免疫细胞的分离和保存技术
免疫细胞的分离和保存技术
第二节 淋巴细胞及其亚群的分离 1、纯淋巴细胞群的采集
原理：利用单核细胞在37℃和Ca 离子存在条件下，能主动粘附在玻璃、 塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝 胶的特性，据此建立许多从单个核细 胞中除去单核细胞的方法，以获得高 纯度的淋巴细胞群。
(1)粘附贴壁法 因B细胞也有贴壁现象，因此，本 法分离的淋巴细胞群中B细胞有所 损失。
第 免疫细胞的分 二 离和保存技术
十
章
何
印
蕾
概述
临床上的各种类型的免疫缺陷、自身
免疫病以及肿瘤等疾病均可出现淋巴细胞 或淋巴亚群的数量和功能的变化。因此用 体外方法对机体具有免疫反应的外周血淋 巴细胞及其亚群的数目或比例以及它们所 显示的功能的强弱进行检测，是判断机体 细胞免疫水平的一种重要手段。这对于临 床认识疾病、探讨其发病机制、观察病情 变化、判断预后、考核疗效和防治疾病等 方面均有重要意义。
淋 T细胞：CD2、CD3、CD4、CD8、 巴 CD25等 细 胞
B细胞：CD19、CD20、CD21、 CD22、CD29等
(1)E花环沉淀法 方法：淋巴细胞+SRBC悬液→加 入分层液→T细胞形成E花环而沉 于管底→悬液中为B细胞。 （2）尼龙毛分离法 方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤 维管→洗脱下来的是T细胞
胞，是一种单次密度梯度离心分离法。 其主要成分为聚蔗糖(商品名为Ficoll ) 其密度为1.020。可将血液分成四层， 从上到下依次是：血浆、单个核细胞、 粒细胞和红细胞。
2、Percoll分层液 是一种连续密度梯度离心分离法， 其主要成分为：硅胶颗粒，其原液 密度为：1.135。可将血液分成四层， 从上到下依次是：死亡细胞和血小 板、单核细胞、淋巴细胞、粒细胞 和红细胞。
分离小鼠骨髓中的免疫细胞的方法
分离小鼠骨髓中的免疫细胞的方法骨髓是一种重要的免疫器官，它主要负责成熟和存储多种不同类型的免疫细胞，如粒细胞、淋巴细胞和单核细胞等。
因此，分离小鼠骨髓中的免疫细胞对于研究免疫系统的功能和生理学意义具有重要意义。
本文将介绍一种常用的分离小鼠骨髓中免疫细胞的方法。
一、实验材料准备1.小鼠骨髓2.磷酸盐缓冲盐水（PBS）3.甘露糖4. L-精氨酸血红蛋白（LymphoprepTM）离心管二、小鼠骨髓分离1.从小鼠胫骨和股骨中分离骨髓。
用PBS冲洗骨髓，使之保持湿润。
2.将骨髓加入含有10%甘露糖的PBS中，制成单细胞悬浮液。
3.将单细胞悬浮液缓慢地加入L-精氨酸血红蛋白离心管中。
4.用Lymphoprep离心管离心，离心条件为800 g，20分钟，室温。
三、免疫细胞的分离1.离心完成后，可以看到在离心管中分层形成了三明显的界面。
上层是血浆，中层是淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，下层是红细胞。
2.使用移液管沿着离心管壁缓慢吸取中层的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，并将其转移至新的离心管中。
3.加入PBS冲洗淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，使之保持湿润。
4.用PBS洗涤细胞三次，以去除离心试剂和其他污染物。
5.将细胞转移到培养皿中，并采用适当的培养基进行培养和分离。
四、实验注意事项1.在进行分离实验时，应尽量避免产生气泡，以免对细胞的分离和纯度产生影响。
2.离心时，离心管应该尽量垂直摆放，避免出现倾斜，以免影响细胞的分层。
3.分层完成后，移液管在取出上层血浆时，应尽量避开中层的细胞，以免受到污染。
五、实验结果通过上述方法分离得到的小鼠骨髓中的免疫细胞，其纯度高，可以用于继续进行免疫学、细胞生物学方面的实验研究。
六、结论分离小鼠骨髓中的免疫细胞是一个重要的实验技术，可以为后续的免疫学研究提供重要的细胞材料。
在实际操作中，需要严格控制每一个步骤，以确保分离得到的免疫细胞的纯度和活力。
同时，也需要注意安全操作，避免对实验材料和人员产生伤害。
免疫学研究中的免疫细胞分离和纯化技术
免疫学研究中的免疫细胞分离和纯化技术免疫学研究是现代生物医学领域的一个重要分支，它研究的是人类和动物身体对各种病原微生物、异物和肿瘤细胞的防御反应。
在免疫系统中，免疫细胞是起关键作用的细胞类型。
它们能够识别和灭杀感染体和变异细胞，调节和模拟免疫反应，从而维持机体的免疫平衡。
因此，为了更好地研究免疫学的各个方面，对免疫细胞进行有效的分离和纯化是非常重要的。
免疫细胞的分离和纯化技术主要有以下几种：一、梯度离心分离法梯度离心分离法是采用密度梯度离心分离免疫细胞的方法。
具体步骤是将单个样品分离成不同的浓度梯度，并将样品均匀地添加在内层管子上，然后进行离心分离。
通过分析分离后的离心上清液中各种细胞类型的分布情况，可得到高纯度的特定免疫细胞。
该方法具有简单、快速、操作简单等优点。
二、单克隆抗体柱纯化法单克隆抗体柱纯化法是使用和特定抗体相结合的高亲和性蛋白质固相柱进行免疫细胞分离和纯化的方法。
该方法是将单个样品进行混合，将混合物通过配对的特定抗体柱，将目标细胞捕获和结合。
然后用缓冲液除去不结合的细胞，然后逐步提高pH、浓度等条件进行脱附和纯化。
该方法可以获得高纯度特定细胞的纯度，但需要对抗体进行结合实验，需要一些特殊的仪器和设备。
三、磁珠分离法磁珠分离法是将磁性珠子通过表面结合蛋白并与目标细胞结合的方法实现免疫细胞的分离和纯化的方法。
目前，该方法是免疫学研究分离和纯化细胞的主要方法之一。
该方法具有结合力强、纯度高、高通量、实时观察和可重复等特点。
然而，现有产品价格较高，因此利用磁珠结合留存的免疫抗体分子，促进自主磁珠制备已成为热门技术研究领域。
四、流式细胞术流式细胞术是一种使用单胞悬液通过免疫表型分析和单细胞相关性分析的方法。
该技术是通过将免疫细胞进行标记，然后将其通过流式细胞术仪器进行检测和分析，以实现细胞分离和分析的方法。
流式细胞术是高分析刻度，可以分析更多的样品、更少的细胞、更少的步骤，同时也能够研究细胞的表面和内部组成，测定分析数据的精确性高，检测的速度快等多种优点。
临床免疫学检验-第十三章细胞免疫学技术
Ficoll分离法
聚蔗糖-泛影葡胺分层液的制备
6%聚蔗糖溶液 (Ficoll溶液)密度1.020
34%泛影葡胺溶液 (Hypaque溶液)密度1.2
酸性磷酸酶测定 非特异性酶的测定
巨噬细胞功能检测
炭粒廓清试验
正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90% 炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据 此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)， 间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒 的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判 断巨噬细胞的功能。
吞噬功能检测
鸡RBC
l液 密度1.135
细胞混悬液
高速离心 密
度
6小时
梯 度
低速离心 密 度 梯 度
死细胞残片和血小板 富含单核细胞的组分
富含淋巴细胞的组分 红细胞与粒细胞组分
淋巴细胞亚群的分离
T细胞和B细胞的分离
E花环分离法 尼龙棉分离法
E花环分离法
E受体
T
SRBC
B
E花环 T
离心
B
E花环
聚蔗糖-泛影
形成溶血空斑
可以检测致敏红细胞的各种抗原所对应的抗体,临 床应用比较广泛
反向空斑形成试验
反应物: 琼脂凝胶
SPA致敏的SRBC B细胞 补体 抗Ig抗体
形成溶血空斑
体外检测人类Ig分泌细胞的方法,与抗体的特异性 无关
酶联免疫斑点法
反应物:
包被在固相载体上的抗原 B细胞 酶标二抗
加底物显色
计数斑点形成细胞
免疫细胞的分离和保存技术
免疫细胞的分离和保存技术用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。
为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。
参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。
由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。
有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。
分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。
现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。
一、白细胞的分离（一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。
本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。
肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。
操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。
（二）聚合物加速沉淀法本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。
本法的细胞获得率比自然沉降法高。
二、外周血单个核细胞的分离外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。
免疫细胞分离技术
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人外周血淋巴细胞(亚群)的分纯(purificcation) 人外周血单个核细胞（PBMC）主含淋巴细胞, 但混有 单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。淋巴细胞的分纯： （一）红细胞的去除（0.83%氯化铵、蒸馏水） （二）血小板的去除（离心、洗涤） （三）单核、粒细胞的去除（黏附去除，羰基铁粉吞噬） （四）淋巴细胞亚群的分离★
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正选（positive selection）法： 磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞
负选（negtive selection）法： 磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的细胞为所需细胞
一般而言，负选法比正选法的磁珠用量大
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评价(evalution)：
Lymphocytes + sRBC , centrifugation----T lympho-cytes(底) / B lympho-cytes（界面）
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2、黏着性（理化）： B淋巴细胞易黏附聚酰胺纤维（尼龙纤维）表面，而T淋巴细胞则不易附 着～
（例）尼龙棉柱分离 — 直接流出的是T淋巴细胞。 3、免疫学：用特异性抗体并使其固相化，捕获具特定膜抗原的细胞～ （例）1、亲和板结合分离
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Precipitation of E rosette
Erythrocyte Rosette forming cell; ERFC The sueface of T lymphocyte contains the receptor (CD2) of sheep erythrocyte ,which is called E receptor for short . T lympho-cytes can form E rosette with sheep erythro-cytes by its E receptor.
免疫细胞存储的操作流程
免疫细胞存储的操作流程引言：免疫细胞存储是一种重要的生物医学技术，它可以帮助人们保存和利用免疫细胞以进行免疫治疗。
本文将介绍免疫细胞存储的操作流程，包括细胞采集、处理、贮存和使用等环节。
一、细胞采集1. 选择合适的采集源：免疫细胞可以从多个来源采集，包括外周血、骨髓、脐血等。
根据具体需求，选择合适的采集源很关键。
2. 采集方法：根据采集源的不同，采用相应的采集方法。
例如，外周血可以通过静脉抽血，骨髓可以通过穿刺抽取，脐血可以通过脐带剪断后采集。
3. 采集样本处理：采集的细胞样本需要尽快处理，以避免细胞失活或受污染。
通常，采集后的样本会被送往实验室进行下一步处理。
二、细胞处理1. 细胞分离：采集到的样本中可能存在其他细胞或物质，需要进行细胞分离。
可以通过离心、流式细胞术等方法将目标细胞分离出来。
2. 细胞富集：为了提高目标细胞的纯度和浓度，可以采用细胞富集技术，如磁珠富集、流式细胞术等。
3. 细胞检测：对处理后的细胞进行质量控制，确保细胞的存活率和纯度达到要求。
可以使用细胞计数仪、细胞培养等方法进行检测。
三、细胞贮存1. 冷冻保存：为了延长细胞的存活时间，通常会选择冷冻保存。
将处理后的细胞用特定的冷冻液冷冻保存，以确保细胞在低温下保持稳定。
2. 冷冻管标识：为了方便细胞的识别和管理，冷冻管需要进行标识。
可以使用标签或条码等方式标记细胞的相关信息，如样本编号、采集日期等。
3. 贮存条件：细胞贮存需要在恒定的温度和湿度条件下进行，通常选择液氮罐或液氮制冷器进行贮存。
同时，注意避免细胞受到震动或其他不良环境因素的影响。
四、细胞使用1. 细胞解冻：在使用前，需要将冷冻的细胞解冻。
解冻的过程需要控制温度和时间，以避免细胞受损。
2. 细胞培养：解冻后的细胞需要进行培养，以促进其生长和增殖。
通常使用适当的培养基和条件进行培养。
3. 细胞应用：培养后的细胞可以用于免疫治疗、疫苗制备等领域。
根据具体需求，细胞可以进行进一步的处理和应用。
免疫细胞存储资质
免疫细胞存储资质免疫细胞存储是指将个体的免疫细胞（包括T细胞、B细胞、NK细胞等）进行保存，以备将来应用于治疗或研究。
免疫细胞存储资质是指该实验室或机构具备进行免疫细胞存储的能力和资质。
下面将对免疫细胞存储资质进行详细介绍。
一、免疫细胞存储的重要性随着生物医学研究的发展，免疫细胞治疗逐渐成为一种重要的疾病治疗方法。
免疫细胞存储可以保留个体的免疫细胞，使得这些细胞在将来可以用于治疗自身免疫性疾病、肿瘤等疾病。
因此，具备免疫细胞存储资质的实验室或机构对于促进医学研究和治疗具有重要意义。
二、免疫细胞存储资质的要求1. 实验室或机构应具备相关的人员和设备，能够完成免疫细胞的采集、分离、保存等工作。
2. 实验室或机构应具备规范的操作流程和技术标准，确保免疫细胞的质量和安全性。
3. 实验室或机构应具备规范的数据管理和样品追踪系统，确保免疫细胞的可追溯性和准确性。
4. 实验室或机构应具备完善的安全管理措施，确保免疫细胞的保存和使用过程中不会造成交叉感染或其他安全风险。
三、免疫细胞存储资质的申请和认证1. 实验室或机构需要向相关部门提交申请，申请免疫细胞存储资质。
2. 相关部门将对申请材料进行审核，并进行实地考察和评估。
3. 审核通过后，实验室或机构将获得免疫细胞存储资质的认证。
四、免疫细胞存储资质的应用1. 免疫细胞存储资质的实验室或机构可以接受个体的免疫细胞样本，进行存储和管理。
2. 存储的免疫细胞可以应用于个体的免疫细胞治疗，如CAR-T细胞治疗、细胞免疫疗法等。
3. 存储的免疫细胞也可以用于科学研究，推动免疫细胞治疗技术的发展和创新。
五、免疫细胞存储资质的意义和前景1. 具备免疫细胞存储资质的实验室或机构可以为疾病治疗提供可靠的免疫细胞资源，为患者提供更好的治疗选择和机会。
2. 免疫细胞存储资质的认证标志着实验室或机构具备了一定的技术能力和安全保障，有助于提升其在行业内的竞争力和声誉。
3. 随着免疫细胞治疗的进一步发展和应用，免疫细胞存储资质的需求也会逐渐增加，具备该资质的实验室或机构将有更广阔的市场和发展空间。
9.免疫细胞样本制备
实操拓展
细胞活率
用台盼蓝进行染色，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞 ，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则 为正常细胞或凋亡细胞。进行计数。
革兰氏染色
革兰氏染色法通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶 于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚 糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时其仍呈紫色； 而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交 联度差，通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使 革兰氏阴性菌呈红色。
胞壁上的一种脂多糖和蛋白的复合物，当细
菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。内毒素 大量进入血液就会引起发热反应—“热原反 应”。快速检测（1小时）血液、脏器内毒素 含量可以为临床相关疾病的诊断预后提供参
考。
④ 发放前查阅送检报告，所有结果均合格后确定发放。 核对制剂发放信息通知单，确定无误后，打印发放制 剂标签。
流式检测
提问讨论
⑤ 核对信息发放细胞。 收集：根据总量取一定量细 胞悬液至对应编号225ml离心 管，800G、6min离心。
⑥ 第一次洗涤：弃上清， 生理盐水重悬细胞至对应编 号50ml离心管混匀，定容至 50ml，300G,8min。核对细胞 量是否符合质量标准。
⑦ 第二次洗涤：弃上清， 生理盐水重悬细胞混匀， 定容至50ml，300G,8min。
免疫细胞样本制备
一、采集套装
二、样本接收
三、细胞分离提取
①档案填写：根据套装标 签上的信息，填好档案， 完成后续实验准备工作。
②血浆分离：将血液转至 两只50ml注明编号的离心 管，25ml/管、并留样约 1ml测流式，0.5ml测密度。 800G 8min离心。（上升转 速9，下降转速7）
免疫细胞存储流程
免疫细胞存储流程免疫细胞存储是一项重要的医学技术，它可以有效地保存人体免疫系统中的重要细胞，用于治疗各种疾病。
这些免疫细胞包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞等，它们在抵抗感染、抑制肿瘤生长和维持免疫平衡等方面起着重要的作用。
下面将介绍免疫细胞存储的流程。
第一步：捐献免疫细胞免疫细胞的捐献可以通过多种途径进行，包括自体捐献和同种异体捐献。
自体捐献是指从患者自身身体中提取免疫细胞，通常通过采集患者的血液样本或骨髓样本来获得。
同种异体捐献是指从其他健康的捐献者身上获取免疫细胞，捐献者和接受者在HLA（人类白细胞抗原）匹配度方面需要具备较高的相似性。
第二步：免疫细胞处理一旦免疫细胞捐献完成，就需要对捐献的细胞进行处理。
首先，对捐献的细胞进行分离和纯化，以去除其他不需要的细胞成分。
这通常使用离心、负选择和阳选择等技术来实现。
其次，对纯化后的细胞进行处理，包括细胞培养、扩增和激活等步骤。
这些处理能够增加细胞的数量，并激活细胞的免疫活性。
第三步：细胞存储经过处理后的免疫细胞需要进行存储，以保证其质量和活性。
细胞存储通常采用液氮冷冻的方法，这种方法可以在极低的温度下将细胞冷冻保存，以延长其存储时间。
在存储过程中，细胞会被放置在专门设计的冷冻容器中，并加入特定的保护剂，以防止细胞受到冻结损伤。
第四步：细胞质量检测为了确保存储的免疫细胞质量良好，需要进行质量检测。
质量检测通常包括细胞活性检测、细胞数量测定、细胞表型分析等。
细胞活性检测可以通过细胞增殖、细胞杀伤和细胞分泌等实验来评估细胞的功能性。
细胞数量测定可以通过细胞计数器或显微镜等设备进行。
细胞表型分析可以通过流式细胞仪来评估细胞表面标记物的表达情况。
第五步：细胞分发和应用经过质量检测后，存储的免疫细胞可以根据需要进行分发和应用。
根据不同的临床需求，免疫细胞可以用于细胞治疗、细胞免疫疗法或免疫细胞疫苗等。
细胞分发和应用需要严格的操作规范和标准化流程，以确保治疗的安全性和有效性。
成人外周血免疫细胞存储pbmc存储条件_解释说明
成人外周血免疫细胞存储pbmc存储条件解释说明1. 引言1.1 概述成人外周血免疫细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，简称PBMC）是一类重要的免疫细胞种类，包括淋巴细胞、单核细胞和多能干细胞等。
存储PBMC样本并保持其完整性和功能对于后续的实验研究非常关键。
本文将详细探讨成人外周血免疫细胞存储条件，并介绍存储条件对实验结果的影响。
1.2 文章结构本文分为五个主要部分：引言、成人外周血免疫细胞存储条件、PBMC存储条件的关键因素、PBMC存储容器和保存方法的比较以及结论。
在成人外周血免疫细胞存储条件部分，将介绍什么是PBMC存储条件、其重要性以及它对实验结果产生的影响。
接着，在PBMC存储条件的关键因素部分，将讨论温度控制和冷冻速率、冷冻介质的选择和配方以及冷冻管和标签的使用注意事项。
随后，在PBMC存储容器和保存方法的比较中，我们将对使用液氮罐进行长期保存和使用液态氮注射式冷冻器保存PBMC样本的优缺点进行比较，并介绍相应的注意事项。
最后，通过结论部分，将总结回顾PBMC存储条件并提出存在的问题及改进建议。
1.3 目的本文旨在提供科学准确、可靠可行、易于操作的PBMC存储条件，帮助研究人员保存和利用成人外周血免疫细胞样本，以确保后续实验结果的准确性和可重复性。
通过详尽地探讨PBMC存储条件的重要因素和适用方法，希望能为科研工作者提供有关成人外周血免疫细胞存储方面的指导与建议。
同时，在最后一节中，我们还将针对现有存储条件存在的问题提出改进建议，希望能够引起更多学者对该领域的重视并共同推动该领域的进展。
2. 成人外周血免疫细胞存储条件2.1 什么是PBMC存储条件PBMC即成人外周血单个核细胞，是一种重要的免疫细胞类型，它在免疫反应中起着至关重要的作用。
为了确保PBMC的完整性和保存时间，需要遵循特定的存储条件。
PBMC存储条件指的是在收集和分离后将PBMC保存下来的环境设置和技术规范。
项目十六 免疫细胞的分离
项目十六免疫细胞的分离一、抗凝血的制备【实验原理】常用的抗凝剂如肝素能阻止凝血酶的形成；乙二胺四乙酸(EDTA)和柠檬酸能与Ca2+结合；机械脱纤维使血液中血小板和纤维蛋白凝聚；从而都能阻止血液凝固。
实验室常用的抗凝方法有如下几种：肝素抗凝、EDTA抗凝、脱纤维抗凝及Alsever液抗凝等方法。
【试剂和器材】1．试剂肝素、EDTA-Na2、Alsever液、生理盐水等。
2．器材三角烧瓶、玻璃珠、试管或离心管、采血器具。
【步骤和方法】1．肝素抗凝法将肝素用生理盐水配制成250U/ml或其它浓度的溶液，115℃灭菌10min(或112℃15min)，置-20℃可保存数月。
实验中常用的肝素抗凝浓度为20~50U/ml血液，实际当肝素浓度为5~10U/ml血液时已显出良好的抗凝效果。
2．EDTA法常用EDTA二钠盐(EDTA-Na2)，用生理盐水配制成浓度为27g/L的溶液。
配制时将溶液调至pH7.2，否则EDTA-Na2不溶解。
用时取0.05ml即可使1ml血液抗凝。
EDTA-Na2有效抗凝浓度为1~2mg/ml血液。
3．脱纤维法在三角烧瓶中放入一些小玻璃珠(放入数目视采血量多少而定，通常放30~40粒)，将血采入后立即轻轻顺一个方向旋转，直到血纤维凝聚为止。
4．Alsever液抗凝法血液与Aalsever液混合比例为1:1~1:2。
【结果判定】除玻璃珠脱纤维法有血纤维凝聚之外，抗凝血中不能有血凝块出现，否则应重新制备。
【注意事项】1．采血所用器具、抗凝剂、操作过程均应无菌。
2．加入血液后应轻轻混合，直到与抗凝剂均匀混合为止。
常采用旋转混合的方法混匀。
3．抗凝血放4℃保存。
【方法评价】肝素制备的抗凝血不易长期保存(保存时间12h)。
EDTA 法能保持血小板与白细胞的正常形态，避免聚集。
脱纤维法可使少量淋巴细胞丢失，但是悬液中细胞活力好，而且血小板污染甚少。
Alsever可较长时间保存血液，一般可保存2~3周。
免疫细胞提取方法-详细解释说明
免疫细胞提取方法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述免疫细胞提取方法是一种技术手段，用于从生物样本中提取和分离免疫细胞。
免疫细胞是免疫系统中的重要组成部分，能够识别和消除入侵的病原体以及异常细胞，起到维护机体免疫平衡和保持正常生理功能的关键作用。
随着对免疫细胞的研究不断深入，越来越多的科研和临床应用需要对免疫细胞进行进一步的分析和研究。
免疫细胞提取方法的发展和优化对于免疫学领域的研究人员和医生来说具有重要意义。
本文旨在综述和分析免疫细胞提取方法的背景、问题以及未来的发展方向。
首先，我们将对免疫细胞提取方法的背景进行概述，包括该技术的起源、发展历程以及目前已有的主要提取方法。
其次，我们将探讨免疫细胞提取方法的重要性，包括在研究领域的应用前景和临床诊断治疗中的重要作用。
最后，我们将着重讨论目前存在的免疫细胞提取方法的问题，如提取效率、纯度、损伤等方面的局限性，并对未来的免疫细胞提取方法进行展望，探讨可能的改进和突破。
通过本文的分析和总结，我们将能够更全面地了解免疫细胞提取方法的现状和挑战，并为未来的研究和应用提供思路和参考。
希望本文能够对免疫学领域的研究人员和医学工作者提供有益的信息，推动免疫细胞提取方法的发展和应用。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以进行如下编写：文章结构部分旨在介绍本篇长文的组织和内容。
本篇文章主要探讨免疫细胞提取方法，并对该研究领域进行概述、分析和总结。
首先，在第一部分的引言中，我们将提供对本文的概述。
我们将对免疫细胞提取方法的背景和重要性进行简要介绍，并阐述本文的目的。
通过这一部分，读者可以对免疫细胞提取方法有一个整体的了解，以及对本文的研究目标有所把握。
接下来，在第二部分的正文中，我们将深入探讨免疫细胞提取方法的背景、重要性以及目前存在的问题。
我们将指出免疫细胞提取方法的基本原理和技术，并分析其在免疫学研究和临床应用中的重要性。
同时，我们也将讨论目前存在的免疫细胞提取方法的问题，如提取效率、纯度和可重复性等方面的种种挑战。
《免疫细胞存储》课件
目录
• 免疫细胞存储概述 • 免疫细胞的种类与功能 • 免疫细胞存储的方法与流程 • 免疫细胞存储的应用与前景 • 免疫细胞存储的挑战与解决方案 • 实际案例分享
01
免疫细胞存储概述
免疫细胞存储的定义
免疫细胞存储是指将人体内的免疫细 胞，通过特定的技术手段，进行分离 、检测、培养、扩增和储存等一系列 操作，以便在将来需要时进行使用。
再生医学是指利用生物学和工程 学原理来修复、替代或再生人体
组织和器官的技术。
免疫细胞存储可以为再生医学和 组织工程提供高质量的细胞来源
，促进组织再生和修复。
存储的免疫细胞可以与干细胞等 其他类型的细胞共同培养和应用
，促进组织再生和功能恢复。
新药研发与疫苗制备
新药研发和疫苗制备是预防和治疗疾病的重要手段。
免疫细胞存储可以为新药研发和疫苗制备提供实验材料和研究对象，加速新药研发和疫苗制 备的进程。
存储的免疫细胞可以用于研究免疫细胞的生理和药理特性，以及筛选和评估新药和疫苗的效 果和安全性。
05
免疫细胞存储的挑战与解决方案
免疫细胞的活性保持
1 2 3
低温环境
维持免疫细胞活性需要低温环境，一般在-180℃ 左右的液氮中存储，以降低细胞代谢率，延长细 胞存活时间。
封闭式存储
采用封闭式存储容器，避免与外界接触，降低交叉感染的风险。
定期检测
在存储过程中定期对免疫细胞进行检测，及时发现和处理污染源。
提高存储效率与降低成本
优化存储容器设计
通过改进存储容器的设计，提高细胞的装载密度，从而提高存储效 率。
自动化操作
采用自动化技术进行免疫细胞的分离、检测、补充等操作，降低人 工操作的误差和成本。
免疫细胞的分离技术
CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2) 、CD267(TACI)、CD268(BAFFR)、
CD269(BCMA)、CD307(IRTA2)
髓样细胞 CD14、CD35(CR1)、CD64 (FcRI)、CD256(APRIL)、
CD257(BAFF)、CD312(EMR2)
血小板 CD36、CD41(整合蛋白IIb)、CD42aCD42d、CD51(整合蛋白v) 、
➢ 不同细胞密度不同 ➢ 不同细胞表面生物学特性不同 ➢ 不同细胞表面分化抗原不同
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免疫细胞的分离技术
根据不同的实验目的可以采取下列不同的分离方法
1、密度梯度离心法 2、黏附分离法（尼龙毛法、贴壁法、亲和板法） 3、磁性分离法 4、荧光激活分离法 5、其他分离法（花环沉降法）
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（一）外周血单个核细胞分离
加工处理抗原，将抗原肽提呈给抗原特异性淋巴细胞的 一组免疫细胞。血液中主要的APC细胞主要包括单核细 胞、树突状细胞、B细胞
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其他细胞
自然杀伤(NK)细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞，嗜中 性粒细胞，嗜碱性粒细胞，血小板等
NK细胞 肥大细胞 嗜酸性粒细胞 嗜中性粒细胞 嗜碱性粒细胞 血小板
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免疫细胞的特征
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方法 （以CD4+T细胞为例）
1. 羊抗兔Ig包被平皿 2. CD4 一抗培育T细胞，倒入平皿，4℃孵育1小时； 3. 收集未粘附的CD4-T细胞 4. PBS漂洗非特异吸附的CD4-T细胞 5. 收集粘附的CD4+T细胞，可以用刮板刮取并在显微
镜下观察
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免疫磁珠法 （Magnetic activated cell
CD55(DAF)、CD59、CD252(OX40L)、 CD279(PD1)、
免疫细胞分离技术
免疫细胞分离技术免疫细胞分离技术是一种重要的生物学和医学研究工具，广泛应用于生物样本中细胞的分离和纯化。
通过利用细胞表面的特异性标记，免疫细胞分离技术可以实现对不同类型细胞的高灵敏度、高特异性的分离。
在免疫学研究领域，免疫细胞分离技术被广泛应用于研究免疫细胞的功能和相互作用，对于深入理解免疫系统的机制具有重要意义。
免疫细胞分离技术的基本原理是利用抗体与特定细胞表面标记结合的高度特异性，通过各种分离方法将该细胞与其他非特异性细胞分离开来。
免疫细胞分离技术通常包括两个关键步骤：抗体与目标细胞的特异性结合和分离纯化。
在抗体结合的过程中，通过将抗体与目标细胞共孵育，使抗体与目标细胞表面标记结合形成抗原-抗体复合物。
而在分离纯化的过程中，可以通过多种方法将抗原-抗体复合物与其他非特异性细胞分离开来，如磁性珠分离、流式细胞仪分离等。
免疫细胞分离技术的关键是选择合适的特异性抗体。
抗体是由机体免疫系统产生的一种高度特异性的蛋白质，具有与目标抗原结合的能力。
在选择抗体时，需要考虑以下几个因素：第一，抗体的特异性；第二，抗体的亲和力和亲和常数；第三，抗体的结合位点；第四，抗体的格式和标记。
合理选择和设计抗体可以提高免疫细胞分离技术的效率和准确性。
在免疫细胞分离技术中，常用的方法之一是磁性珠分离法。
该方法利用表面覆有特定抗体的磁性珠与目标细胞结合，通过磁外场将目标细胞分离出来。
磁性珠分离法具有分离效率高、操作简便、适用范围广等优点，被广泛用于体外培养细胞、临床诊断和基础研究等领域。
另一种常用的免疫细胞分离技术是流式细胞仪分离法。
流式细胞仪是一种高速流动和高灵敏度激光共聚焦技术，可以对单个细胞进行多参数检测和鉴定。
在流式细胞仪分离中，通过合适的荧光染料或荧光标记抗体，结合流式细胞仪对细胞进行定量、快速分析和筛选。
流式细胞仪分离技术具有分离速度快、高通量、对样本体积要求小等优点，广泛应用于细胞表型分析和免疫学研究。
除了磁性珠分离法和流式细胞仪分离法，还有其他依赖于抗体与抗原结合的分离方法，如免疫磁珠分离法、免疫离心法、免疫亲和层析法等。
T细胞表型及脾细胞分离
标本制备：淋巴细胞悬液的制备
（1）取肝素抗凝血5ml与5ml Hank’s液稀释混匀，每组取2ml，用 滴 管 贴 管 壁 轻 轻 叠 加 于 2ml 分 离 液 上 ， 配 平 后 1500rpm 离 心 10mins。
（2）洗涤细胞：用滴管仔细吸出位于血浆和分离液之间乳白色的 淋巴细胞，放入盛有2ml Hank’s液的试管，1500rpm离心10mins， 弃上清，将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入Hank’s液重复洗涤一 次，最后一次用PBS洗涤。
细胞计数：
步骤：①用乙醇清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻 轻拭干；②用微量移液器取少许细胞悬液（10μl），将细胞 样本从室的一个口注入，液体在室中扩散，空气从另一个 口排除；③观察计数板四角大方格中的细胞数，并计算细 胞浓度。 注意事项：①计数前，应充分混匀细胞；②对于分布在刻 线上的细胞，依照“数上不数下，数左不数右“的原则进 行计数；③计数时，如发现各中方格的红细胞数目相差20 个以上，表示细胞分布不均匀，必须重新计数。
2、细胞活力观察及计数
收集分离出的脾细胞，置于10ml离心管内加入培养液吹打， 取10μl细胞，与10μl胎盘蓝染液混匀后染色并观察细胞活力， 同时进行细胞计数。 细胞活力观察（台盼蓝染色）：细胞损伤或死亡时，台盼 蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，被染成淡蓝 色，而活细胞能阻止染料进入细胞内，可以鉴别死细胞与 活细胞。 细胞计数：采用细胞计数板。
实验二 小鼠脾细胞分离与制备技术
分离小鼠脾细胞，细胞计数板进行细胞计数，胎盘 蓝染色进行细胞活性检测。
实验材料：
实验动物：小鼠。 细胞培养液。 试管，滴管，离心机，培养皿， 100目细胞筛等。
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免痰细舱的分窝和保存技术用体外方出对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定.计数和功能测定，是观疼机体免疫状态的一种重要手段。
为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏彖中分富岀来。
参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨嗤细胞、中性粒细胞等。
由于检测的目的和方法有同，分富细胞的需求和枝术也异。
有的仅需分富勺细胞，有的则需分富单个核细胞（mononuclearcellj ,其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte；,有的则需分富T细胞和B细胞以及其亚群。
分富细胞选用的方岀应力求简便可行，并能荻得壽纯度、爲获得率、爲焙力的细胞。
现用分富细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉吟率、粘附和乐啜能力加以组分，另一则按照各类细胞的裹面标志，包括细胞在面的抗原和受体加以选择性分富。
**»自鈿施的分离（-）血液中红细胞与勺细胞比例约600-1000:1,两者的比重不同其沉I障速度亦异，通常用两种方法加以分富。
本法是利用血细胞勺然汎吟率的分富法，采集血液后应及肘抗凝，通常逸用肝素抗疑比。
肝素能阻止凝血舔原转化为我血酶，从而抑制纤维蛋勺原形成纤维蛋自而防止血液凝.固。
標作原则是将舍抗我血的汎管直立挣置•室温30〜60min 后，血液分成朗显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的庆自层为自细胞，轻轻吸取印得富舍自细胞的细胞群，富心洗涤后加入少量蒸镭水或舍氣化銭的Gey溶液，经短肘间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗:条可得纯度较壽的自细胞悬液。
（二丿聚合杨加速況淀法本法是利用爲分子量的聚合场如朗腔、右炎髓肝、聚乙烯犹喀烷酌（polyvinylpyrolidone, PVP丿等使红细胞凝集成串，加速红细胞渝吟,使之与自细胞分富。
本比的细胞荻得率比勺然沉吟比需。
二、卄用血单个核細胞的分禽外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和潘度与其他细胞不同，红细胞和多核自细胞宏度较丸，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞酒度为1.075〜1.090,血小扱为1.030〜1.035。
为此利用一种密度介于1.075〜1.092之间而近于等渗的溶液（分层液丿做潘度樟度富心，使一定宏度的细胞按柑应密度様度分布，从而将各种血细胞加以分富。
常用的分层液有Ficoll 和Percoll两种。
(-)Ficoll分层液法主要用于分富外周血中的单个核细胞，是一种单次矗度样度离心分禽出。
聚羔無-泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的艺槍聚合场称聚羔髓(商老名为Ficoll；,分子量为40kD,具有壽宏度、低渗透庄.无寿性的特点。
需浓度的Ficoll滋液粘性爲，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低浓度溶液，宏度为1.020,海加比重为1.200的泛影葡胺CurografinJ以增加密度。
国外常用商品Isopaque Hypaque,故又称Ficoll-Hypaque分层液，将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合适.分层液。
分富人外周淋巴细胞以宏度为1.077±0.001的分层液最佳，因为人的红细胞瀝度为1.093, 粒细胞宏度为1.092,单个核细胞淮.1.076〜1.090之间。
而不同动杨血中的单个核细胞对分富液的宏度要求各不相同，如小亂为1.088,马为1.090。
分富肘先将分层液置洪•管底层，然后将肝素化全血以Hanks液戎PBS液作适古稀释后，轻轻奁加在分层液上面，使两者形成一个请晰的界面。
水平式富心后，富心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带(图20-1J o•—稀释的血浆—单个核细胞粒细胞红细胞红细胞和粒细胞忿度丸于分层液，同肘因红细胞遏列Ficoll而凝集成串钱状而汎积于管底。
血小扱则因酒度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液潘度相当的单个核细胞密集＞4血象层和分层液的界面中，呈勺勝状，浹取该层细胞递.经冼涤壽心重悬。
本比分富单个核细胞纯度可达95%,淋巴细胞约占90%〜95%,细胞荻得率可达80%以上，其壽低与宝温有关，超过25°C对会影响细胞获得率。
(二丿Percoll分层液法这是一种连续酒度梯度富心'分富法。
Percoll是一种经聚乙締今匕唸•烧g(PVP) 处理的睚胶颗粒，对细胞无寿性。
利用Percoll液经壽速富心后形成一个连续潘度样度的原理，将宏度不等的细胞分富纯化。
用Percoll原液(•矗度1.135)与约等量玖富子强度的璘酸缓冲液均匀混合，需速富心后，使分层液形成一个从•管底到液面宏度逐漸雄减的连续潘度样度，再将己制备的单个核细胞悬液轻轻总加A液面上，低速富心后，便得四个细胞层。
在层％死细胞戎片和血小板，底层为惹细胞和红细胞，中间有两层，上层富含单个核细胞(75%),下层當含淋巴细胞(98%)(图-2)。
该法是纯化单核细胞和淋巴细胞的一各轶好的方法，但操作流程较长，手续较多。
干死细胞组分J富含单核细胞的爼分J富含淋巴细胞的组分〜红细施七粒细胞组分图・2连续淞度梯度富心出分富单个核细胞中各细胞成分的分布示恋图三、淋巴鈿也及其亚算的分嵩为研死免疫细胞的功能，常需爲純度的淋巴细胞龙其亚群，分富方比介绍如下。
(-)、纯淋巴细胞群的采集通常利用单核细胞柱37°C和Ca2+存在条件下，能主动粘附征玻病、塑抖、尼龙毛、郴抡纤维或葡聚紡我胶的特性，据此建立许多从单个核细胞悬液中去除单核细胞的沁、菇以荻得需纯度的淋巴细胞群。
将■已制备的单个核细胞悬液倾于玻癘或埜料平皿或為平小瓶中，移至37°C 温俞挣置1h 左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非粘附细胞儿乎为纯淋巴细胞，继用橡皮利下贴壁的细胞即为純单核细胞群。
因B细胞也有贴壁现象，用本出分富的淋巴细胞群中B 细胞有所喷失。
(2)吸附柱过诲、法将单个核细胞悬液注入装有玻癘纤维或葡聚紡;疑胶SephadexGlO的柱层中，凡有粘附能力的细胞绝大部分彼吸附而粘滯在柱层中，从柱上冼脱下来的细胞主要是淋巴细胞。
此出简单易行，对细胞奴少槓害。
(3)琲铁吸引法利用单核细胞具有呑嗤的特性，往单个核细胞悬液中加直径为3pm的琰基铁颗粒，置37°C温编短肘淡转播动，待单核细胞充分呑噬験基铁颗粒后，用该铁将细胞双至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞。
(二丿,淋巴细胞亚群的分富分离相当纯化的淋巴细胞亚群是细胞免疫檢酸的基本枝术。
其原则是根据和应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。
凡根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方岀是阳性选择去；而逸挣性去除不要的细胞，仅紆下所需的细胞是为阴性选择。
常用以下儿种方岀：(V E花环淤吟法本去是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继用淋巴细胞分层液分富细胞。
浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富含B细胞，而沉障点管底的形成E抡环的细胞用低渗比处理，使國统细胞周国的绵羊红细胞快速裂鮮，则荻得纯的T细胞。
(2)尼龙毛分禽法本岀利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维哀面的特性，可将T和B细胞分开。
棵作原则是取松散而经过处理的尼龙毛(聚犹胺纤维丿，均匀充填 A.径5〜6nm的聚乙晞塑料•管(饮料管即可丿，经Hanks液没透保温，将单个核细胞悬液加入柱，放37温俞筛置1〜2h。
用预温的含10%〜20%小牛血请培养液谨洗，洗脱液舍有非粘附的T细胞，重复灌洗几次以除去管戎闺的T细胞。
再用冷或温培养液边冲边洗边痹庄塑抖管，此肘冼脱液富舍B细胞。
如此得到的T细胞钝度花90%以上，B细胞纯度可达80%。
(3)亲和扱结合分富法利用亲和层析冻分富淋巴细胞亚群，其原理是各种沐巴细胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于塑料平妆上，继加细胞悬液，凡抗原阳性的细胞则与和应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取（图-3） o同样若用特异性抗療交联A塑料板上，則可分禽得具有特异抗療受体的淋巴细胞。
淋巴细胞受体与特异抗原或抗体接紘，可引起细胞激焙，因此，凡欲去除细胞悬液芷一细胞亚群肘，本法灵适用。
如要分富CD4+龙CD8+细胞，则可用抗CD4 或CD8单克隆抗体吸附。
用抗lg抗体则可分富B细胞。
同样，用活化的C3包彼，可分富出有C3受体的细胞。
抗休致建极图-3亲和分富出图解（4）吳先激活细胞分禽仪分富法炎先激活细胞分禽仪（fluorescenceactivatedcellsorter, FACS丿主要由4部分组成：①细胞流动糸统处毛庄流速控制糸统，②激光糸统，③检测与讯号处理糸统，④细胞分选糸统。
其主要原理是细胞经茨光染色后，通过需速浇动糸统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测主。
当细胞从流动喳喷嘴处流出肘，超声振荡搅动液流，使液流新裂成一连串的均匀小滿（40000 ^/s）,每小滿最多含一个细胞（其中只有百分之几的液M中舍细胞丿，细胞经激光束照射尹生疫光和散射光，由光电信增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞的类型。
如识别的是预计所需的细胞肘（如T细胞、B细胞要其亚群丿，准.细胞样％流断裂成小滿肘，使液痛瞬即感应阳电持、阴亀椅或不带电持，使所谢的细胞＞4 电场偏转下进入不同的收集•管（图-4丿o用FACS分富细胞;隹确快速，能保持细胞话力，并可＞4无茵条件下进行，但仪麥昂贵，极少用于常规，而多数仅作为研兜的手段。
1炎光擁测器图-4荧光激活细胞分富仪简图叩、乐喘鈿能的分富和收第人外周血中单核-巨嗤细胞可通过Pecoll潘度梯度分富比获取，但救量较少，用血量多。
用斑螫數贴出可从人体组织液中获取较纯的巨噬细胞，不倉作进一步体外分富，细胞量航失较少。
该出是用谑缄趟取10%中药斑螫酒精没出液，贴數＞4僧側皮肤哀面，4〜5h后皮肤局部充血，48h后局部形成水疱，吸取疱中的组织液，含巨噬细胞。
但此比对病人皮肤有一定根伤，有肘可引起局部威染，应值用。
欲获取小就、丸亂、豚魚等小动杨的巨嗤细胞，可经旗腔注入少许石蜡油，3〜4天后冲洗出廡腔渗岀液，所得细胞悬液中70%〜80%为巨嗤细胞。
五、沐巴鈿魁的榇存和活力测龙(-)■分禽细胞的保存在票些情况下，分富所得细胞需要加以保存，否則活力遥速下阶，芯至死 %•Co(1J短期保存技术将分窗到的细胞用适量含10%〜20%夭活小牛血请的Hanks, Tc-199. RPMI1640龙其他培界液稀粹重悬。
所用培养液要求等湊，具缓冲作用，并对细胞无寿性。
通常置4°C保存轶好，可减低细胞代活动。
要注意不要迅速改变细胞所处的温度，以免凌成细胞"温度"休克。
(2)长期冷冻保存技术利用液気深低温f-196°Cj环境保存细胞，是当前世尿上通用的细胞长期保存枝术。
其原理在于深低温环境可中断细胞的代，但在障温过程由于冰禺的形成和渗透庄的改变均可导致细胞的槓伤和部分死亡，所以旌.冷冻过程中一定要加用冷冻保护利，常用的保护剂为二甲fdimethylsulfoxide, DMSOJ。