免疫细胞的分离和保存技术

免痰细舱的分窝和保存技术

用体外方出对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定.计数和功能测定，是观疼机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏彖中分富岀来。参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨嗤细胞、中性粒细胞等。由于检测的目的和方法有同，分富细胞的需求和枝术也异。有的仅需分富勺细胞，有的则需分富单个核细胞（mononuclearcellj ,其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte；,有的则需分富T细胞和B细胞以及其亚群。分富细胞选用的方岀应力求简便可行，并能荻得壽纯度、爲获得率、爲焙力的细胞。现用分富细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉吟率、粘附和乐啜能力加以组分，另一则按照各类细胞的裹面标志，包括细胞在面的抗原和受体加以选择性分富。

**»自鈿施的分离

（-）血液中红细胞与勺细胞比例约600-1000:1,两者的比重不同其沉I障速度亦异，通常用两种方法加以分富。

本法是利用血细胞勺然汎吟率的分富法，采集血液后应及肘抗凝，通常逸用肝素抗疑比。肝素能阻止凝血舔原转化为我血酶，从而抑制纤维蛋勺原形成纤维蛋自而防止血液凝.固。標作原则是将舍抗我血的汎管直立挣置•室温30〜60min 后，血液分成朗显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的庆自层为自细胞，轻轻吸取印得富舍自细胞的细胞群，富心洗涤后加入少量蒸镭水或舍氣化銭的Gey溶液，经短肘间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗:条可得纯度较壽的自细胞悬液。

（二丿聚合杨加速況淀法

本法是利用爲分子量的聚合场如朗腔、右炎髓肝、聚乙烯犹喀烷酌（polyvinylpyrolidone, PVP丿等使红细胞凝集成串，加速红细胞渝吟,使之与自细胞分富。本比的细胞荻得率比勺然沉吟比需。

二、卄用血单个核細胞的分禽

外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和潘度与其他细胞不同，红细胞和多核自细胞宏度较丸，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞酒度为1.075〜1.090,血小扱为1.030〜1.035。为此利用一种密度介于1.075〜1.092之间而近于等渗的溶液（分层液丿做潘度樟度富心，使一定宏度的

细胞按柑应密度様度分布，从而将各种血细胞加以分富。常用的分层液有Ficoll 和Percoll两种。

(-)Ficoll分层液法

主要用于分富外周血中的单个核细胞，是一种单次矗度样度离心分禽出。聚羔無-泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的艺槍聚合场称聚羔髓(商老名为Ficoll；,分子量为40kD,具有壽宏度、低渗透庄.无寿性的特点。需浓度的Ficoll滋液粘性爲，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低浓度溶液，宏度为1.020,海加比重为1.200的泛影葡胺CurografinJ以增加密度。国外常用商品Isopaque Hypaque,故又称Ficoll-Hypaque分层液，将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合适.分层液。分富人外周淋巴细胞以宏度为1.077±0.001的分层液最佳，因为人的红细胞瀝度为1.093, 粒细胞宏度为1.092,单个核细胞淮.1.076〜1.090之间。而不同动杨血中的单个核细胞对分富液的宏度要求各不相同，如小亂为1.088,马为1.090。分富肘先将分层液置洪•管底层，然后将肝素化全血以Hanks液戎PBS液作适古稀释后，轻轻奁加在分层液上面，使两者形成一个请晰的界面。水平式富心后，富心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带(图20-1J o

•—稀释的血浆

—单个核细胞

粒细胞

红细胞

红细胞和粒细胞忿度丸于分层液，同肘因红细胞遏列Ficoll而凝集成串钱状而汎积于管底。血小扱则因酒度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液潘度相当的单个核细胞密集＞4血象层和分层液的界面中，呈勺勝状，浹取该层细胞递.经冼涤壽

心重悬。本比分富单个核细胞纯度可达95%,淋巴细胞约占90%〜95%,细胞荻得率可达

80%以上，其壽低与宝温有关，超过25°C对会影响细胞获得率。

(二丿Percoll分层液法

这是一种连续酒度梯度富心'分富法。Percoll是一种经聚乙締今匕唸•烧g(PVP) 处理的睚胶颗粒，对细胞无寿性。利用Percoll液经壽速富心后形成一个连续潘度样度的原理，将宏度不等的细胞分富纯化。用Percoll原液(•矗度1.135)与约等量玖富子强度的璘酸缓冲液均匀混合，需速富心后，使分层液形成一个从•管底到液面宏度逐漸雄减的连续潘度样度，再将己制备的单个核细胞悬液轻轻总加A液面上，低速富心后，便得四个细胞层。在层％死细胞戎片和血小板，底层为惹细胞和红细胞，中间有两层，上层富含单个核细胞(75%),下层當含淋巴细胞(98%)(图-2)。该法是纯化单核细胞和淋巴细胞的一各轶好的方法，但操作流程较长，手续较多。

干死细胞组分

J富含单核细胞的爼分

J富含淋巴细胞的组分

〜红细施七粒细胞组分

图・2连续淞度梯度富心出分富单个核细胞中各细胞成分的分布示恋图

三、淋巴鈿也及其亚算的分嵩

为研死免疫细胞的功能，常需爲純度的淋巴细胞龙其亚群，分富方比介绍如下。

(-)、纯淋巴细胞群的采集

通常利用单核细胞柱37°C和Ca2+存在条件下，能主动粘附征玻病、塑抖、尼龙毛、郴抡纤维或葡聚紡我胶的特性，据此建立许多从单个核细胞悬液中去除单核细胞的沁、菇以荻得需纯度的淋巴细胞群。

将■已制备的单个核细胞悬液倾于玻癘或埜料平皿或為平小瓶中，移至37°C 温俞挣置1h 左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非粘附细胞儿乎为纯淋巴细胞，继用橡

皮利下贴壁的细胞即为純单核细胞群。因B细胞也有贴壁现象，用本出分富的淋巴细胞群中B 细胞有所喷失。

(2)吸附柱过诲、法

将单个核细胞悬液注入装有玻癘纤维或葡聚紡;疑胶SephadexGlO的柱层中，凡有粘附能力的细胞绝大部分彼吸附而粘滯在柱层中，从柱上冼脱下来的细胞主要是淋巴细胞。此出简单易行，对细胞奴少槓害。

(3)琲铁吸引法

利用单核细胞具有呑嗤的特性，往单个核细胞悬液中加直径为3pm的琰基铁颗粒，置37°C温编短肘淡转播动，待单核细胞充分呑噬験基铁颗粒后，用该铁将细胞双至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞。

(二丿,淋巴细胞亚群的分富

分离相当纯化的淋巴细胞亚群是细胞免疫檢酸的基本枝术。其原则是根据和应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。凡根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方岀是阳性选择去；而逸挣性去除不要的细胞，仅紆下所需的细胞是为阴性选择。常用以下儿种方岀：(V E花环淤吟法

本去是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继用淋巴细胞分层液分富细胞。浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富含B细胞，而沉障点管底的形成E抡环的细胞用低渗比处理，使國统细胞周国的绵羊红细胞快速裂鮮，则荻得纯的T细胞。

(2)尼龙毛分禽法

本岀利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维哀面的特性，可将T和B细胞分开。棵作原则是取松散而经过处理的尼龙毛(聚犹胺纤维丿，均匀充填 A.径5〜6nm的聚乙晞塑料•管(饮料管即可丿，经Hanks液没透保温，将单个核细胞悬液加入柱，放37温俞筛置1〜2h。用预温的含10%〜20%小牛血请培养液谨洗，洗脱液舍有非粘附的T细胞，重复灌洗几次以除去管戎闺的T细胞。再用冷或温培养液边冲边洗边痹庄塑抖管，此肘冼脱液富舍B细胞。如此得到的T细胞钝度花90%以上，B细胞纯度可达80%。

(3)亲和扱结合分富法

利用亲和层析冻分富淋巴细胞亚群，其原理是各种沐巴细胞亚群具有不同的抗原性，将

相应抗体结合于塑料平妆上，继加细胞悬液，凡抗原阳性的细胞则与和应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取（图-3） o同样若用特异性抗療交联A塑料板上，則可

分禽得具有特异抗療受体的淋巴细胞。淋巴细胞受体与特异抗原或抗体接紘，可引起细胞激焙，因此，凡欲去除细胞悬液芷一细胞亚群肘，本法灵适用。如要分富CD4+龙CD8+细