mL ×1 烧 杯： 250mL ×1 50mL ×1 滴 管：2NHSO 3-C H 25SO 3-C H 25C H 25CH 2CH 2CO RR N +N洗耳球： 2坐标纸研钵、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1四. 试剂的配制1. 牛血清白蛋白标准液（100μg/mL）精确称取0.400g牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至1000mL。
取5ml,定容到100ml待用2. 考马斯亮蓝G-250染色液取0.10g考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 95%的乙醇中，加入100mL 85%的正磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL。
考马斯亮蓝G250与R250的区别
G250常用的蛋白染料，作定性试验用,染色后为蓝绿色;R250较敏感,，做定量实验用,染胶效果较好.染色后为红蓝色 。
最正式的说法应该是这样:
考马斯亮蓝R250（Coomassie brilliant blue R250）。C45H44O7H3S2Na，MW=824，λmax=560―590nm。染色灵敏度比氨基黑高5倍。尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律，用作定量分析时要注意这点。
1．Bradford浓染液的配制：将100rug考马斯亮蓝G-250溶于50m1 95％乙醇，加入100ml浓磷酸，然后，用蒸馏水补充至200ml，此染液放413至少6个月保持稳定。
2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug／100ul之间绘制标准曲线。
考马斯亮蓝G250与R250的区别
考马斯亮蓝
Coomassie brilliant blue G-250
coomassie blue staining
又称Bradford法，由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
Hale Waihona Puke 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
+++考马斯亮蓝G-250与R-250的区别
考马斯亮蓝G-250与R-250的区别——整理至网络SDS-PAGE实验应该用R250考马斯亮蓝有G250和R250两种，在颜色索引（Colour Index）中给出了不同的编号（42655和42660）。
亮蓝G和亮蓝R在冷水中分别为微溶和不溶，在热水和乙醇中分别为可溶和微溶。
两种染料均能对固定的蛋白进行有效地染色，使用浓度为溶于甲醇:冰醋酸:水（50:10:40）的0.05%溶液。
考马斯亮蓝G250与蛋白质的结合反应十分迅速，是常用的蛋白染料，染色后为蓝绿色，常用来作为蛋白质含量的定量测定。
考马斯亮蓝R250与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为红蓝色，且可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
G250也可染胶，但染色过程慢且染色后背景高，脱色困难。
图为G250分子结构式，除去红色显示的两个甲基即为R250分子结构考马斯亮蓝R250（Coomassie brilliant blue R-250）为三苯基甲烷(triphenylmethane)，每个分子含有两个SO3-H基团，本身偏酸性，磺酸基与蛋白质的碱性基团结合形成染料-蛋白质复合物。
MW=824，λmax=560-590nm。
考马斯亮蓝R-250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合，尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色，染色灵敏度比氨基黑高5倍。
它与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色，并且在比较宽的范围内（15-20g），扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系。
但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律，用作定量分析时要注意这点。
考马斯亮蓝G250（Coomassie brilliant blue G-250）为二甲花青亮蓝(xylene cyanine brilliant blue)，是一种甲基取代的三苯基甲烷。
比考马斯亮蓝R250多二个甲基，MW=854；λmax=590-610nm，游离状态下呈红色。
实验6——可溶性蛋白质的测定
0.0100g牛血清蛋白（BSA），溶于100mL蒸 馏水中。
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4. 实验步骤 （1）样品处理：
准确称取5g豆芽于研钵中，充分研磨 后转移至100mL容量瓶中，静置20min后过 滤，弃去初滤液后备用。
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（2）标准曲线的绘制
1 2 3 4 56 BSA（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
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（3）样品的测定 另取3支10mL具塞试管，分别吸取样
品溶液0.6mL，各加入5mL考马斯亮蓝G250溶液，稀释至刻线10mL，充分混合， 放置5min后于595nm波长下比色，测定吸 光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。
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5. 结果计算
蛋白质含量（%）=
C×V2×V0 m×V1
× 100
式中： C——从标准曲线上查得的蛋白质浓度，g/mL
V0——样品溶液的总体积，mL V1——测定时加样量，mL V2——测定时定容体积，mL m ——样品的质量，g
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6. 注意事项 （1）考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德 华力结合，反应快速，并且稳定，无法用 普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞 自然衰老脱落即可无碍。
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（2）考马斯亮蓝有G-250和R-250两种。 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min
左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速 ，其结合物在室温下1h内保持稳定。
考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应虽然比 较缓慢，但可以被洗脱下去，所以可用来对 电泳条带染色。
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（3）不可使用石英比色皿（因不易洗去染 色），可用玻璃比色皿，使用后立即用少 量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。
考马斯亮蓝G-250染色法
【实验步骤 实验步骤】
1．组织样品的制备： 准确称取新鲜样品0.பைடு நூலகம்g，用5mL生理盐水在冰 浴中研成匀浆。在3500rpm离心10min，取上清 液待测。 2. 血清样品的稀释 取血清 µl，加生理盐水至
表1不同蛋白质含量的牛血清蛋白质溶液配制表 试剂 管号 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白质溶液 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.05 （100 µg/mL） 生理盐水（mL） 1.0 0.2 0.8 0.7 0.6 0.5 0.95 G-250试剂（mL） 3 3 3 3 3 3 3 蛋白质含量（µg）0 20 40 60 80 100 吸光度值
结果处理： 1、绘制标准曲线 2、求样品蛋白质浓度
优点： 试剂配制简单、操作简便快捷、灵敏度 高、重复性好、显色迅速、干扰物质较少。 测定范围1-100µg。
【实验仪器及试剂】 实验仪器及试剂】 实验仪器及试剂 1、仪器： 722分光光度计、天平、试管、 移液管、离心机
2、试剂： （1）标准牛血清蛋白质溶液： 100 µg/mL牛血清蛋白。 （2）考马斯亮蓝G-250溶液： 称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90% 90%的乙醇中，加入100mL 85%（W/V）的磷酸， 100mL 85% W/V 再用蒸馏水定容至1L，贮于棕色瓶中。常温下可 保存一个月。 （3）生理盐水： 称取0.9g NaCl 加蒸馏水至100ml。
考马斯亮蓝g250染色法考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色原理考马斯亮蓝染色时间考马斯亮蓝染色步骤考马斯亮蓝g250考马斯亮蓝g250配制考马斯亮蓝g250和r250考马斯亮蓝考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝G-250染色法测定 染色法测定 考马斯亮蓝 蛋白质含量
【实验目的】 学习掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋 白质含量的原理和方法。
考马斯亮蓝G250染液的配制
考马斯亮蓝G250染液的配制
1R250。
2100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90%乙醇中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。
此溶液在常温下可放置一个月。
310mg G-250，溶于5mL的95%乙醇中，此时溶液为蓝色，再加入了10mL的85%的磷酸，溶液为血红色，可是加水定容到100mL时又成为了蓝色，据文献说应该是褐色，原因：配置溶液的容器未洗干净，可能沾有蛋白质类药品。
用乙醇把容器全部认真的洗干净后重配，不过配好之后需要过滤才可以用。
4中文名为考马斯亮蓝G250，简称G250，分子式为C47H48N3O7S2Na，分子量为854.02，分析纯。
考马斯亮蓝G250是常用蛋白染色剂，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。
蛋白质含量在0～1000μg范围内，蛋白质一色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。
5中文名为考马斯亮蓝R250，简称R250，分子式为C45H44N3O7S2Na，分子量为825.97，考马斯亮蓝R250是常用蛋白染色剂，可用于染色丙烯酰氨凝胶和琼脂糖凝胶中的蛋白质。
6、考马斯亮蓝G250和R250都可以作为染色剂，不同的配方、不同的染色方法适合于不同性质的蛋白质。
7、考马斯亮蓝分为G250、R250和R350等，R为红蓝色，G为蓝绿色。
例如考马斯亮蓝G250即二甲花青亮蓝。
考马斯亮蓝R-250与G-250的区别
考马斯亮蓝R-250与G-250的区别考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
考马斯亮蓝有G250和R250两种。
其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。
考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
一般R250 染蛋白，G250 一般测蛋白浓度，也可染胶，敏感性更高但较慢脱色较难。
G250常用的蛋白染料，作定性试验用,染色后为蓝绿色;R250较敏感,，做定量实验用,染胶效果较好.染色后为红蓝色考马斯亮蓝R250（Coomassie brilliant blue R250）。
C45H44O7H3S2Na，MW=824，λmax=560―590nm。
染色灵敏度比氨基黑高5倍。
尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。
但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律，用作定量分析时要注意这点。
考马斯亮蓝G250，又名Xylene brilliant cyaninG。
比考马斯亮蓝R250多二个甲基。
MW=854；λmax=590―610nm。
染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。
优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。
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考马斯亮蓝R-250及G-250染料考马斯亮兰G-250；名称：考马斯亮兰G-250 别名：考马斯亮兰G250，酸性蓝90，考马斯亮蓝G，康美赛蓝G-250，亮蓝G英文：COOMASSIE BRILLIANT BLUE G-250CAS：6104-58-1相对分子量：854.04分子结构：性状：暗蓝-紫-棕色结晶粉末。
水中溶解度：40 g/L （20℃），溶于甲醇、乙醇；介绍及用途：考马斯亮兰G-250用于凝胶电泳和蛋白质染色。
不用渗透到胶里就比萘酚蓝黑B1（Naphthol Blue Black B1）灵敏度高3倍，简单而又灵敏；可以进行各种蛋白检测，和劳里反应相牵连的化学物质和游离氨基酸对此蛋白染色检测无任何影响。
也是P2X7嘌呤能受体激动剂。
考马斯亮兰法（Bradford法）测定蛋白浓度（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin―酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。
如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g―球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。
（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。
（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用 g―球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml 的标准蛋白质溶液。
（2）考马斯亮兰G―250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G―250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支（三）操作方法1. 标准方法（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。
最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G―250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。
未知样品的加样量见下表中的第8、9、10 管。
（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG―250试剂。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。
塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。
由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。
0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。
2. 微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm 的光吸收值。
0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。
考马斯亮蓝 R-250；1 名称：考马斯亮蓝 R-250 别名：亮蓝R；考马斯亮蓝R；考马斯灿烂蓝；康美赛蓝R-250；英文：COOMASSIE BRILLIANT BLUE R-250CAS：6104-59-2相对分子量：854.04分子结构：性状：暗蓝-紫-棕色结晶粉末。
水中溶解度：40 g/L （20℃），溶于甲醇、乙醇；介绍及用途：考马斯亮兰G-250用于凝胶电泳和蛋白质染色。
不用渗透到胶里就比萘酚蓝黑B1（Naphthol Blue Black B1）灵敏度高3倍，简单而又灵敏；可以进行各种蛋白检测，和劳里反应相牵连的化学物质和游离氨基酸对此蛋白染色检测无任何影响。
也是P2X7嘌呤能受体激动剂。
马斯亮蓝R-250与G-250的区别一般R250染蛋白，G250一般测蛋白浓度，也可染胶，敏感性更高，但较慢，脱色较难。
G250常用的蛋白染料，作定性试验用，染色后为蓝绿色；R250较敏感,，做定量实验用，染胶效果较好，染色后为红蓝色。
考马斯亮蓝R250（Coomassie brilliant blue R250）。
C45H44O7H3S2Na，MW=824，λmax=560~590nm。
染色灵敏度比氨基黑高5倍。
尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。
但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律，用作定量分析时要注意这点。
考马斯亮蓝G250，又名Xylene brilliant cyaninG。
比考马斯亮蓝R250多二个甲基。
分子式C47H50N3O7S2+ MW=854；λmax=590~610nm。
染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。
优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。
所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。
考马斯亮蓝R-250染色液配制方法组份浓度： 0.1％（W/V）考马斯亮蓝R-250，25%（V/V）异丙醇， 10％（V/V）冰醋酸配制量： 1L配制方法：1.称取1g考马斯亮蓝R-250,置于1L烧杯中。
2.量取250mL的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解。
3.加入100mL的冰乙醋酸，均匀搅拌。
4.加入650mL的去离子水，均匀搅拌。
5.用滤纸出去颗粒物质后，室温保存。
考马斯亮蓝的三种染色法：考马斯亮蓝染色法——标准方法 1．电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。
加入5倍于凝胶体积的0．25％考马斯亮蓝R—250(溶解于50％甲醇和10％乙酸中)。
2．室温下振摇温育4h至过夜。
3．去除染色液，收集保存可重复使用20～40次。
4．依次在25％甲醇、7．5％乙酸中室温振摇下脱色。
灵实验室前沿敏度为0．1～0．5ttg蛋白／每条带。
注：①使用加热的染液或脱色液可以缩短染色或脱色的时间。
将染液或脱色液在微波炉或水浴中加热(大约50-6013)。
染色时间可缩短至20min，脱色时间约1—2h。
②加入泡沫橡胶(海绵)、羊毛状物或其他物品吸收染料，可以加快脱色时间，特别是在室温下脱色时。
考马斯亮蓝染色法——快速方法 1．将凝胶放入一洁净的玻璃或塑料培养皿中加入5倍于凝胶体积的0．25％考马斯亮蓝R-250(溶解于50％三氯乙酸中)。
2．室温下振摇温育20min。
3．去除染色液，收集保存可重复使用多次，用水洗去未与凝{实验室前沿}胶结合的染料。
4．加入数倍体积的脱色液(25％甲醇、7％乙酸)。
必要时更换脱色液，将凝胶加温或在脱色液中放入海绵、滤纸片等吸收残余的染料，有助于加快脱色。
灵敏度为1．0ug蛋白／每条带。
考马斯亮蓝染色法——最高灵敏度 1．染色前，考马斯亮蓝G-250(系考马斯亮蓝R-250的二甲基化衍生物)必须纯化。
因为商品制剂中的杂质可增强染色背景。
在 250m17．5％乙酸中溶解4g染料，加热到70℃；加入44g硫酸铵，溶解后，冷却过滤或置室温离心(3000g，10min)，去除上清液，让染料干燥。
实验室前沿2．配制染色液：在500m1 2％磷酸中溶解30g硫酸铵，待其完全溶解后，加入溶于10m1水中的0．5g 纯化的考马斯亮蓝G—250。
室温保存。
3．电泳后，将凝胶放入一洁净的玻璃或塑料容器中加入5倍于凝胶体积的12．5％三氯乙酸。
4．室温下振摇温育1h或更长时间。
5．排干液体。
摇动考马斯亮蓝G—250染液，使大颗粒胶体分散，加至凝胶内。
6．室温下振摇温育过夜。
7．将染液倒回贮液瓶以备重复使用。
用水或常规脱色液清洗凝胶并观察脱色效果。
8．为了使胶体染料固定在蛋白质上，可再加入5倍体积的20％硫酸铵并于室温下振摇温育过夜。
凝胶固定后，可重复染色增大灵敏度。
从步骤5开始进行重复。
灵敏度为0．05～0．1ttg蛋白／每条带。
——来源：实验室前沿参考文献 Syrovy,I. and Hodny,Z. (1991).J. Chromatogr.569,175-196.。