氯喹抑制体外培养星形胶质细胞的激活

2011年10月第31卷第10期基础医学与临床Basic ＆Clinical Medicine October 2011Vol．31No．10收稿日期：2010－08－23修回日期：2011－03－07基金项目：山东省教育厅科技计划资助项目（JO8LG14）*通信作者（corresponding author ）：wsh6108@126．com文章编号：1001-6325（2011）10-1110-05研究论文氯喹抑制体外培养星形胶质细胞的激活荆丽丽，吴淑华*（滨州医学院病理学教研室，山东烟台264003）摘要：目的研究氯喹对体外培养大鼠海马星形胶质细胞激活的抑制作用，为癫痫的治疗提供实验依据。

方法分离新生SD 大鼠海马，体外培养星形胶质细胞，经纯化鉴定后分为：对照组、戊四氮（PTZ ）组、氯喹干预组（25、50和75mg /L ），经相应处理后，分别用MTT 法、免疫荧光、Western blot 测定星形胶质细胞数量及活性、星形胶质纤维酸性蛋白（GFAP ）及CyclinD1的表达量。

结果与对照组比较，PTZ 可激活星形胶质细胞的增殖，使GFAP 、CyclinD1的表达量增加（P ＜0.05）；与PTZ 组比较，氯喹阻滞了PTZ 激活的星形胶质细胞的增殖（P ＜0.05）；氯喹可抑制PTZ 激活星形胶质细胞异常增加的GFAP 的表达；氯喹可抑制PTZ 激活星形胶质细胞的CyclinD1的表达量（P ＜0.05）；与对照组相比，3种结果均显示75mg /L 氯喹对体外培养星形胶质细胞激活的抑制作用较强，并可维持其在正常范围。

结论氯喹具有抑制PTZ 激活体外培养星形胶质细胞的作用，其可能通过抑制星形胶质细胞的增殖来发挥抗癫痫作用。

关键词：星形胶质细胞；癫痫；戊四氮；氯喹中图分类号：R 36文献标志码：AChloroquine inhibits the activation of astrocyte in vitroJING Li-li ，WU Shu-hua *（Dept．of Pathology ，Binzhou Medical College ，Yantai 264003，china ）Abstract ：Objective To investigate the effects of Chliroquine on Pentylenetetrazole （PTZ ）-activated hippocampalastrocytes of rats．Methodseonatal rat （24h ）hippocampal astrocytes were obtained and divided into controlgroup ，PTZ-activated group and Chliroquine groups with Chliroquine treatment at 25，50，75mg /L．The cell pro-liferation ，expression of glial fibrillary acidic protein （GFAP ）and CyclinD1after the treatments were detected with MTT assay ，immunofluorescence cytochemistry and western blot respectively．ResultsN Results In comparisonwith control group ，PTZ could induce the activation of astrocytes and increase the expressions of GFAP and Cy-clinD1（P ＜0.05），In comparison with PTZ-activation group ，Chliroquine treatment resulted in significant inhibi-tion of the cell proliferation ，GFAP and CyclinD1in the PTZ-activated astrocytes （P ＜0.05）．Chliroquine at 75mg /L showed the strongest inhibitory effects against astrocyte activation while maintained nearly normal level of astrocyte activation in comparison with the control group．Conclusions Chliroquine could inhibit PTZ-induced acti-vation of astrocytes ，suggesting that chliroquine may function as potential medicine for epilepsy．Key words ：astrocyte ；epilepsy ；pentylenetetrazole ；chliroquine荆丽丽氯喹抑制体外培养星形胶质细胞的激活癫痫的发病与胶质细胞有关，尤其是星形胶质细胞（astrocyte，Ast）在癫痫的发生中具有重要的作用，表现为细胞数目增多，体积增大、其特异性蛋白胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表达明显增加［1－3］。

激活的胶质细胞可导致神经元的长期机能障碍，从而促使癫痫的发作。

氯喹为一种传统的抗疟疾药。

前期的研究证实［3－5］，氯喹可抑制戊四氮（pentylenetetrazole，PTZ）诱导的大鼠痫样发作，但是目前尚无从细胞水平研究来揭示氯喹的抗癫痫机制。

本实验通过研究氯喹对体外培养大鼠海马星形胶质细胞激活的抑制作用来探讨氯喹可能的抗癫痫机制。

1材料与方法1.1材料1.1.1动物：清洁级24h SD大鼠20只，体质量2 5g，雌雄不限。

［山东烟台绿叶制药有限公司，合格证号：SCXK（鲁）20030008］。

1.1.2试剂：氯喹、戊四氮和hoechest33342（Sigma 公司）；噻唑蓝（MTT）和二甲基亚砜（DMSO）（Am-resco公司）；兔抗-GFAP和兔抗-CyclinD1（Santa Cruz公司）；FITC标记的羊抗兔IgG（H+L）、HRP 标记的羊抗兔IgG（H+L）和羊血清（北京中杉公司）。

1.2方法1.2.1Ast的体外培养与鉴定：断颈处死乳鼠后浸泡于75%乙醇5min消毒。

分离海马，体式显微镜下剥离被膜，剪碎、离心，按106/cm2接种于25cm2细胞培养瓶，于37ħ，5%CO2培养箱中进行培养，待细胞长满瓶底90%左右进行传代，获得的Ast进一步经免疫荧光鉴定，鉴定后分组培养，相应处理［6］。

1.2.2氯喹对PTZ激活体外培养大鼠海马Ast活性的影响：运用MTT比色法检测各组Ast的活细胞数量。

将传代细胞按8ˑ104个/cm2的密度接种于96孔板，每孔100μL。

含10%胎牛血清培养基培养24h后，用5%胎牛血清培养基配制药物干预组：a 为正常组，b为PTZ激活组（10mmol/L），c为PTZ +氯喹低剂量组（10mmol/L和25mg/L），d为PTZ +氯喹中剂量组（10mmol/L和50mg/L），e为PTZ +氯喹高剂量组（10mmol/L和75mg/L）。

每组6个复孔，每孔加入100μL含药培养基继续培养24h 后，弃培养基，D-Hanks洗2遍，加入含MTT20μL 的培养基，37ħ孵育4h，吸净上清液，加入DMSO 150μL，于电动摇床摇动10min左右，待结晶物充分溶解后，于酶标仪上测A值，测定波长492nm，以A 值反映各组Ast活细胞的数量。

1.2.3氯喹对体外培养PTZ激活大鼠海马Ast GFAP表达的影响：运用免疫荧光法检测各组Ast GFAP的表达。

传代细胞进行爬片，37ħ，5%CO2培养箱孵育24h，用5%胎牛血清培养基配制药物，分组。

作用24h后，弃培养基，多聚甲醛固定4h，0.2%曲拉通破膜15min，羊血清37ħ封闭30min，兔抗-GFAP4ħ孵育过夜，FITC标记的羊抗兔IgG （H+L）37ħ孵育30min，hoechest33342染核10min （避光）。

以上各步骤之间用0.01mol/L PBS充分洗涤。

甘油封片，荧光倒置显微镜观察照相。

于病理图像分析系统分析吸光度值，以积分吸光度值（IA）反映各组细胞的情况。

1.2.4氯喹对体外培养PTZ激活大鼠海马AstCy-clinD1表达的影响：运用Western blot法检测各组AstCyclinD1的表达量。

将传代细胞以5ˑ105个/cm2的密度种植于24孔板中，含10%胎牛血清培养基培养24h后，用5%胎牛血清培养基配制药物，分组。

作用24h后，弃去含药培养基，以预冷PBS清洗，加入细胞裂解液（含PMSF）于冰上裂解，30min后将裂解液吸出装入EP管，以4ħ、12000r/min离心5min，将上清吸出，分装于EP管内，－20ħ保存。

用BCA法绘制标准蛋白曲线，求出各样品蛋白浓度，确定含20μg蛋白的上样体积。

将变性后的样品上样，并加入预染Marker，确定所需蛋白CyclinD1及内参β-actin的条带位置。

电泳（浓缩胶80V，分离胶110V），电泳完毕后根据预染Marker提示的位置将2条蛋白带分别切下，湿转转印槽转膜（100V，70min），37ħ封闭2h，然后分别加入兔抗CyclinD1及β-actin4ħ孵育过夜，二抗37ħ孵育1h，ECL曝光，分别分析吸光度值。

以CyclinD1及β-actin吸光度值之比来比较CyclinD1蛋白表达量。

1.3统计学分析计量数据以均数ʃ标准差（x—ʃs）表示，应用SPSS13.0统计软件进行处理，多组计量资料组间差异比较采用单因素方差分析，组间比较用LSD法。

1111基础医学与临床Basic ＆Clinical Medicine2011.31（10）2结果2.1Ast 的培养及鉴定原代培养的大鼠海马Ast ，倒置显微镜下可见细胞生长较好，贴壁良好，胞突明显，细胞向外伸出长短不一的突起，胞质丰富，其中可见清晰的卵圆形细胞核。

原代培养的细胞经免疫荧光鉴定，GFAP 免疫反应阳性率达90%以上（图1）。

图1GFAP 免疫荧光染色激光共聚焦图片Fig 1GFAP immunofluorescence staining cell pictureby confocal microscope （bar =10μm ）2.2氯喹对PTZ 激活体外培养大鼠海马Ast 活性的影响PTZ 可以显著激活体外培养的Ast ，氯喹对PTZ激活的细胞活性具有显著的抑制作用，以75mg /L 浓度的氯喹抑制效果最好（表1）。