化学键合相色法
第9章2-化学键合相色法-非极性键合相
AU
0.008
3.462
19.706
分离不同pKa值的化合物：
通过控制流动相pH值的方式进行分离 缓冲溶液的要求 1。要有一定的缓冲容量，但是过高的缓冲液会损害 色谱柱，不要超过50mM. 2。要与检测体系匹配，常用的磷酸盐缓冲液不挥发， 没有紫外吸收，多用于紫外检测器；醋酸铵盐系统挥 发性好，可用于ELSD、MS检测器； 3。注意缓冲液在有机溶剂中溶解度较小，因此采用 梯度洗脱时要特别注意避免出现盐析现象。 郑枫 中国药科大学药物色谱分析课程
普鲁卡因胺
n-普鲁卡因酰胺
普鲁卡因胺 n-普鲁卡因酰胺
甲醇-水（40：60）
甲醇-水+三乙胺
郑枫
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3。溶样溶剂的影响
溶剂效应：注意用流动相稀释样品
Column: HP-C18 (5m, 120Å, 4.6x250mm, 08050816168) Mobile phase:ACN:1%H3PO4 =0.3:99.7 Flow rate:1.0mL/min Column tem.: RT Wavelength:210 nm Injection Volume: 10.0L
药物色谱分析
第九章－2 化学键合相色谱
非极性键合相色谱
22:44
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1
正相键合相色谱 VS 反相键合相色谱
正 相 键 合 相 色 谱
反 相 键 合 相 色 谱
键合相极性>流动相极性
键合相极性<流动相极性
22:44
2
一、概 述
非极性键合相色谱，又称反相 HPLC(reversed phase HPLC,RP-HPLC),或反相键合相 色谱（RPBC）：硅胶表面键合 了非极性有机基团(烃基硅烷) 的固定相。常见的烃基有丙基、 己基、辛基、十六烷基、十八 烷基和苯基，其中以十八烷基 键合相（简称ODS或C18）应用 最广泛。
第9章4-化学键合相色法-离子交换键合相
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1
如何提高分离度？
可采用不同pH的缓冲液作为梯度淋洗
阴离子交换为例
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2）离子强度对保留值得影响 离子强度（缓冲盐浓度）增加，ｋ＇减
小。 原因归结于离子交换平衡的移动。
3）有机改性剂对保留的影响
如果洗脱液中加入极性有机组分（如乙 醇），则抑制离子交换，并且产生按分 配机理进行的分离。
流动相：含5 %甲酸的10 %甲醇水溶液（A相）－含1 %甲酸 的10 %甲醇水溶液（B相）0min100％B→3min100％A
色谱柱：Alltech Allsep Anion column（100mm×4.6mm, 7μ
m）
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保留规律
阳离子交换剂分离有机碱
• 在用强阳离子交换键合相分离碱性药物 时，pH↑→游离碱↑→ｋ’↓，保留时 间↓。
2）阴离子交换
A：样品离子 N：流动相离子 R：固定相带正电荷的交换基团
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1）pH值对保留时间的影响
先解离并 参加离子 交换而被 分离
弱酸及弱碱的 保留值与洗脱 液的pH值有关
不解离，不参 加离子交换， 而以分子形式 几乎无保留地 通过柱子
Tips
流动相的pH选择应适中，最好选择 在被分离的酸或碱的pka或pkb附 近，使它们解离适中，达到最佳分 离。
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第九章－4 化学键合相色谱
离子交换键合相色谱
ion exchange chromatography，IEC
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1、分离机理
1）阳离子交换
Xm+ + Y+Rs-
键合相色谱法
键合相色谱法键合相色谱法随着科学技术的不断进步，人类对于生命体的研究日益深入。
对于分子结构的识别和分析，是生物化学研究中的一项重要工作。
化学分析中的传统技术往往是使用气相色谱、液相色谱等技术进行分离和识别。
然而，有一种技术也逐渐得到应用，它就是键合相色谱法。
1.什么是键合相色谱法？键合相色谱法是一种高效液相色谱技术，用于确定化合物的分子量和结构。
该技术通过在柱子内填充载有特殊化学结构的固相键合相材料，将试样中的化合物与材料中的相结合，在分离过程中获得化学信息。
2.键合相色谱法的原理键合相色谱法的原理是将分子与特殊的固相材料相结合，然后通过改变流动相成分的性质，使之离开材料表面，实现分离的过程。
常见的键合相材料有氨基、硅胶、硅胶大孔、疏水性、离子交换、配基和亲水性等材料。
3.键合相色谱法的应用键合相色谱法具有许多应用。
最常见的应用是用于鉴定和识别化合物的分子量和结构。
另外，该技术还可使用于制药、食品、环保、化妆品等领域中的生产工艺和质量控制。
此外，由于键合相色谱法操作简单，易于掌握，因此在许多人文和社会科学领域中也得到广泛的应用。
4.键合相色谱法的发展前景随着时代的进步，各行各业的要求越来越高。
对于分子结构的研究和生产领域中化合物的分离和识别，越来越需要更强大的技术手段。
键合相色谱法正是一个很好的选择。
由于它的分离效率高，能够满足更高的分析要求，因此可以预见，键合相色谱法在未来的发展中，将会变得更加重要。
综上所述，键合相色谱法是一种非常有前途的液相色谱技术。
它的分离效率、操作简单、易于掌握等优点，为其在分子结构的识别和分析方面提供了广泛应用的前景。
我们期待着，随着科学技术的不断进步，键合相色谱法将会给我们带来越来越多的惊喜。
键合相色谱法缩写
键合相色谱法缩写
键合相色谱法缩写
一、什么是键合相色谱法？
键合相色谱法（bonded phase chromatography）是一种常用的高效液相
色谱技术，在生物医药领域的分离、纯化、鉴定等方面有着广泛的应用。
它利用化学键结合作为液相固定相，对化学反应物质进行强制吸附，利用物质分子的亲密接触，以此实现物质的分离。
二、键合相色谱法的优点
1. 良好的分离效果
键合相色谱法通过制备稳定的固定相，在不同的条件下对物质进行吸
附和排除，从而实现对物质的分离。
由于化合物之间的吸附作用很强，所以键合相色谱法能够很好地分离化学反应物质。
2. 高效性
键合相色谱法的吸附效果稳定，与分析程序的时间较短相关，可以处
理大量的样品，提高工作效率。
3. 容易操作
键合相色谱法设备简单，操作容易，也容易选择和准备固定相。
三、键合相色谱法缩写的意义
键合相色谱法的缩写是BPC，其全称为“Bonded Phase Chromatography”。
缩写的使用是为了方便人们记忆，并且能够简洁、明确地表达技术名称。
此外，缩写也有助于人们在文献资料中进行查询和阅读。
四、总结
键合相色谱法是一种应用广泛的高效液相色谱技术，用于生物医药领
域的分离、纯化、鉴定等方面。
其具有良好的分离效果、高效性和容
易操作等优点。
为了方便人们记忆、查询和拓展文献资料，BPC就是
该技术的缩写形式。
药物色谱分析
当不能达到分离要求时，可用相同洗脱能力的不 同溶剂系统代替原溶剂系统。
在色谱柱耐受范围内，可加入调节剂，抑制弱酸 的解离或弱碱的质子化，增加其分配系数。
第三节 非极性键合相色谱法 （non-polar bonded phase chromatography）
第三节 非极性键合相色谱法 （non-polar bonded phase chromatography）
三、非极性键合相色谱法的流动相的基本组成 1、一元溶剂系统：一般不采用纯水系统 2、二元溶剂系统：一般采用洗脱能力较弱的水作为底剂，再加
入一定量与水相混溶的有机溶剂作为调节剂，如甲醇、乙腈， 也可考虑四氢呋喃 3、三元溶剂系统：在二元溶剂系统基础上添加四氢呋喃、三乙 胺、离子对试剂、缓冲盐、醋酸、磷酸等
第三节 非极性键合相色谱法 （non-polar bonded phase chromatography）
四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则
原则 首选溶剂
多元溶剂
洗脱能力
替代溶剂
离子抑制 色谱
解释
非极性色谱首选溶剂为甲醇、乙腈、四氢呋喃， 底剂为水
由不同组别的纯溶剂与底剂（或极性调节剂）组 成，一般不同时使用两个相同组别的纯溶剂
第三节 非极性键合相色谱法 （non-polar bonded phase chromatography）
四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则
四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则
（一）中性化合物的分析
减小保留值
增加保留值
使用碳链较短的键合相C8、 使用碳链较长的键合相C18、 C4
使用极性低的流动相，增加 使用极性大的流动相，增加
何谓化学键合相色谱,正相色谱和反相色谱
化学键合相色谱是一种分析化学方法，它利用化学键合相作为固定相，通过化学键合相与样品分子之间的化学作用来实现分离。
化学键合相色谱分为正相色谱和反相色谱两种类型。
正相色谱中，固定相是极性的，而流动相是非极性的，样品分子在固相和流动相之间根据极性差异进行分离。
反相色谱与之相反，固定相是非极性的，而流动相是极性的，样品分子根据溶解度差异进行分离。
1. 化学键合相色谱的定义化学键合相色谱是一种以化学键合相为固定相的色谱分离技术。
化学键合相是一种将固定相与填料表面通过化学键结合的材料，它能够提供更高的稳定性和选择性，并且适用于更广泛的分析对象。
化学键合相能够与样品分子进行特定的化学作用，从而实现样品分离。
2. 正相色谱正相色谱的固定相是极性的，如硅胶或乙醇胺等，而流动相是非极性的溶剂，例如正己烷或甲醇等。
在正相色谱中，样品分子根据其极性差异在固定相和流动相之间进行分离。
极性分子与固定相的作用力较强，因此在固定相中停留时间较长，而非极性分子则停留时间较短。
3. 反相色谱反相色谱的固定相是非极性的，如碳链或苯基等，而流动相是极性的溶剂，例如水或乙腈等。
在反相色谱中，样品分子根据其在固定相和流动相中的溶解度差异进行分离。
溶解度较大的分子在固定相中停留时间较长，而溶解度较小的分子则停留时间较短。
4. 化学键合相色谱的应用化学键合相色谱广泛应用于生物化学、药学、食品安全等领域。
正相色谱常用于酚类、羟基化合物、酮类等极性化合物的分离，反相色谱则常用于脂溶性化合物、脂肪族化合物的分离。
由于化学键合相色谱能够提供更高的选择性和分辨率，因此在复杂样品分析中具有较大的优势。
5. 化学键合相色谱的发展随着化学分析技术的不断发展，化学键合相色谱也在不断完善和创新。
新型的化学键合相材料和方法的引入，使化学键合相色谱具有更广泛的适用性和更高的分析效率。
未来，化学键合相色谱将会在更多领域得到应用，并且成为分析化学中不可或缺的重要方法之一。
正相化学键合色谱和反相化学键合色谱的异同点
正相化学键合色谱和反相化学键合色谱的异同点正相化学键合色谱和反相化学键合色谱是一种应用于分析化学品的分析手段，主要用于研究化合物的结构。
两者的最大的不同在于所使用的溶剂以及所采用的技术。
正相化学键合色谱是一种基于气相色谱（GC）仪器的技术，它以正电解质为柱前溶剂，其中含有微量氯化物或其它类似物质，以及氢气或氦气作为柱间溶剂。
在正相化学键合色谱中，样品以常压抽取或低温热抽取的方式进入柱内，在高温下分解，分子会通过柱内的色谱运动，其中包含的元素会在柱内按照不同的速度移动，从而形成一个准确的按照时间的排列的色谱。
反相化学键合色谱是一种基于液相色谱（LC）仪器的技术，它以带有负电解质的溶剂，如乙腈、甲醇、甲醛、乙醇或水作为柱前溶剂，以及氢气、氦气或其他气体作为柱间溶剂。
在反相化学键合色谱中，样品以常压抽取或低温热抽取的方式进入柱内，在高温下分解，分子会通过柱内的色谱运动，其中包含的元素会在柱内按照不同的速度移动，形成一个准确的按照时间的排列的色谱。
正相化学键合色谱和反相化学键合色谱的最大区别在于柱前溶剂的不同。
由于柱前溶剂的不同，正相化学键合色谱和反相化学键合色谱在分解样品时，其分子移动速度存在显著差异。
此外，由于反相化学键合色谱柱前溶剂中含有负电解质，样品中的分子在柱内会受到电解质的影响，从而影响样品的分解，从而影响色谱的检测精度。
正相化学键合色谱和反相化学键合色谱之间的区别使得它们的应用领域也有所不同，正相化学键合色谱更适合分析烷烃、芳烃和其他脂类物质，而反相化学键合色谱更适合分析芳香族物质、碳酸酯和其他有机酸类物质。
总之，正相化学键合色谱和反相化学键合色谱之间的差异在于所使用的溶剂以及所采用的技术，他们的应用领域也不同，有助于更好地分析化合物的结构，从而更好地了解化学品的性质。
化学键合相色谱法
一、原理“化学键合相色谱法”——采用化学键合相作固定相的液相色谱法。
化学键合相是利用化学反应通过共价键将有机分子键合在载体（硅胶）表面，形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相。
其分离机理为吸附和分配两种机理兼有。
对多数键合相来说，以分配机理为主。
通常，化学键合相的载体是硅胶，硅胶表面有硅醇基，≡Si–OH，它能与合适的有机化合物反应，获得各种不同性能的化学键合相。
从键合反应的性质可分为：酯化键合（≡Si-O-C）、硅氮键合（≡Si-N）和硅烷化键合（≡Si-O-Si-C）等；硅烷化键合相应用最广泛。
这种键合相是用有机氯硅烷与硅醇基发生反应：≡Si–OH + C18H37 SiCl3→ ≡Si-O–Si–C18H37 + HCl,这种固定相在pH = 2～8.5 范围内对水稳定，有机分子与载体间的结合牢固，固定相不易流失稳定性好。
十八烷基硅烷键合相（Octadecylsilane 简称ODS或C18）：是最常用的非极性键合相。
它们用于反相色谱法，在70℃以下和pH 2～8范围内可正常工作。
化学键合固定相具有如下优点：①柱效高：传质速度比一般液体固定相快；②稳定性：耐溶剂冲洗，耐高温，无固定液流失，从而提高了色谱柱的稳定性和使用寿命；应用范围广：改变键合有机分子的结构和基团的类型，能灵活地改变分离的选择性，适用于分离几乎所有类型的化合物；且能用各种溶剂作流动相（梯度洗脱）。
二、流动相化学键合相色谱所用流动相的极性必须与固定相显著不同，根据流动相和固定相的相对极性不同分为：1、正相键合相色谱法：流动相极性小于固定相极性。
常用非极性溶剂如烷烃类溶剂，样品组分的保留值可用加入适当的有机溶剂（调节剂）的办法调节洗脱强度。
常用有机溶剂为极性溶剂如氯仿、二氯甲烷、已腈、醇类等。
适用于分离中等极性化合物，如脂溶性维生素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有机氯农药等。
2、反相键合相色谱法：流动相极性大于固定相极性。
流动相多以水或无机盐缓冲液为主体，再加入一种能与水相混溶的有机溶剂（如甲醇、乙睛、四氢呋喃等）为调节，根据分离需要，改变洗脱剂的组成及含量，以调节极性和洗脱能力。
【免费下载】化学键合相色谱法
对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料电试力卷保相护互装作置用调与试相技互术关，系电，力根保通据护过生高管产中线工资敷艺料设高试技中卷术资配，料置不试技仅卷术可要是以求指解，机决对组吊电在顶气进层设行配备继置进电不行保规空护范载高与中带资负料荷试下卷高总问中体题资配，料置而试时且卷，可调需保控要障试在各验最类；大管对限路设度习备内题进来到行确位调保。整机在使组管其高路在中敷正资设常料过工试程况卷中下安，与全要过，加度并强工且看作尽护下可关都能于可地管以缩路正小高常故中工障资作高料；中试对资卷于料连继试接电卷管保破口护坏处进范理行围高整，中核或资对者料定对试值某卷，些弯审异扁核常度与高固校中定对资盒图料位纸试置，.卷编保工写护况复层进杂防行设腐自备跨动与接处装地理置线，高弯尤中曲其资半要料径避试标免卷高错调等误试，高方要中案求资，技料编术试5写交卷、重底保电要。护气设管装设备线置备4高敷动调、中设作试电资技，高气料术并中课3试中且资件、卷包拒料中管试含绝试调路验线动卷试敷方槽作技设案、，术技以管来术及架避系等免统多不启项必动方要方式高案，中；为资对解料整决试套高卷启中突动语然过文停程电机中气。高课因中件此资中，料管电试壁力卷薄高电、中气接资设口料备不试进严卷行等保调问护试题装工，置作合调并理试且利技进用术行管，过线要关敷求运设电行技力高术保中。护资线装料缆置试敷做卷设到技原准术则确指：灵导在活。分。对线对于盒于调处差试，动过当保程不护中同装高电置中压高资回中料路资试交料卷叉试技时卷术，调问应试题采技，用术作金是为属指调隔发试板电人进机员行一，隔变需开压要处器在理组事；在前同发掌一生握线内图槽部纸内故资，障料强时、电，设回需备路要制须进造同行厂时外家切部出断电具习源高题高中电中资源资料，料试线试卷缆卷试敷切验设除报完从告毕而与，采相要用关进高技行中术检资资查料料和试，检卷并测主且处要了理保解。护现装场置设。备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。
第9章2-化学键合相色法-非极性键合相
④ 温度的影响
• 温度升高，保留值降低； • 温度升高，柱效提高。
郑枫
中国药科大学药物色谱分析课程
郑枫
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2、双保留机理
• 双保留机理—— 溶质的保留值应包括两部分的贡献，即疏
溶剂效应和亲硅醇基效应。
• “亲硅醇基效应”—— silanophilic interaction
盐酸非洛普的代谢物M3
OCH3 OH
郑枫
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② 烷基键合固定相特性对保留值的影响
A. 烷基数量越多，溶质保留越强。
郑枫
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② 烷基键合固定相特性对保留值的影响
B. 烷基碳链越长，溶质保留越强
随着烷基碳链的增长，增加了键合相 的非极性作用的表面积，其不仅影响 溶质的保留值，还影响色谱柱的选择 性，即随烷基碳链的加长其对溶质分 离的选择性也增大。
郑枫
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郑枫
当溶质进入到极 性流动相中后，溶 质分子（S）被流 动相推动并与固定 相接触时，溶质分 子的非极性部分会 与非极性固定相上 的烷基(L)发生缔合 作用，结合形成缔 合物(LS)。
•这种疏溶剂的缔合 作用是可逆的。
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4）溶质保留值的影响因素
3）“疏溶剂效应” —— solvophobic interaction
• 当溶质分子的非极性部分与极性溶剂接触时，相 互间产生斥力。此现象称为“疏溶剂”。而极性 部分与极性溶剂相互吸引。
• 而当溶质分子的非极性部分与键合相表面的烷基 （分子毛）接触时，则相互间产生缔合作用。这 种缔合作用是可逆的。这种缔合作用的强弱决定 了溶质分子色谱保留的强弱。
化学键合相色谱法
化学键合相色谱法（bonded-phase chromatography）是一种分离和分析样品中化合物的方法。
它基于化学键合相的特性，将固定相（stationary phase）与色谱柱表面进行共价键合，以增强对目标化合物的选择性吸附和分离。
在化学键合相色谱法中，色谱柱的固定相通常是由无机或有机材料制成的颗粒，表面上具有特定的官能团（例如硅烷基、氨基、酰胺等）。
这些官能团可以与待分离化合物发生化学反应，形成键合，从而实现对目标化合物的选择性吸附。
化学键合相色谱法的工作原理类似于其他液相色谱技术。
样品溶液被注入色谱柱，流动相（移动相）通过色谱柱，在固定相上发生吸附和解吸过程。
根据化合物与固定相之间的相互作用力的差异，不同化合物会以不同的速率通过色谱柱，实现分离和分析。
化学键合相色谱法在分析复杂样品中的有机化合物、生物大分子和药物等方面具有广泛的应用。
通过选择合适的固定相和流动相条件，可以实现对目标化合物的高效分离和纯化，提高分析的灵敏度和选择性。
需要注意的是，化学键合相色谱法需要特定的色谱柱和固定相，以及相应的操作技术和条件，因此在实际应用中需要进行合适的选择和优化。
化学键合相色法
1、化学键合相的制备
硅胶预处理
溶剂与试剂 预处理
衍生化反应
端基封尾
第8页，本讲稿共36页Fra bibliotek(1)硅胶的预处理
• 在制备键合相时，首先作为担体的硅胶需要酸 处理，洗去制备、运输和保存过程中引入的污 染物；除去表面层的金属氧化物杂质，如Na+、 Ca2+、Al3+、Fe3+等；使表面的硅氧烷键打开， 形成尽可能多的自由羟基，有利于反应。
第10页，本讲稿共36页
（2）溶剂与试剂预处理
• 硅烷化试剂对水很敏感，使用前应以蒸馏方式 进行纯化或以玻璃棉将其中的悬浮物滤去。所 使用的有机溶剂，必须进行干燥。
第11页，本讲稿共36页
（3）衍生化反应
（1）Si－O－C键型 （2）Si－N或Si－C键型 （3）Si－O－Si－C键型
第12页，本讲稿共36页
亲核试剂所切断：
Si Si O
Si OH
+
Si O-M+
M+OH-
第4页，本讲稿共36页
4、化学键合相的分类
• 化学键合相的分类可以有不同的依据。 按键合相的表面结构：单分子键合和聚合键合；
按键合有机硅烷的官能团：极性键合相、非极 性键和相和离子交换键合相三种。
第5页，本讲稿共36页
二、制备与评价
• Waters公司旗下的色谱柱品牌有很多，如μ BondapakTM，它是 能经历20多年但性能基本上保持一致的HPLC色谱柱。
• XTerra®色谱柱使用的杂化颗粒技术突破了化学的极限,是 Waters公司历史上HPLC色谱柱销售增长最快的色谱柱家族， 无论是药物发现、药物开发，还是进行药物分离和纯化， XTerra®杂化颗粒技术都受到制药领域科学家的热烈欢迎， 并在2000年度为Waters赢得R&D100大奖。
化学键合相薄层色谱
（ 二）化学键合相薄层板的性能 化学键合相薄层板具有许多优良性能，因此扩 大了Ｒ ＬＣ ＰＴ 的应用。其主要特性如下： １ ．重复使用。用过的键合相薄层板只要经过 洗涤和干燥后就可以重新使用［－］ 如 Ｗｈｔ ３５。例 ａ－ ｍｎ ａ生产的ＫＣ８ １ 反相薄层板层析后， 只要用Ｍｅ Ｈ Ｏ 或Ｃ Ｃ２ Ｈ２ ｌ 洗去层析物 （ Ｖ光下不被检出）就可 在Ｕ 重新使用。此板经 ５ 次再生使用，未发现性能变异 （ 薄层板必须避免机械损坏）。 ２ ．重现性良好 在吸附Ｔ ＬＣ中，硅胶的活 性常因吸附空气中水分而降低，用此硅胶 板 实验 时，层析物的 Ｒ 值常常随之变异，给鉴定带来麻 ｆ 烦， 而化学键合相硅胶则不存在这个问题。 在湿度不 同实验环境中用化学键合相硅胶实验，仍然获得重 现性良好的Ｒ 值，相对标准偏差为２ ％。 －３ 但是， 用水和醇混合溶剂作流动相时，为了保证得到重现
（ 展距４ ｍｍ ）
许使用强酸 ［ 例如Ｍｅ Ｈ－． ｏ／ Ｏ ０ｍｌ ２ ＬＨＣ （ ）。 ｌ６４］ ２ ．展开时间 Ｇｒｓｉｉ ］ Ｒ －８薄层板 ａｓ ［ 在 Ｐ １ ｎ８ 上，以四种溶剂作流动相，研究了流动相组成与展 开时间的关系 （ 见图６ 。由图可见，随着水含量 的增加，展开时间也长。展开时间与不同的化学键 合固定相也有关系，见表２ 。 从表２看出：ＫＣ８ １固定相的展开时间最短， 仅为其它展开时间的１－１。值得注意的是当水含 量＞４％时，ＫＣ８ ０ １薄层易膨胀或脱落。但是，在 流动相中加入 ３ Ｎａ ｌ ． ｌ Ｃ ０ ｍｏ／ ５ Ｌ）溶液或等克分 子的Ｃ Ｃ２ ａ ｌ则可克服这个困难，并能使展开时间控 制在１－１分钟之间。几种化学键合相材料使用时 ０ ５
降。
允许最高水含量见表３ 。
３ ．最佳分离 为了实现最佳分离，应根据样
氨基键合相是正相键合相色谱法的固定相
氨基键合相是正相键合相色谱法的固定相
在色谱分析中，氨基键合相是一种常用的固定相类型，常用于正相键合相色谱法。
氨基键合相是基于硅胶或二氧化硅基质的固定相，表面上包含有键合了氨基基团的化学试剂。
通过氨基键合相固定相，可以在正相色谱分析中实现对醇、醛、酮、酸等极性化合物的分离。
和传统的氢键键合相相比，氨基键合相在水相体系中的稳定性更好，并且对多种物质拥有较好的选择性。
氨基键合相在分析化学中广泛应用，特别适用于有机化学、医药化学等领域的分析研究。
需要注意的是，在使用氨基键合相进行色谱分析时，样品的pH 值对分离效果会有一定影响。
正相键合相色谱法
正相键合相色谱法
正相键合相色谱法是一种色谱分析方法，通常用于分离极性或离子化合物。
它基于键合相的选择性，其中键合相是一种多孔固定相，可通过与样品中的化合物发生相互作用来分离它们。
在正相键合相色谱法中，固定相通常是疏水性的，如碳链或硅胶。
这些固定相上的化学键可以与样品中的极性化合物形成氢键或范德华力等相互作用。
通过调节流动相中的溶剂极性，可以控制化合物与固定相的相互作用，进而分离它们。
正相键合相色谱法适用于分离极性化合物，如有机酸、酚类、醇类、氨基酸等。
常用的流动相包括水-有机溶剂混合物，如水-乙腈或水-甲醇体系等。
根据样品的性质和分离要求，可以调节流动相的溶剂比例、pH值和离子强度等参数，以优化分离效果。
正相键合相色谱法可以应用于很多领域，如生化分析、药物分析、环境分析等。
它具有分析速度快、操作简便、分离效果好等优点，因此得到广泛应用。
化学键合相色谱法
化学键合相是利用化学反应通过共价键将有机分子键合在载体（硅胶）表面， 形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相。其分离机理为吸附和分配两种机 理兼有。对多数键合相来说，以分配机理为主。通常，化学键合相的载体是硅胶， 硅胶表面有硅醇基， ≡Si–OH，它能与合适的有机化合物反应，获得各种不同 性能的化学键合相。
荧光量子产率 荧光量子产率（Yf）即荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光 的光子数之比值。它的数值在通常情况下总是小于 1。YF 的数值越大则化合物的 荧光越强，而无荧光的物质的荧光量子产率却等于或非常接近于零。Yf=kf/(kf+ Σki)
量子产率取决于辐射和非辐射跃迁过程，即荧光发射、系间跨越、外转移和 内转移等的相对速率，式中 kf 是荧光发射的速率常数，Σki 是系间跨越等非辐 射跃迁过程的速率常数的总和。通常 kf 主要取决于分子的化学结构，Σki 主要 取决于化学环境，同时也与化学结构有关。磷光的量子产率与荧光相似。 蓝移（或紫移，hypsochromic shift or blue shift)是吸收峰向短波长移动。 保留值 气相或液相操作中，当仪器的操作条件保持不变时， 任一物质的色谱峰总是在 色谱图上固定的位置出现， 即有一定的保留值。又包含：死时间，保留时间， 校下保留时间，保留体积，等等、 电子光谱 分子中电子在电子能级之间跃迁产生的光谱 斯托克斯位移 固体吸收光子（吸收）的能量将大于辐射光子（发光），因此发光光谱与吸收光 谱相比，将向能量较低的方向偏移（红移），两个光子能量的差值称为斯托克斯 谱位移。能量的差值主要是由于晶体中热质子的损耗，在该过程相反过程中使得 晶体得到冷却。 荧光光谱发生向短波方向的位移被称为反斯托克位移 （Anti-Stoke’s shift）。 偶极矩 正、负电荷中心间的距离 r 和电荷中心所带电量 q 的乘积，叫做偶极矩μ=r×q。 共振线 原子受到外界能量激发时，其外层电子从基态跃迁到激发态所产生的吸收线称为 共振吸收线，简称共振线。 外层电子由激发态直接跃迁到基态时所辐射的谱线 称为共振发射线，也简称为共振线。原子由激发态直接跃迁到基态所发射的谱线。 由最低激发态跃迁到基态所发射的谱线，称为第一共振线。第一共振线的激发能 最低，原子最容易激发到这一能级。因此，第一共振线辐射最强，最易激发。上 述为共振线的广泛定义。 生色团 生色团是指分子中含有的，能对光辐射产生吸收、具有跃迁的不饱和基团。某些 有机化合物分子中存在含有不饱和键的基团，能够在紫外及可见光区域内（200～ 800nm）产生吸收，且吸收系数较大，这种吸收具有波长选择性，吸收某种波长 （颜色）的光，而不吸收另外波长（颜色）的光，从而使物质显现颜色，所以称 为生色团，又称发色团(chromophore)。 增色效应 增色效应是指由于化合物结构改变或其他原因，使吸收强度增加的效应 HPLC 高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统， 将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固 定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样 的分析。
第9章3-化学键合相色法-极性键合相
宋敏
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三、固定相
• 氨基、氰基、芳硝基、二醇基、醚基键 合相可用作正相色谱。它们主要以氢键 力与溶质相互作用，其氢键力以下列顺 序逐渐减弱： 氨基﹥氰基﹥芳硝基﹥二醇基﹥醚基
宋敏
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2、氰基键合相
• 氰基键合相为质子接受体，具有中等极性，分 离选择与硅胶类似，但比硅胶的保留值低。
• 对酸性、碱性样品可获得对称的色谱峰。 • 对含双键的异构体或双键环状化合物具有良好
的分离能力。
• 与氨基键合相比较，溶质在此类固定相的k值 会减小。
宋敏
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分离结构相近的组分时，极性大的组 分后出柱。
宋敏
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四、流动相－正相色谱
3、溶质保留值随溶剂极性变化的一般保
留规律
在正相色谱中，使
用弱极性溶剂作流
动相，则极性弱的
B组分先流出，A组
分后流出。当更换
中等极性溶剂作流
动相时，二者流出
顺序不便，但他们
的保留值都进一步
宋敏
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宋敏
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1、氨基键合相
• 氨基具有碱性，可在酸性水溶液中作为弱阴离 子交换剂，用于分离酚、羧酸、核苷酸。
• 氨基用作反相固定相可与糖分子中的羟基作 用，因此广泛用于单糖、双糖以及多糖的分 离。
注意
氨基柱不可分析羰基的化合物 （如甾酮、还原糖等）
宋敏
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宋敏
高效液相色谱讲座(Ⅵ)化学键合固定相色谱(下)
表 ６５ －
反相液相色谱中常用的 一些溶 剂
以适应不同分离的要求。根据反相条件下对流动相 性质的综合要求，特别是紫外吸收和粘度的特性， 反相条件下用得最广的流动相系统是甲醇／ 水，乙 腈／ 水和四氢呋喃／ 水。不同溶剂种类，选择性将有 较大的差异， － 图６６表示了一个典型的例子， 由于与 水混合的有机溶剂不同，甚至使溶质的流出次序相 反。可见四氢呋喃 Ｔ ）比甲醇更能保留酚类而 ＨＦ
化 学 键 合 固 定 相 色 谱 （ 下）
王俊德 商振华
（ 中国科学院大连化学 物理研究所）
６ －４ 反相色谱
反相色谱通常是指以具有非极性表面的担体为 固定相，以比固定相极性更强的溶剂系统为流动相 的色谱分离。一个典型的例子就是在十八烷基硅烷 键合相上用甲醇／ 水混合溶剂冲洗。 “ 反相色谱” 是相对于 “ 正相色谱”而言的，在后一种情况下， 使用极性固定相 （ 如硅胶）和非或弱极性的流动相 （ 如己烷）。这两种操作模式的主要区别可参见表 ６４ －。图６１ －表示了几种不同极性的化合物在正反相 两种操作模式下保留值的变化情况。
表６４ － 正相和反相色谱的区 别
反相色谱是高效液相色谱中应用最广泛的一个 分支，其主要原因是这个操作系统的简单性和灵活 性。无论是大量商品化的烃基键合相，还是某些聚 合物或多孔碳填料，其表面的非极性特征都很强， 至于用作流动相的水和能与水互溶的有机溶剂，从 价格和获取的方便程度上都远较烃类溶剂有利。此 外，由于非极性填料，特别是化学键合固定相上样 品的不可逆吸附和溶剂的记忆效应小，所以更换溶 剂或梯度淋洗非常方便。更为突出的是分析对象多 样化，灵活性大大提高。 事实上，使用非极性固定相和极性流动相的色 谱系统是１４年被Ｂｏｃｔ ９首先提出的，在１５ ９７ ｓｏｔ 〕 ９０ 年Ｈｏ ａｄ ｗ ｒ和Ｍａｔ ０把这种方法命名为“ ｒｉ 〕 ｎ１ 反相色 谱”，并用正辛烷和液体石腊固定相分离 了脂 肪 酸。六十年代末，高效液相色谱问世后，反相液相
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（2）溶剂与试剂预处理
• 硅烷化试剂对水很敏感，使用前应以蒸馏方式 进行纯化或以玻璃棉将其中的悬浮物滤去。所 使用的有机溶剂，必须进行干燥。
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（3）衍生化反应
（1）Si－O－C键型
（2）Si－N或Si－C键型
（3）Si－O－Si－C键型
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1、化学键合相色谱的定义
化 学 键 合 相 色 谱 借助于化学反应的方法将有机分子以 共价键连接在色谱担体上形成化学键 合相，以化学键合相为固定相的色谱 法称为化学键合相色谱（bonded phase chromatography，BPC），简 称键合相色谱。
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2、化学键合相的特点
衍生化反应
端基封尾
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(1)硅胶的预处理
• 在制备键合相时，首先作为担体的硅胶需要酸 处理，洗去制备、运输和保存过程中引入的污 染物；除去表面层的金属氧化物杂质，如Na+、 Ca2+、Al3+、Fe3+等；使表面的硅氧烷键打开， 形成尽可能多的自由羟基，有利于反应。
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1. 与液－液分配色谱相比，使用过程中固定相 不流失，耐溶剂冲洗。 2. 与液－固吸附色谱相比，消除了担体上的表 面活性作用点，清除了某些可能的催化活性。 3. 表面改性灵活，容易获得重复性产品。 4. 化学性能稳定，耐受范围为pH2～8。 5. 热稳定性好，一般在70℃以下稳定。 • 载样量大，比硅胶约高一个数量级。 • 梯度洗脱平衡快。
+ O M Si
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4、化学键合相的分类
• 化学键合相的分类可以有不同的依据。 按键合相的表面结构：单分子键合和聚合键合；
按键合有机硅烷的官能团：极性键合相、非极
性键和相和离子交换键合相三种。
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二、制备与评价
1、化学键合相的制备 2、常见的官能团 3、常用的键合相商品牌号 4、化学键合相性能评价
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3、化学键合相的稳定性
1．在较低pH值条件下（pH<2） 键合相中Si―O―Si键易受Lewis酸等亲电试剂的进攻 而断裂：
Si O Si Si OH +
+ -
Y
Si
Y-H+
2．化学键合固定相在较高pH值条件下的稳定性（pH>9） 键合相中Si―O―Si键很容易被KOH和NaOH这一类强碱 性亲核试剂所切断： Si O Si Si OH + M+OH-
• X 通常为－Cl、－OH、－OCH3、－OC2H5等官能团； • R 通常为直链或支链烷基、芳香基，如－CH3、－C4H9、 －C8H17、－C18H37、苯基等，也可以是它们被不同的基 团取代后的衍生基团，如－(CH2)2CN、－(CH2)2NH2、 －(CH2)n－O－CH2－OH等。 中国药科大学药物色谱分析课程
③ Si－O－Si－C键型
• Si－O－Si－C键型是一类目前占绝对优势的键 合相类型，具有良好的热稳定性及化学稳定性， 能在pH 2～8的介质中使用。这类键合固定相 是硅胶上的硅羟基与有机氯硅烷或有机氧硅烷 试剂反应而得。
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单官能团有机硅烷
R Si OH + R3SiX Si O Si R + HX R
双官能团有机硅烷
• 双官能团化合物如R2SiX2可单独形成线型或环 状有机硅氧烷。
R Si OH + R2SiX2 Si O Si R + HX X
Si OH O Si OH + R2SiX2 Si O O Si O Si R R + 2HX
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三官能团有机硅烷
硅烷化试剂中三个X基团都参与硅醇基反应的 可能性很小。三官能团化合物如RSiX3反应后的 产物可水解进一步形成硅羟基，进而形成三维 交联化合物
1、化学键合相的制备
要形成化学键合固定相，有两个必要条件：
① 所用的担体材料应有某种化学反应活性， 如硅胶、氧化铝、硅藻土等表面都具有化 学反应的官能团，一般以硅胶最为理想的 和常用。
② 有机分子应含有能与担体表面发生反应的 官能团。
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1、化学键合相的制备
硅胶预处理
溶剂与试剂 预处理
最常用的封尾剂有三甲基氯硅烷（TMCS）和六甲基 乙硅氧烷（HMDS）以外，现已研制出三甲基硅咪唑 （TMSI） 中国药科大学药物色谱分析课程
X X
Si OH O Si OH + RSiX3 Si O O Si O Si X R + 2HX
Si OH + RSiX3
Si O Si R
+ HX
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• 硅烷化试剂的反应活性为：
RSiX3＞R2SiX2＞R3SiX。 • Si-O-Si-C：不水解，热稳定性好，在pH 2~8范 围内对水稳定。
基的存在会降低硅胶表面的疏水性，而对极性
化合物或溶剂产生吸附，使键合相的分离性能 改变。
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（4）端基封尾
定 义 • 用氯化三甲基硅烷等试剂与硅胶表面的残留硅 醇基反应，将残留硅醇基封锁起来的
（4）端基封尾
方 法
• 为了进一步消除残留的游离硅醇基，一般在键 合反应后再用封尾剂钝化，也可用十八烷基三 氯硅烷再键合一次。
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聚合层键合相
• 在硅胶表面与硅烷化试剂反应时加入一定量 的水，即形成聚合物，可以制备较致密的键 合层，从而更有效地掩蔽硅胶表面的硅羟基 • 但若反应控制不当，会产生过厚的聚合网， 而引起传质较慢，柱效降低
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（4）端基封尾
原 因
• 残余的硅醇基会对键合相的分离性能产生一定 影响，特别是在非极性键合相的情况下，硅醇
(1)硅胶的预处理
干燥
酸处理
酸处理可以用 0.1 mol/L的盐 酸，于90℃下 浸泡24 h，或 以10%的盐酸 在回流状态处 理8 h 。
中和 中和，水洗至 无Cl- ，经酸处 理后的硅胶表 面的羟基浓度 已达到理论值8 μmol/m2左右 。
在200℃以下真 空烘干除去物 理吸附水，注 意不得超过 200℃，否则硅 醇基脱水形成 硅氧烷结构。