拟南芥原生质体的提取和转化

拟南芥原生质体的提取和转化

(1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于

20ml双蒸水中）；共需叶片约90片；

(2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm摇床上酶解3小时；

(3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃，

60g，离心15min；

(4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min；

(5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min；

(6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬；

以下操作均在23℃下进行：

(7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪

去前端）轻柔混匀；

(8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min；

(9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5；

(10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀；

(11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。

(1)酶解液：

cellulose R10 15%

Macerozyme R10 0.3%

Mannitol 1.09g

KCl 0.3M

MES 0.3M

调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液

CaCl20.15M

β-巯基乙醇0.75mM

(2)PEG溶液（40%，v/v）

PEG4000 1g

0.8M Mannitol 0.625ml

1M CaCl2 0.25m

(3)W5溶液

154mM NaCl 9.0g

125mM CaCl218.4g

5mM KCl 0.37g

5mM glucose 0.9g

0.03%MES 0.3g

用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌(4)MaMg溶液

1M MgCl20.5ml

0.1%MES 0.1g

0.4M Mannitol7.3g

用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌