利用低氧／厌氧工作站建立H9c2细胞缺氧复氧模型的探讨

利用低氧／厌氧工作站建立H9c2细胞缺氧复氧模型的探讨储倩雯;李伟秋;鲁诗史;黄丹梅;张艳美【摘要】目的：利用低氧／厌氧工作站，结合不同的缺氧条件，探讨建立H9c2细胞缺氧复氧（hypoxia／reoxygenation， H／R）模型的最佳方法。

方法缺氧时将H9c2细胞置于低氧／厌氧工作站中，分别以完全培养基，无糖培养基和酸性缺氧液培养1、2、4、6、8 h，缺氧后换用完全培养基于培养箱中按常规条件培养1 h。

流式细胞仪测定细胞内活性氧（ reactive oxygen species ，ROS）含量，噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测细胞生存率，倒置显微镜下观察H9c2细胞形态变化。

结果与对照组比较，缺氧时以完全培养基和无糖培养基处理的H9c2细胞H／R后，细胞内ROS含量和细胞存活率随缺氧时间延长无明显改变，且倒置显微镜下未观察到明显的形态变化。

缺氧时以酸性缺氧液处理的H9c2细胞，随H／R时程的延长，细胞内ROS含量不断增加（P＜0.01），且细胞存活率逐渐降低（P＜0.01），倒置显微镜下观察到细胞H砄1 h／R：1 h后开始出现部分细胞皱缩，少量坏死细胞漂浮，随时间延长损伤加重；缺氧8h后，细胞皱缩成圆形，大量坏死细胞漂浮，复氧1h后可见细胞膜表面不平滑，复氧液中仍有少量坏死细胞漂浮。

结论采用低氧／厌氧工作站，并结合酸性缺氧液，可成功建立重现性非常好的H9 c2细胞H／R模型。

%Objective To investigate optimal method of establishing hypoxia/reoxygenation(H/R) model ofH9c2 cell by using hypoxia/anoxic workstation under different conditionsin hypoxia.Methods H9c2 cell was placed into hypoxia/anoxic workstation and simultaneously cultured with complete medium, glucose-free DMEM and acidic hypoxic solution for 1,2,4,6 and 8 h respectively, and then reoxygenated with complete medium for 1 h in normoxic incubator.Thelevel of ROS was measured by flow cytometry.The cell viability was detected by MTT assay.The cellular morphology was observed by inverted microscope.Results With the extension of cell hypoxia time, there were no significant differences in the ROS level and cell viability in complete medium-and glucose-free DMEM-treated H/R groups compared with control group(P<0.05).There was no obvious morphologic change observed with inverted microscope, either.Nevertheless, when H9c2 cells were treated with acidic hypoxic solution in hypoxia, the ROS level continuously increased and the cell viability decreased with the extension of cell hypoxia time ( P<0.01 ).Since H:1 h/R:1 h, some of the cells shrunk and a few necrotic cells floated in the media under the inverted microscope , and the damage was aggravated with the extension of hypoxia time.After the cells were exposed in hypoxia for 8 h, they wrinkled to be round and a large number of floating necrotic cells were observed.When the cells were reoxygenated for 1 h, the cytomembrane was not smooth and there were still a few necrotic cells floating in culture dish .Conclusion The H9c2 cell H/R model with good repeatability can be established successfully by using hypoxia/anoxic workstation combining with acidic hypoxic solution.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2015(000)011【总页数】4页(P11-14)【关键词】低氧/厌氧工作站;H9 c2细胞;缺氧复氧模型【作者】储倩雯;李伟秋;鲁诗史;黄丹梅;张艳美【作者单位】汕头大学医学院药理教研室，广东汕头 515041;汕头大学医学院分析细胞实验室，广东汕头 515041;汕头大学医学院第一附属医院药剂科，广东汕头 515041;汕头大学医学院药理教研室，广东汕头 515041;汕头大学医学院药理教研室，广东汕头 515041【正文语种】中文【中图分类】R363心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion， I/R)损伤是心脏缺血性疾病和心脏外科手术后常见的一种病理生理现象。

体外心肌细胞缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation， H/R)模型一直被广泛应用于心脏I/R损伤的研究，对于探讨I/R损伤的分子机制具有重要的意义。

但国内外建立的H/R细胞模型没有统一的标准，目前常用的方法主要有：混合气体培养法、模拟缺氧/再灌注液培养法、氮气饱和培养基法、液体石蜡覆盖法等单纯物理性模型[1]。

而化学模型建立方法主要是利用氧清除剂二亚硫酸钠和氯化钴[2-3]。

这些方法都存在一些缺点，如操作复杂，无法准确地控制缺氧过程的氧分压，缺氧条件的重复性差等。

探寻一个稳定，可靠，便于操作的H/R损伤的细胞模型，将为研究心脏I/R损伤提供一个可靠的平台。

来源于大鼠胚胎期心室的H9c2细胞株被用于本实验中，该细胞株保持着心肌细胞的多种特性，被广泛应用于心脏疾病的体外研究中。

本研究利用新购置的低氧/厌氧工作站，结合不同的缺氧培养条件，以心肌I/R最重要的病理生理改变之一—活性氧(reactive oxygen species，ROS)[4]作为评判模型成功与否的标准，探讨建立H9c2细胞H/R模型的最佳方法。

1.1 试剂与仪器H9c2细胞(ATCC公司，美国)、胎牛血清(Biowest公司，法国)、DMEM培养基(Gibco公司，美国)，2′，7′-二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH-DA)(Sigma公司，美国)，噻唑蓝(MTT)(Amersco公司，美国)。

其余试剂均为国产分析纯。

低氧/厌氧工作站Invivo2 400(Ruskinn公司，英国)，CO2培养箱(Sanyo公司，日本)，倒置相差显微镜(Nilkon公司，日本)，Accuri C6流式细胞仪(Becton Dickinson公司，美国)，全波长酶标仪(Molecular Devices公司，美国)，低温高速离心机(Heraeus公司，德国)。

1.2 方法1.2.1 H9c2细胞培养：将H9c2细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养基的培养皿中(同时含有100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素)，置于37 ℃，5% CO2恒温培养箱中培养，1～2天换液。

当细胞长至80%～90%时消化传代。

1.2.2 实验分组及H/R模型建立：将H9c2细胞随机分为对照组、完全培养基处理H/R模型组、无糖培养基处理H/R模型组以及酸性缺氧液处理H/R模型组，除对照组外，各不同缺氧液处理的H/R模型组分别设定5个H/R时程(H:1 h/R:1 h，H:2 h/R:1 h，H:4 h/R:1 h，H:6 h/R:1 h，H:8 h/R:1 h)。

缺氧时各H/R组分别换用完全培养基、无糖培养基和酸性缺氧液，置于低氧/厌氧工作站中(1%O2，5%CO2，94%N2，37 ℃)，缺氧结束后均换用完全培养基置于培养箱中复氧培养1 h。

对照组则于复氧前换用完全培养基培养1 h。

实验过程中使用的酸性缺氧液配方为NaCl：8.0064 g，KCl：0.8946 g，MgCl2：0.0467 g，CaCl2：0.0999 g，HEPES：0.953 g，Na lactate：3.735 mL，加水至1000 mL，调节pH至6.2[5]。

在超净台内用0.22 μm微孔滤膜过滤。

1.2.3 MTT法检测细胞存活率：将H9c2细胞按1×104个/孔的密度接种于96板中，8孔/组，取平均值作为一次实验结果。

培养24 h后，按上述实验分组及模型建立方法处理细胞。

待复氧结束后，吸干培养基，每孔加入200 μL含10%MTT(5 mg/mL)的无血清DMEM培养基，置于37 ℃，5%CO2的培养箱中避光孵育4 h。

吸干培养基，每孔加入200 μL的DMSO，震摇15 min，使结晶充分溶解，酶标仪于490 nm波长处检测各组吸光度值。

实验重复4次。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞内ROS浓度：将H9c2细胞接种于6 cm培养皿中，待细胞长至70%～80%时，按上述实验分组及模型建立方法处理细胞。

复氧结束后，倒掉培养基，用PBS洗2次，每皿加0.125%胰酶消化1 min，弃胰酶，各加1 mL含血清DMEM中止消化，收集细胞于1.5 mL 离心管中；离心，弃上清，用无血清DMEM清洗一次，各加入1 mL含10 μM DCFH-DA荧光探针的无血清DMEM培养基。