原代细胞的取材
细胞原代培养实验具体步骤及方法
细胞原代培养实验具体步骤及方法将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。
但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。
一、实验材料准备1. Hank's液配方：KH2PO4 0.06 g，Nacl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，KCl 0.4 g，葡萄糖1.0 g，Na2HPO4·H2O 0.06 g，加H2O至1 000 ml。
Hank's液可以高压灭菌。
4℃下保存。
二、具体操作1. 将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2-3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。
2. 用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
3. 用手术剪将肝脏剪成小块（1 mm2），再用Hank's液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
4. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5. 加入3-5 ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
6. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
7. 1 000 rpm，离心10分钟，弃上清液。
8. 加入Hank's液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9. 加入培养液1-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10. 将细胞调整到5x105/ml左右，转移至25 ml细胞培养瓶中，37℃下培养。
注意1. 自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。
原代细胞培养与分离
原代细胞的培养与建系凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。
细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。
第一节原代细胞的取材人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。
一、取材的基本要求.1．取材要注意新鲜和保鲜.2．应严格无菌.3．防止机械损伤.4．去除无用组织和避免干燥.5．应注意组织类型、分化程度、年龄等.6．作好记录二、各类组织的取材技术皮肤和粘膜的取材内脏和实体瘤的取材血液细胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材动物组织取材人胚体组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材皮肤和粘膜的取材.主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘米。
内脏和实体瘤的取材.内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。
血液细胞的取材.血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。
骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材.严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。
动物组织取材.1、鼠胚组织取材.首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。
.2、幼鼠胚肾（或肺）取材.幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，然后采用无菌法从背部打开腹腔取肾。
小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材方法原代培养是指直接从体内取下的细胞、组织和器官，经过清洗、剪切、分散等步骤后，立即进行培养的过程。
小鼠细胞原代培养取材方法主要包括以下步骤：1. 实验前准备：在超净工作台或生物安全柜中进行，确保无菌环境。
2. 取材：选择健康的成年小鼠，使用颈椎脱臼法处死小鼠。
用70-75%酒精对烧杯进行消毒，将整个小鼠浸入盛有纯酒精的烧杯中浸泡1分钟进行消毒。
3. 打开腹腔：取出小鼠，将其放在不锈钢手术盘中，用无菌手术剪打开腹腔。
4. 取出组织：小心将所需组织从体内取出，放入无菌培养皿中。
5. 清洗组织：用70-75%酒精擦拭培养皿外周后，将培养皿移至超净工作台或生物安全柜中，用含双抗的Hanks液洗涤组织数遍以去除血污。
6. 剪切组织：在体视显微镜下操作，用无菌手术器械去除多余组织，用解剖镊子或眼科剪将组织剪碎至1立方毫米的肉糜状。
7. 消化组织：将剪碎的组织放入含解离液或培养基的50ml离心管中，用10ml弯头滴管对组织进行吹打5-10次，然后用1ml枪头的吹打组织，最后用200μl的尖端进行吹打。
8. 过滤分散：将上述组织悬液通过70μm过滤器过滤，切碎和分散的组织悬浮液。
9. 离心收集细胞：在1200rpm、4℃下离心10分钟，弃掉上清液，加入配置好的细胞培养基重悬细胞。
10. 接种细胞：将细胞接种于经多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。
注意事项：取材过程应在无菌环境中进行，确保整个过程不受到污染。
操作时要小心，避免损伤组织。
使用的仪器和器皿均应进行消毒处理。
培养基和试剂应选择适宜的种类和浓度。
培养条件要保持恒定，包括温度、湿度、CO2浓度等。
在实验过程中要密切观察细胞生长情况，及时发现和处理异常情况。
以上是小鼠细胞原代培养取材方法的简要步骤，具体操作可能因实验需求和条件而有所不同。
建议在进行实验前仔细阅读相关文献和资料，并咨询专业人士的建议和指导。
请简述细胞原代培养(组织块培养法)的实验步骤及注意事项
请简述细胞原代培养(组织块培养法)的实验步骤及注意事
项
细胞原代培养也被称为组织块培养法，是一种从组织中分离和培养原代细胞的方法。
以下是细胞原代培养的实验步骤和注意事项：
1.组织分离：首先需要从生物体中收集组织样本，如肝、肺、心脏等。
样本需要通过消化或机械分离等方法分离出单个细胞或小组织块。
消化方法可以使用胰酶或胰蛋白酶等酶类来消化样本，机械分离则需要使用切割器或剪刀等工具。
2.细胞培养：分离出的组织块需要在含有营养物质和生长因子的培养基中培养。
在培养过程中需要注意不要过度培养，否则会导致细胞老化或死亡。
3.传代：当细胞达到一定密度时，需要将其分离并移至新的培养皿中进行传代，以维持细胞的生长和繁殖。
注意事项：
1.细胞的培养需要在严格的无菌条件下进行，以避免细胞污染。
2.选择适当的培养基和生长因子，以保证细胞的生长和分化。
3.细胞培养过程中需要定期观察细胞的形态和生长情况，以及细胞浓度，以便及时进行传代。
4.细胞应该在体外保持与体内相似的环境和温度，以提高细胞的存活和生长率。
5.尽量使用新鲜的组织样本，避免长时间冷藏或保存，以保证细胞质量和数量的优良。
细胞培养操作指南
细胞培养操作指南细胞培养操作指南1，原代细胞培养原代培养需要严格要求：（1）取材时需要去除脂肪和坏死的组织(2)为减少对组织的损伤，需用锋利的器具(3)适度离心以去除用于解离的酶（4）由于原代培养组织细胞的存活率很低，故用于原代培养的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度。
（5）营养丰富的培养基比单一的培养基更可取，如果要添加血清，胎牛血清比牛马的血清更好。
(6)对于取材部位易于感染（如皮肤）应先用70%乙醇消毒，在无菌条件下切除组织，尽快转移入BSS或培养基中。
不要再培养室取材，因为动物可引入微生物污染。
若必须推迟，可保存在4℃，72h。
1. 剪切组织先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除粘附的结缔组织等非培养所需组织。
再次清洗后，用手术剪将组织剪成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。
静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。
2. 消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。
3. 培养细胞悬液用计数板进行细胞计数，用培养液将细胞数调整为2～5×105 cells／m1，或实验所需密度。
分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。
置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。
一般3～5d，原代培养细胞可以粘附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3 d后换液，一般7～14 d可以长满瓶壁，进行传代。
注意事项：1. 无菌操作细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般是很难消除。
2. 培养液所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。
由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。
动物细胞原代培养
实验内容
乳鼠肺组织原代培养程序 原代细胞培养操作要领 原代细胞培养注意事项 原代细胞培养的取材
乳鼠肺组织原代培养程序
取材 漂洗 剪切 消化 制备单细胞悬液 接种
取材
漂洗
剪切
消化
消化
消化
小组织块消化分离细胞
制备单细胞悬液
接种
原代细胞培养操作要领
原代细胞培养操作要领
细胞 培养
原代细胞培养方法
组织块培养法 单层细胞培养法 组织块预消化培养法 气液界面培养法 悬浮细胞培养 微载体细胞培养法 中空纤维细胞培养法
原代细胞培养方法
组织块原代培养方法示意图
单层细胞培养法
①针蕊挤压过网法
挤压过塞法分 散组织图解
单层细胞培养法
组织块预消化培养法
动物细胞原代培养
实验目的
实验用品
从供体获取组织细胞的首次培养叫原代细 胞培养或初代细胞培养。原代细胞离体时 间短．具有二倍体遗传性，在一定程度上 反映了体内生长的特性，很适合作药物测 试、细胞分化等实验研究。
根据不同的实验目的，不同的实验材料解 离或分离细胞的方法和条件各不同。一般 常用方法有二：一是组织块培养法，二是 单层细胞培养法。
原代细胞培养操作要领
细胞计数操作要领
原代细胞培养注意事项
（1）注意污染
原代细胞培养注意事项
原代细胞培养的取材
1. 取材的基本器材
原代细胞培养的取材
2 人体肿瘤标本取材
原代细胞培养的取材
原代细胞培养的取材
4 小鼠标本取材
原代细胞培养的取材
6 人皮肤标本取材
6 人皮肤标本取材
表皮 （真皮〕
பைடு நூலகம்
原代细胞提取实验报告
一、实验目的本实验旨在学习并掌握原代细胞提取的基本操作流程，了解细胞培养的基本原理，熟悉实验器材的使用方法，以及细胞分离与纯化的技术。
二、实验原理原代细胞提取是指从生物体中获取某种组织或细胞，在体外模拟体内生理条件下，使其生存、生长、繁殖或传代的过程。
通过原代细胞培养，可以研究细胞的生长、分化、转化、毒性测试等方面的生物学特性。
本实验采用组织块消化法进行原代细胞提取。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）动物组织（如肝脏、肾脏等）（2）磷酸盐缓冲盐水（PBS）（3）胰蛋白酶（4）胎牛血清（FBS）（5）MEM基础培养基（6）Hepes（7）多聚赖氨酸2. 实验仪器：（1）组织匀浆器（2）CO2培养箱（3）倒置显微镜（4）离心机（5）移液器四、实验步骤1. 取材：将动物组织（如肝脏）置于解剖盘中，用剪刀剪去多余脂肪和血管，保留肝实质。
将肝实质放入含有适量PBS的离心管中，轻轻漂洗，去除血液。
2. 组织块消化：将处理好的肝组织放入含有适量胰蛋白酶的离心管中，37℃水浴消化30分钟。
3. 细胞分离：将消化好的组织块用组织匀浆器充分匀浆，然后加入适量FBS终止消化反应。
4. 离心：将匀浆后的细胞悬液以1000r/min离心5分钟，弃去上清液。
5. 洗涤：用适量PBS洗涤细胞沉淀，重复2次。
6. 重悬：将洗涤后的细胞沉淀用适量MEM培养基重悬，调整细胞浓度为1×10^6 cells/ml。
7. 培养细胞：将重悬后的细胞悬液接种于培养瓶中，放入CO2培养箱培养。
8. 观察与记录：定期观察细胞生长情况，记录细胞形态、密度等。
五、实验结果1. 细胞形态：培养初期，细胞呈圆形或不规则形，细胞核明显，细胞密度逐渐增加。
2. 细胞生长：细胞生长迅速，细胞密度逐渐增加，形成单层细胞。
六、实验讨论1. 原代细胞提取过程中，取材和消化是关键步骤。
取材时应注意组织的新鲜度和完整性，避免机械损伤。
消化过程中，温度和时间对细胞活力有很大影响，应严格控制。
神经干细胞原代取材与培养
神经原代干细胞的取材及培养长期以来，人们认为中枢神经系统成熟的神经元很难或不能在进行分裂和增殖，属于终末分化细胞。
因而中枢神经系统的损伤、变性导致的神经元丢失及缺损难以修复，神经功能的重建被视为几乎不可能。
神经干细胞在体外分离培养和增殖的成功，为中枢神经系统再生和功能重建提供了新的可能途径。
一、神经干细胞神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群，具有自我更新能力和多向分化潜能，对损伤和疾病具有反应能力。
原代培养的单细胞在24h内自动聚集成团，这是神经干细胞在体外培养过程中的一个重要特征。
神经干细胞具有的特点有：①有增殖能力。
②有自我维持和自我更新能力，对称分裂后形成的两个子细胞为干细胞，不对称分裂后形成的两个子细胞中的一个为干细胞，另一个为祖细胞，祖细胞在特定条件下可分化为多种神经细胞。
③具有多向分化潜能，在不同因子下，可以分化成不同类型的神经细胞，损伤或疾病可以刺激神经干细胞分化。
总之，自我更新能力和多向分化潜能是神经干细胞的两个基本特征。
二、实验步骤：神经干细胞原代取材及培养1.原代取材（1）脱颈处死2周龄孕鼠，孕鼠腹部以75%酒精消毒后，手术剪打开腹腔，取出子宫，剪开子宫，取出胎鼠，置于含冰冷PBS液的10cm培养皿中。
（2）将胎鼠断头，用眼科剪分离颅骨及硬脑膜，取出脑组织，在显微镜下充分取出脑膜和血管组织。
（3）将脑组织用PBS清洗三次，剪成1mm3大小的组织块，至于含DMEM/F12的离心管中，吸管轻吹打10次，静置离心管1~2min，取细胞悬液。
重复2-3次。
（4）细胞悬液以700r/min离心6min,吸除上清，获得细胞沉淀。
用(DMEM/F12+1%N2+2%B27+bFGF20mg/ml+EFG20mg/ml)重悬后，过200目筛网，并计数。
（5）按5×105/ml密度接种，置于37℃，5%CO2培养。
原代造血干细胞培养
原代造血干细胞培养
1. 细胞来源，造血干细胞可以从骨髓、外周血或者胎盘等多种来源获得，不同来源的细胞可能有不同的特性，需要根据实验目的选择合适的来源。
2. 细胞分离，从原代组织中分离出造血干细胞需要使用适当的分离方法，比如密度梯度离心、免疫磁珠分选等，以保证分离的细胞具有较高的纯度和活力。
3. 培养条件，原代造血干细胞在体外培养时需要提供适当的营养物质、生长因子和培养基，同时也需要控制适当的温度、湿度和气体环境，以提供良好的生长条件。
4. 培养监测，在培养过程中需要定期观察细胞的形态、增殖情况和表型特征，以及对细胞进行鉴定和纯度检测，确保培养的细胞符合实验要求。
5. 应用领域，原代造血干细胞培养在干细胞治疗、造血系统疾病研究、药物筛选等领域具有重要的应用前景，可以为相关疾病的治疗和研究提供重要的实验材料。
综上所述，原代造血干细胞培养是一项复杂而重要的实验技术，需要在细胞来源、分离方法、培养条件和监测等方面进行严格的操
作和控制，以确保获得高质量的细胞用于后续的研究和应用。
组织块法原代细胞
①取材：可以的话尽量取肿瘤组织边缘远离坏死的部分，PDX也是一样
②用含有2X 青链霉素的Hank’s液洗涤三次，并剔除肉眼可见的结缔组织、血液等杂物。
③用手术剪将肿瘤组织剪成小块（1~4 mm2），再用含有2X 青链霉素的Hank’s液洗三
次，转移至离心管中。
④用含有1X 青链霉素但是不含有血清的培养液（肝癌组织可考虑用DMEM或者William’
s E培养液）洗一遍。
⑤将组织块转移到35mm培养皿中，弃去大部分的培养液，让组织块贴附于皿底，可用T
ip头调整组织块位置让其均匀分布，同时注意每一个培养皿中的组织块不可过多。
⑥将培养皿放入细胞培养箱并倾斜放置，培养皿中留存的液体以不浸没组织块为限。
⑦静置2~4小时，期间不可移动。
⑧小心的添加含有血清的完全培养液，慢慢浸没组织块（勿使组织漂起），37℃继续培养。
⑨48小时内不推荐换液，48小时后按需换液。
⑩48小时内组织块中的细胞会慢慢从组织中长出，一开始多为成纤维细胞，而后会出现上皮细胞，当上皮细胞足够多时可轻轻将组织块挑去。
⑪控制上皮细胞生长速度，当生长较密时，使用少量胰酶将其消化传代。
⑫成纤维细胞的去除推荐用差速贴壁和差速消化相结合，经过3~5次后，去除效率可达到90%以上。
进一步去除可采用分区块消化的办法，取没有成纤维的地方用少量胰酶对上皮样细胞进行消化传代。
原代细胞分离方法
原代细胞分离方法
原代细胞分离主要有两种方法：机械分散法和消化分离法。
机械分散法适用于纤维成分很少的脑组织、部分胚胎组织等。
具体步骤如下：
1. 将组织剪碎至1mm3的组织块。
2. 用PBS清洗两次，然后用吸管吹打分散组织细胞，或把已充分剪碎分散
的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出。
3. 收集细胞转入离心管中，以1000rpm/分钟离心5分钟。
4. 去上清，加入含血清的培养基，重悬后移至培养瓶中培养。
消化分离法适用于细胞间质较少的软组织，如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。
具体步骤如下：
1. 用Hanks液清洗组织三次，剪成碎块大小为4毫米左右。
再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。
2. 加入%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜。
次日再用Hanks液洗涤，弃去
上清，共洗2-3次。
3. 加入少量含血清的培养基吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。
以上是原代细胞分离的两种主要方法，可以根据实际需求和实验条件选择合适的方法进行操作。
原代滋养层细胞的分离培养及鉴定
一、概述原代细胞是从组织或器官中分离得到的未经过传代培养的细胞，通常被用于研究细胞的特性和生物学行为。
在细胞生物学研究中，原代细胞的分离、培养及鉴定是非常重要的步骤，它们可以为科学家提供更加真实的细胞生理功能和反应。
本文将讨论原代滋养层细胞的分离培养及鉴定方法。
二、原代滋养层细胞的分离1. 准备工作在进行原代滋养层细胞的分离前，先准备必要的材料和试剂，包括消毒器械、胰酶、培养基和培养皿等。
2. 组织样本的处理将所需的组织样本取出并进行消毒处理，然后用无菌工具将其切割成小块。
3. 酶解和分离将组织样本块放入含有适量胰酶的培养基中，进行酶解和振荡分离，以获得细胞悬浮液。
4. 细胞分离通过离心等方法，将细胞悬浮液离心沉淀，然后将上清液中的细胞转移到新的培养皿中。
三、原代滋养层细胞的培养1. 培养基的准备根据原代滋养层细胞的类型和特性，选择适当的培养基，并添加相应的生长因子和营养成分。
2. 细胞的培养条件将分离得到的原代滋养层细胞接种于含有培养基的培养皿中，放置在恒温培养箱内，保持适当的温度和湿度条件，定期更换培养基。
3. 细胞的观察和维护利用显微镜观察细胞的生长情况和形态特征，定期对细胞进行传代培养，确保细胞的健康和稳定生长。
四、原代滋养层细胞的鉴定1. 形态学鉴定采用显微镜观察细胞的形态特征，包括大小、形状、胞浆及核的结构等，与已知的细胞形态进行比对鉴定。
2. 免疫细胞化学鉴定利用免疫细胞化学染色技术，检测细胞内特定蛋白的表达情况，例如细胞信号分子或细胞骨架蛋白等，来确定细胞的类型和特性。
3. 分子生物学鉴定通过PCR、Western blot等分子生物学技术，检测细胞内特定基因的表达情况，以确定细胞的遗传特性和分子水平特征。
五、结论原代滋养层细胞的分离培养及鉴定是细胞生物学研究中的重要环节，操作规范和技术熟练对于获得高质量的原代细胞至关重要。
只有通过严格的分离和培养条件，并结合形态学、免疫细胞化学及分子生物学鉴定等手段，才能得到真实、可靠的实验结果，并为细胞生物学研究提供可靠的资料。
动物细胞原代培养流程
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动物细胞原代培养流程
动物细胞原代培养流程
1. 取材。
- 从健康动物体内取出所需组织，如肝脏、肾脏等，尽量选择新鲜、无菌的组织材料。
- 取材过程要迅速，减少组织暴露在外界环境中的时间，以降低污染风险。
2. 组织处理。
- 将取出的组织块用平衡盐溶液（如PBS）清洗，去除表面的血液、杂质等。
- 把组织剪成小块，一般为1 - 3mm³大小，便于后续消化。
3. 消化。
- 加入适量的消化酶（如胰蛋白酶或胶原酶），在适宜的温度（通常为37°C）和时间（根据组织类型和酶的活性而定）下进行消化。
- 消化过程中可轻轻摇晃容器，使消化酶与组织充分接触。
4. 终止消化。
- 当组织块变得松散，大部分细胞游离出来时，加入含血清的培养液终止消化。
血清中的某些成分可以抑制消化酶的活性。
5. 过滤。
- 将消化后的细胞悬液通过滤网（如200目滤网）过滤，去除未消化完全的组织块。
6. 离心。
- 将过滤后的细胞悬液进行离心，转速一般为1000 - 1500r/min，离心时间5 - 10分钟。
- 离心后弃去上清液，得到细胞沉淀。
7. 细胞计数与活力检测。
- 用适量的培养液重悬细胞沉淀，然后进行细胞计数（可使用血球计数板等工具）。
- 同时检测细胞活力（如台盼蓝染色法，活细胞不着色，死细胞被染成蓝色）。
8. 接种培养。
- 根据细胞计数结果，将适量的细胞接种到培养容器（如培养瓶、培养皿）中。
- 加入适量的培养液，放入培养箱中，在适宜的温度（37°C）、湿度（95%左右）和二氧化碳浓度（5%）下进行培养。
原代细胞提取步骤
原代细胞提取步骤
原代细胞提取是指从活体中直接获取细胞样本的过程。
以下为一般的原代细胞提取步骤：
1. 准备工作：消毒操作台面和仪器，准备所需的培养基、生长因子和其他实验材料。
2. 组织样本获取：从活体中取得需要的组织样本，可以通过手术切片、活检或组织分离等方法进行。
3. 组织碎化：将组织样本切成小块，然后使用组织破碎器、搅拌器或酶等方法将其碾碎或消化。
4. 细胞分离：通过离心等手段，将碎化后的组织样本中的细胞与其他杂质分离，比如红细胞破碎液可用于去除红细胞。
5. 细胞培养：将分离得到的细胞样本转移到培养皿中，添加适当的培养基和生长因子，设置适宜的温度、湿度和气氛，进行细胞培养。
6. 细胞筛选：在细胞培养过程中，筛选培养基中具有特定特性或感兴趣的细胞类型，可以通过细胞表面标记物、细胞形态或特定的细胞功能等进行。
7. 细胞处理：根据研究需要，可以进行细胞组分分离、基因表达分析、蛋白质提取等进一步处理。
8. 细胞保存：将提取的原代细胞进行冻存或冷冻保存，以备后续实验使用。
需要注意的是，原代细胞提取是一项复杂的操作，涉及到细胞的纯度、活力、处理时间等因素的控制，因此在操作过程中要严格按照实验设计和操作规程进行。
原代细胞提取步骤
原代细胞提取步骤1.确定实验目的：首先需要明确实验目的，例如提取和培养肿瘤细胞、蛙卵或小鼠胚胎。
2.选取适当的生物材料：确定需要提取细胞的生物体，选择适当的生物材料，如动物组织、器官或细胞系。
3.准备培养基和试剂：根据实验目的，准备适当的培养基，如DMEM、RPMI-1640或F12培养基，以及所需的试剂和溶液，如胰酶和胆汁盐、PBS缓冲液、抗生素和抗菌剂。
4.杀死生物体并取出组织或器官：采取适当的方法杀死生物体，如禁食、麻醉或使用麻醉剂和杀菌剂。
然后，使用消毒的手术器械，如手术刀或剪刀，将组织或器官剖开。
5.分离组织或器官：将组织或器官从生物体中分离出来。
这可能需要研磨、离心或过滤等方法。
在这一步骤中要注意避免外部因素的污染，如尘埃、细菌和其他细胞。
6.细胞培养：将分离出的组织或器官放入含有预先准备好的培养基的培养皿或培养板中。
培养基中通常含有生长因子、维生素和其他必需的营养物质。
7.组织或器官的细胞释放：如果需要提取的是组织或器官中的细胞，可以使用胰酶和胆汁盐等消化酶，使组织或器官中的细胞分离。
这些消化酶可使细胞表面分子解离，从而使细胞更容易分离。
8.细胞的筛选和分离：将培养皿或培养板中的细胞进行筛选和分离，以获取所需的细胞。
可以使用免疫磁珠、细胞排序、细胞分选仪或显微操作等方法。
9. 细胞存活性检测：可以通过尝试性培养或使用染色剂如Trypan蓝来检测分离出的细胞的存活性。
存活的细胞可以进一步培养或进行其他实验。
10.细胞的培养和扩增：将分离出的细胞放入新的培养皿或培养板中，供其在培养基中继续生长和扩增。
根据需要，可以提供适当的培养条件，如温度、湿度和二氧化碳浓度。
11.细胞的保存和冻存：如果需要保存或冻存细胞，可以使用冷冻保存液如DMSO（二甲基亚砜），将细胞储存于低温环境中。
总结起来，原代细胞提取涉及到生物体杀死、组织或器官分离、细胞培养和细胞分离等步骤。
这些步骤需要精确、细致地操作，以确保提取到的细胞是纯净和活力良好的。
小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材的方法如下：
1. 准备工具和试剂：显微镜、组织培养耗材（培养皿、离心管、无菌吸管等）、组织培养基、酶消化液（如胰蛋白酶）、PBS缓冲液、抗生素/抗菌剂。
2. 选择适当的组织：根据需要培养的小鼠细胞类型，选择相应的组织。
常用的组织包括肝脏、肺、脾脏、肌肉等。
3. 术前准备：将工作台面清洗消毒，准备好所需的培养皿和离心管，并在显微镜下准备好所需的组织。
4. 组织分离：将小鼠人工麻醉后，用无菌PBS缓冲液冲洗外部组织，然后取出所需的组织。
将组织切成小块，放入含有适当酶消化液的离心管中，进行酶消化。
消化时间和温度根据具体实验要求来确定。
5. 组织纯化：将酶消化后的混合细胞悬液通过滤网过滤，去除组织碎片和大颗粒。
然后将悬液离心，收集沉淀细胞。
细胞沉淀可以通过悬液离心的速度和时间的调整来控制纯化程度。
6. 细胞计数：用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定需要的细胞数量。
7. 细胞培养：将收集到的细胞沉淀转移到含有适当培养基的培养皿中。
根据细胞类型的不同，培养条件和培养基的配方也会有所区别。
一般来说，细胞培养条件包括适当的培养基、温度、CO2浓度和湿度。
8. 细胞培养维护：定期更换培养基，观察细胞的生长情况，及时处理培养皿中的细菌或真菌污染，并进行细胞的传代培养。
以上是小鼠细胞原代培养取材的基本方法，具体操作中还需要根据实验需求和细胞类型的特点进行相应调整。
细胞原代分离
细胞原代分离
细胞原代分离是指从组织或器官中分离出单个的原代细胞。
原代细胞指的是从一个个体的组织或器官中获得的细胞，它们保持了最接近于体内原始状态的特性和功能。
细胞原代分离通常包括以下步骤：
1. 组织或器官采集：从个体中采集所需的组织或器官，可以通过手术切除、刷取、离心等方法进行采集。
2. 组织或器官处理：将采集到的组织或器官进行处理，例如切割、消化、研磨等，以使细胞能够更容易地被释放出来。
3. 细胞释放：使用适当的方法释放细胞，例如酶消化、机械强制破碎、筛网等，以分离单个细胞。
4. 细胞分离：将获得的细胞悬浮液通过离心等方法进行分离，以去除细胞碎片和其他细胞类型。
分离后的细胞可以通过显微镜观察进行验证。
5. 原代细胞培养：将分离得到的原代细胞进行培养，提供适当的培养基和培养条件，以维持细胞的生长和增殖。
细胞原代分离的目的是获得具有相关性的细胞用于研究或应用。
原代细胞的优点是它们更接近于体内的细胞状态，有更高的生物学可靠性。
然而，原代细胞的培养和传代相对较为困难，细
胞可能会在传代过程中丧失特性和功能。
因此，细胞原代分离需要谨慎操作，确保得到高质量的原代细胞。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
初代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒初代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
初代组织块培养法1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。
【2017年整理】小鼠肾脏原代细胞的分离和计数
一小鼠肾脏原代细胞的分离及细胞计数(一)原理细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。
由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。
原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。
一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
(二)操作1．取材用颈椎脱位法使小鼠迅速死亡。
然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
用消过毒的剪刀剪开用乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肾脏。
置于无菌平皿中。
2．切割用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1 mm左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。
移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
3．消化吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1 ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化30分钟，每隔5分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清。
4．制备单细胞悬液向含有经消化的肾组织的离心管中加入2-3 ml PBS，用吸管吸打数次，直到看不到块状组织。
5．细胞计数1 盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
2 将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
3 统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数目。
4 计算原细胞悬液的细胞数（按照下面公式计算细胞密度）：（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×104说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
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原代细胞的取材
一、取材的基本要求
（1）取材要注意新鲜和保鲜新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。
若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h。
对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜 (DMSO) 的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。
（2）取材应严格无菌所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。
要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。
（3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。
（4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。
（5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。
取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。
（6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。
对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。
原代细胞的分离和制作
人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：
一、悬浮细胞的分离方法
组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min 的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞．
二、实体组织材料的分离方法
（一）机械分散法
所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头
压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。
此
法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。
此法仅适
用于处理纤维成分少的软组织。
（二）消化分离法
1、酶消化分离法
酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：
（１）胰蛋白酶分散技术
胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂。
胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开．胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。
①细胞类型胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。
而对含结缔组织较丰富的组织,如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效．
②酶的浓度胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%(活力1:200或1:250)．
分离方法如下：
①过夜冷消化将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用Hanks 液洗2~3次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2~3次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。
（２）胶原酶（Collagenase）消化法
适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用．可用PBS 和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。
2、非酶消化法（EDTA消化法）
常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好．
消化分离法的操作步骤：
（1）剪切把组织块剪碎，呈1~5mm3大小的组织块。
（２）加液漂洗将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁PBS洗2-3次（采用倾斜，自然沉降法）。
（3）消化加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。
胰蛋白酶消化时间不宜过长。
（4）弃去消化液采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。
（5）漂洗将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。
（6）机械分散采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。
原代细胞的培养方法
1、组织块培养法
(1)按照前述方法取材，将组织剪成或切成1mm3大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。
(2)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种20～30小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。
(3)培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。
开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。
2.消化培养法
该方法是采用前述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质（包括基质、纤维等）去除，使细胞分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。
3.悬浮细胞培养法：对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。
一、原代细胞的培养与维持
1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)
凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L，培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养，小牛血清浓度为10%～80%．在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。
贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。
2、悬浮细胞的培养
凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及
白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞．若要将淋巴细胞及白血病细胞进
行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血
清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明
细胞生长繁殖良好，一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢失），
待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。
悬浮细胞在未达到饱和密度时，但培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求时，只能采用半量换液的方式．。