(仅供参考)治疗用单克隆抗体质量控制 讲义

治疗性抗体发展史
第三代抗体药物：基因工程抗体 为克服鼠源性单克隆抗体的异源性反应，在20世纪80年代，研究者探索以
基因工程方法改造鼠源性单克隆抗体，包括：人鼠嵌合抗体、人源化抗体、 全人源抗体、重组抗体片段。 基因工程抗体优点： 1基因工程改造后的抗体鼠源性下降，可以降低甚至消除人体对抗体的排 斥反应； 2 可以根据治疗的需要，设计制备各种新型抗体； 3 基因工程抗体片段的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性； 4 小分子抗体片段容易穿透血管壁，进入病灶的核心部位； 5 抗体片段能够在原核细胞中大量表达，可以大大降低生产的成本。
抗体药物的质量控制
1.3 C-末端氨基酸序列测定： C-末端测序不像N-末端测序那样有常规通用的方法，目前主
要有以下几种方法。一是用酶法或化学法将C-末端肽段切下来并 收集，然后用N-末端测序方法进行测定。二是采用串联质谱法分 析C-末端氨基酸序列。三是羧肽酶酶解分子量梯度法测定。
1.4 液质肽图： 液质肽图是将抗体用蛋白酶酶解成肽段后，进样高效液相色
治疗性抗体发展史
各种不同类型的治疗性抗体
1 单克隆抗体 完整抗体 双特异性抗体 酶降解抗体片段 基因工程抗体片段
2 抗体偶联物 放射性免疫偶联物 化学免疫偶联物 免疫毒素
3 抗体融合蛋白 多肽类融合蛋白 毒素片段融合蛋白 细胞因子融合蛋白
鼠源性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体 靶向两种不同抗原的抗体 F(ab‘)2、Fab‘、Fab片段等 单链抗体、双链抗体、三链抗体、微型抗体、轻链可变区和重链可变区等
《中华人民共和国药典》2015年版三部： 生物制品生产用原材料及辅料质量控制规程 生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程 人用重组DNA蛋白制品总论 人用重组单克隆抗体制品总论
国家食品药品监督管理总局 药品审评中心： 1 人用重组DNA制品质量控制技术指导原则 2003年3月 2 人用重组单克隆抗体质量控制技术指导原则 2003年3月 3 生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般 原则 2005年12月 4 生物制品质量控制分析方法验证技术一般原则 2005年12月 5 重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制技术评价一般原则 2006年10月 6 治疗用生物制品非临床安全性评价指导原则 2007年1月 7 生物类似药研发与评价技术指导原则（试行）2015年2月 8 生物制品稳定性研究技术指导原则（试行） 2015年4月 9 生物制品上市后变更研究的技术指导原则（征求意见稿）2017年8月
抗体药物的质量控制
1.5 二硫键配对方式验证： 二硫键是蛋白中经常出现的一种共价 键，在IgG1型抗体中共有16条二硫键。 二硫键的正确形成对抗体的结构和功 能至关重要。 验证二硫键配对方式可应用液质肽图 法，不对抗体进行还原，直接进行蛋 白酶酶切，酶切后有些肽段仍通过二 硫键连接在一起，通过对这些肽段进 行质谱鉴定即可验证二硫键配对方式。 有时由于抗体结构比较紧密，蛋白酶 不能将其完全酶解，此时可更换另一 某单抗二硫键配对方式示意图 种酶进行酶切，结合两次酶切结果对 二硫键配对方式进行验证。
抗体及其结构
典型的免疫球蛋白分子基本结构呈“Y” 字形，由两条相同的重链和两条相同的轻 链借二硫键连接而成。
重链和轻链近氨基端的1/4或1/2氨基酸序 列的变化很大，为可变区；其他氨基酸序 列则相对恒定，为恒定区；位于CH1和 CH2之间、富含脯氨酸的区域为铰链区。 VH和VL分别代表重链和轻链的可变区， CH和CL分别代表重链和轻链的恒定区。
VH和VL的各3个CDR共同 组成Ig的抗原结合部位， 并决定抗体识别抗原的特 异性。
CDR: complementarity determining region.
FR: framework region.
抗体及其结构
木瓜蛋白酶作用于铰链区二硫 键所连接的两条重链近N端，将 IgG裂解为两个完全相同的Fab 段和一个Fc段。
抗体药物的质量控制
2.3 糖基化位点测定： 糖基化位点即糖链与蛋白连接的部位。抗体的糖链主要有 N-糖与O-糖两种。N糖一般由6到数十个单糖连接而成，位 于糖链还原端的N-乙酰葡糖胺与抗体中的天冬酰胺的酰胺 氮以β1,4-糖苷键相连。O-糖与蛋白中丝氨酸或苏氨酸的羟 基相连。 糖基化位点可通过液质肽图的方法测定，用酶法或化学 法切除抗体的糖链，分别测定切除糖链前、后抗体的液质 肽图，对图谱中的差异肽段进行分析，即可确定抗体的糖 基化位点。 2.4 糖链结构测定：糖链的结构主要包括各单糖之间的连 接顺序和连接方式。在对糖链结构进行测定时，可通过测 定糖链的分子量，结合文献报道，对糖链结构做出大致的 判断；再进一步通过其他方法，如糖苷酶顺次酶解法或串 联质谱法，作进一步的验证。
4 应对标准物质进行稳定性考察，以确定标准物质 在特定条件下保持正常结构及适宜效价的时间。
抗体药物的质量控制
理化对照品的结构验证： 重组抗体药物空间结构复杂，正确的结构是其生物
学活性的前提和基础，因此要对抗体的结构进行验 证。 在抗体药物的常规质控中，对每批产品均进行全面 的结构分析，不仅成本昂贵，而且工作量巨大，难 以完成。 在这种情况下，理化对照品显得尤为必要，只需对 对照品进行充分的结构分析，证明其结构正确；同 时在常规质控中将待测产品与之同时测定，如果结 果一致，可基本说明待测样品结构正确。
免疫球蛋白的分类：根据免疫球蛋白重链 C区的氨基酸组成和抗原特异性不同，将 免疫球蛋白分为IgG 、IgA、IgM、IgD、 IgE五类。
IgG中，根据其重链抗原性和二硫键的数 目和位置的不同，又可分为IgG1~ IgG4四 个亚类。
抗体及其结构
在重链和轻链的V区中， 各有3个区域的氨基酸组 成和排列顺序高度变化， 称为高可变区或互补决定 区（CDR）。V区中CDR以 外区域的氨基酸组成和排 列顺序相对不变，称为骨 架区（FR）。
尔斯坦Cesar Milstein成功地将小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞进行了融合， 融合后的杂交瘤细胞不仅具备了瘤细胞的无限增殖能力，还具备了B淋巴 细胞分泌特异性抗体的能力。 1986年，第一个由杂交瘤细胞表达的治疗型单克隆抗体-抗CD3单抗莫 罗莫 那在美国成功上市，标志着治疗性抗体药物发展时代的来临。 该类抗体特点：均为鼠源性抗体，在人体内反复应用之后会引起人抗鼠抗 体（human anti-mouse antibody, HAMA）反应，从而降低疗效，甚至可以 引起过敏反应。因此，人抗鼠的抗体反应是20世纪80年代抗体药物在临床 上没有取得成功的主要原因之一。
抗体药物的质量控制
理化对照品的结构分析包括以下内容： 1 一级结构验证 1.1 质谱分子量测定：可以直接测定完整抗体的分子量，
也可以用糖苷酶将糖基切除后再测定抗体蛋白部分的分子 量，还可以用还原剂将抗体的二硫键打开，分别测定轻、 重链的分子量。测得抗体的分子量后，将其与理论分子量 进行比较，以初步判断蛋白的氨基酸序列是否正确。
抗体药物的质量控制
2 糖链分析 糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰。抗体类型不同，其糖 基化程度及糖链位置也不尽相同。糖链在维持抗体的正常结构以 及抗体与其他蛋白的相互作用中发挥着重要作用。糖链分析内容 主要有以下几个方面：
2.1 单糖组成分析：单糖组成分析是指糖链由哪几种单糖组成及各 单糖所占比例。通过酸水解或碱水解释放出抗体中的所有单糖， 根据后续检测方法的不同，对单糖混合物进行不同的处理，用单 糖标准品记性定性，分析测定单糖组成。
抗体药物的质量控制
质控标准物质： 标准物质和检测方法是抗体药物质量控制的两个重要支
撑点。 生物制品标准物质：指用于生物制品效价、活性、含量
测定或特性鉴别、检查的生物标准品和生物参考品。 质控标准物质主要有两种：理化对照品及活性标准品。
理化对照品用于抗体的理化性质分析，如相对分子质量、 等电点、肽图等；活性标准品用于抗体活性的测定。 药典《人用重组单克隆抗体制品总论》对参比品的要求： 选择已证明是足够稳定且适合临床试验的一个（多个） 批次，或用一个代表批次作为参比品，用于鉴别、理化 和生物学活性等各种分析，并应按特性分析要求进行全 面分析鉴定。
Fab段即抗原结合片段；Fc片段 即可结晶片段，相当于IgG的 CH2和CH3功能区。
Fab：fragment antigen binding Fc: fragment crystallizable
免疫球蛋白的水解片段示意图
治疗性抗体发展史
第一代抗体药物：来源于动物的多价抗血清 早年制备抗体的方法是以相应抗原免疫动物，获得抗血清。 抗原通常含有不同的表位，加之所获得的抗血清也未经免疫纯
抗体与同位素偶联 抗体与药物偶联 抗体与植物或细菌毒素偶联
抗体片段与多肽类药物的融合 抗体片段与毒素片段的融合 抗体片段与细胞因子的融合
抗体药物的质量控制
抗体药物的质量控制主要包括3个方面的内容：生产 细胞、生产过程及产品的质量控制。
生产细胞质量控制应满足药典生物制品通则《生物 制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程》的 要求。
化，因而此类抗血清实际上是多种抗体的混合物，属于多克隆 抗体。 该类药物特点：具有一定疗效，但异源性蛋白质能引起较强的 人体免疫反应，该副作用限制了这类药物的应用。
治疗性抗体发展史
第二代抗体药物：利用杂交瘤技术生产的单克隆抗体 1975年，英国剑桥大学的科学家乔治斯.科勒Georges .J.F.Kolhler和赛瑟.米
谱仪，一般用反相色谱柱进行梯度洗脱，肽段按疏水性由弱至强 的顺序依次流出，柱后连接质谱仪和紫外检测器，测定肽段的质 谱信号和紫外吸收信号，得到相对应的两张肽图，通过质谱测定 结果对各肽段进行定性，所得图谱成为液质肽图。如果所得肽段 的实测分子量与理论值一致，可以认为肽段的氨基酸序列与理论 一致。为了对肽段的氨基酸序列做更加严谨的验证，可以进行串 联质谱分析。借助数据分析软件，串联质谱可直接用于测定肽段 的氨基酸序列。
1.2 N-末端氨基酸序列测定：测定的目的是确认抗体的N末端氨基酸序列与理论序列是否一致，一般对N-末端15个氨 基酸进行分析。分析方法以Edman降解法最为常用。测序 过程有两点需要注意，一是，应首先用还原剂将轻重链打 开，再选择合适的方法将轻、重链分离，分别测序。二是， 抗体的N-末端常常存在封闭，此时不能直接用Edman降解法 进行测序，需要用相应的方法对抗体样品进行去封闭处理。
2.2 寡糖层析图：用于分析测定抗体中寡糖链的组成情况，即抗体 分子中不同形式的寡糖链所占比例如何。用糖苷酶将抗体上的糖 链切下，对其进行衍生并纯化，将纯化后的寡糖进行液相色谱或 毛细管电泳分析以确定各自的比例。通过液相色谱法不能对各种 寡糖形式进行定性，需要参照寡糖参考品对其定性，或收集后经 过其他方法测定。
生产过程应遵循药典、GMP及其附录《生物制品》 的要求。目前，单抗药物多通过重组技术由哺乳动 物细胞表达生产，完整的生产过程包括生产细胞系 的构建及传代扩增、细胞培养及抗体的纯化、抗体 产品分装保存等。
本文主要介绍质控标准物质、产品的质量控制。
抗体药物的质量控制
抗体药物质量控制遵循的主要法规与指导原则：
治疗用单克隆抗体质量控制
tzwintersweet@126.com
2017.11
目录
抗体及其结构 治疗性抗体发展史 抗体药物的质量控制
抗体药物质量控制遵循的主要法规与指导原则 质控标准物质 产品的质量控制
抗体及其结构
免疫球蛋白 （immunoglobulin, Ig） 即抗体（antibody， Ab），是由B细胞 被 B细胞抗原表位பைடு நூலகம்特异 性刺激后增殖分化为 浆细胞所产生的效应 免疫因子，介导体液 免疫。
抗体药物的质量控制
标准物质的制备要点： 1 原材料的均一性和稳定性是重要条件。 2 原材料配方的选择应遵循与供试品相同的原则。 3 原材料的质量标准应不低于产品，应对原材料进 行全面的检定。 理化对照品用于产品理化性质的全面评价，应进
行尽量全面的理化性质分析，包括对蛋白的结构及翻 译后修饰进行验证。活性标准品则通过协作标定进行 赋值。
治疗性抗体发展史
抗体偶联物、抗体融合蛋白 抗体偶联物：为提高抗体药物特别是抗肿瘤抗体药
物的药效，加强其对癌细胞的杀伤作用，人们用效 应分子药物通过化学方法与抗体连接，制成抗体偶 联物。免疫偶联物用抗体作为导向载体，用效应分 子杀伤肿瘤靶细胞。效应分子主要有3类：放射性核 素、毒素和药物。 抗体融合蛋白：利用基因工程方法可以制成融合蛋 白，融合蛋白是由抗体片段（大多为单链抗体）与 具有生物活性的“弹头”部分（主要为毒素片段、 细胞因子或多肽等）融合而成。