第三章 细胞分离及胞内产物的溶解
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第一章 细胞的分离与胞内
化学法 酸碱处理 化学试剂处理 酶溶
物理渗透法 渗透压冲击法 冻结－融化法
（一）高压匀浆
高压匀浆又称高压剪切破碎
破碎原理：细胞悬浮液在高 压作用下从阀座与阀之间的 环隙高速喷出后撞击到碰撞 环上，细胞在受到高速撞击 作用后，急剧释放到低压环 境，从而在撞击力和剪切力 等综合作用下破碎。
阀座
阀杆 撞击环 阀杆
按工业应用分类: 1) 管式离心机 2) 碟片式离心机
管式离心机
又称圆筒式离心机，结构较简单
操作时，料液从圆管下端的中心输入，在离心力作用下， 管内液体基本上是以旋转轴为中心的圆筒面，从上端的中 心排出轻相（上清液）。
固液分离（间隙操作）
液液分离（连续操作）
间隙操作时，固体颗粒沉降于管壁；连续操作时， 从管壁附近的出口排出重相（浓缩的悬浮液）
机械破碎中细胞所受的机械作用力：压缩力和剪切 力。
化学破碎又称化学渗透，利用化学或生化试剂（酶） 改变细胞壁或膜的结构，增大胞内物质的溶解速率； 或者完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压 作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。
二、细胞破碎技术
机械破碎法 高压匀浆 珠磨法 喷雾撞击破碎 超声波破碎
（二）珠磨
原理：珠磨机的破碎室内填充玻璃或氧化锆微珠。 在搅拌桨的高速搅拌下微珠高速运动，微珠之间 以及微珠和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液 中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。
WSK卧式高效全能珠磨机
优缺点
珠磨破碎操作的有效能量利用率仅为1％左右，破 碎过程产生大量的热能。因此在设计操作时应充 分考虑换热能力问题。
预处理方法
加热：最简单和最廉价的处理方法。黏度 、促凝聚、固 体成分体积 、破坏凝胶结构、增加空隙率
生化分离工程_苏海佳_第三章细胞破碎
5. 胞内产物的选择性释放
细胞完全破碎的缺点：所有胞内的蛋白质全部 释放出来，粘度增加，杂质增加，给后面分离 纯化带来困难。
1、目标：细胞不完全破碎，选择性释放，其他物 质尽量少释放，粗分。
生化集成：利用两种以上的不同阶段的分离过 程同时进行。
2、原因：例如利用珠磨法破碎酵母细胞时，各种 酶的释放速度不同，靠近细胞膜和细胞壁的酶先 释放，细胞内部或细胞器内后释放。
本章要点
珠磨法、高压匀浆法、撞击破碎法 和超声波法破碎细胞的基本原理和 应用条件？ 胞内产物的选择性释放的原理？
生活中的辛苦阻挠不了我对生活的热 爱。21.1.1921.1.19Tuesday, January 19, 2021 人生得意须尽欢，莫使金樽空对月。04:49:2704:49:2704:491/19/2021 4:49:27 AM 做一枚螺丝钉，那里需要那里上。21.1.1904:49:2704:49Jan-2119-J an-21 日复一日的努力只为成就美好的明天 。04:49:2704:49:2704:49Tues day, January 19, 2021 安全放在第一位，防微杜渐。21.1.1921.1.1904:49:2704:49:27Januar y 19, 2021 加强自身建设，增强个人的休养。2021年1月 19日上 午4时49分21.1.1921.1.19 精益求精，追求卓越，因为相信而伟 大。2021年1月 19日星 期二上 午4时49分27秒04:49:2721.1.19 让自己更加强大，更加专业，这才能 让自己 更好。2021年1月上午 4时49分21.1.1904:49Januar y 19, 2021 这些年的努力就为了得到相应的回报 。2021年1月19日星期 二4时49分27秒04:49:2719 January 2021 科学，你是国力的灵魂；同时又是社 会发展 的标志 。上午4时49分 27秒上 午4时49分04:49:2721.1.19 每天都是美好的一天，新的一天开启 。21.1.1921.1.1904:4904:49:2704:49:27Jan- 21 相信命运，让自己成长，慢慢的长大 。2021年1月19日星期 二4时49分27秒Tues day, January 19, 2021 爱情，亲情，友情，让人无法割舍。21.1.192021年1月19日 星期二 4时49分27秒21.1.19
高中生物必修1《第3章细胞的物质代谢第1节细胞内外的物质交换三物质进出细胞...》107北师大PPT课件
注 意：
1、植物细胞的原生质层相当于一层半透膜
2、细胞失水时细胞壁和原生质层都会出现一 定程度的收缩,但原生质层的伸缩性更大,故 原生质层会与细胞壁发生分离(内因）。
3、植物细胞质壁分离复原的条件: 植物细胞必须是活细胞 细胞液与外界溶液必须有浓度差（外因） 必须有大的液泡（成熟的植物细胞）
利用质壁分离现象可以解决问题p29
1、证明原生质层具有选择透过性 2、判断植物细胞的死活 3、测定细胞液的浓度大小（范围） 4、证明细胞壁的伸缩性小于原生质
层的伸缩性
根据细胞膜有无选择透过性可以 判定细胞死活。
第四章 细胞的物质输入和输出
渗透现象示意图
什么叫渗透作用?
水分子(或其它溶剂分子)透过半透膜
的扩散。
渗透作用的方向
高低Βιβλιοθήκη 溶液 浓度水分 流动 方向
水势
低
高
渗透作用必须 具备的条件
具有半透膜
半透膜两侧的溶 液有浓度差（物 质的量浓度）
方法步骤
质 壁 分 离
0.3g/ml蔗糖溶液
清水
这叫质壁分离复原
细胞分离与胞内产物的溶解_生物分离工程
4
二、包涵体的形成原因
在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋 白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法 形成正确的次级键等原因形成的。 最大缺点：一级结构正确，高级结构 错误。
5
1、表达量过高。原因可能是合成速度太快， 以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确 的配对（并非所有），过多的蛋白间的非特异性结 合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基 酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包 涵体的形成呈正相关。
19
蛋白质复性影响因素
变性剂浓度 目标蛋白浓度； 目标蛋白浓度； pH和离子强度； 和离子强度； 和离子强度 氧化还原条件。 氧化还原条件。
20
复性常用方法
1.稀释复性：直接加入水或复性缓冲液，缺 点是体积增加较大，后续处理困难。 稀释蛋白浓度：浓度高则容易形成聚集体 （较低的复性收率）。有时需低于0.01mg/mL。 2.脉冲流加复性：分批次加入到缓冲液中， 使折叠中间体保持在较低的水平。例：在510mg/mL终浓度下，溶菌酶复性收率可达80%以 上。
21
3.透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降 低外透液浓度来控制变性剂去除速度，速度慢，不 适合大规模操作，无法应用到生产规模。 4. 超滤复性：选择合适载留分子量的膜，允许 变性剂通过膜而蛋白质通不过。在生产中较多的使 用，规模较大，缺点是不适合样品量较少的情况， 且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性（蛋白 聚集于膜上）。
14
常见的工艺路线（三）
化学破碎 （加变性剂）
离心除细胞碎片
除变性剂复性
15
路线三： 路线三：
优点是用化学法破碎，所采用的试剂既可 优点是用化学法破碎， 是用化学法破碎 以破碎又可以溶解包含体， 以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和 为一道，节省了设备和时间， 为一道，节省了设备和时间，比前两者更 适合于实验室操作。 适合于实验室操作。 缺点是所有的可溶性杂质都没有除去 是所有的可溶性杂质都没有除去， 缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混 杂在产物中间，给后续分离带来困难。 杂在产物中间，给后续分离带来困难。
二、包涵体的形成原因
在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋 白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法 形成正确的次级键等原因形成的。 最大缺点：一级结构正确，高级结构 错误。
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1、表达量过高。原因可能是合成速度太快， 以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确 的配对（并非所有），过多的蛋白间的非特异性结 合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基 酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包 涵体的形成呈正相关。
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蛋白质复性影响因素
变性剂浓度 目标蛋白浓度； 目标蛋白浓度； pH和离子强度； 和离子强度； 和离子强度 氧化还原条件。 氧化还原条件。
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复性常用方法
1.稀释复性：直接加入水或复性缓冲液，缺 点是体积增加较大，后续处理困难。 稀释蛋白浓度：浓度高则容易形成聚集体 （较低的复性收率）。有时需低于0.01mg/mL。 2.脉冲流加复性：分批次加入到缓冲液中， 使折叠中间体保持在较低的水平。例：在510mg/mL终浓度下，溶菌酶复性收率可达80%以 上。
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3.透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降 低外透液浓度来控制变性剂去除速度，速度慢，不 适合大规模操作，无法应用到生产规模。 4. 超滤复性：选择合适载留分子量的膜，允许 变性剂通过膜而蛋白质通不过。在生产中较多的使 用，规模较大，缺点是不适合样品量较少的情况， 且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性（蛋白 聚集于膜上）。
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常见的工艺路线（三）
化学破碎 （加变性剂）
离心除细胞碎片
除变性剂复性
15
路线三： 路线三：
优点是用化学法破碎，所采用的试剂既可 优点是用化学法破碎， 是用化学法破碎 以破碎又可以溶解包含体， 以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和 为一道，节省了设备和时间， 为一道，节省了设备和时间，比前两者更 适合于实验室操作。 适合于实验室操作。 缺点是所有的可溶性杂质都没有除去 是所有的可溶性杂质都没有除去， 缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混 杂在产物中间，给后续分离带来困难。 杂在产物中间，给后续分离带来困难。
第三章 细胞破碎
3.5.2 与上游相结合
（3）克隆噬菌体溶解基因 ：在细胞内引进噬菌体基 因，培养结束后，控制一定条件（如温度等）， 激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出 内含物。 （4）耐高温产品的基因表达 ：如果产品能表达成 耐高温型，杂蛋白仍然保持原特性，那么就可在 较高温度下将产品与杂质分开，这样既节省了冷 却费用，又简化了分离步骤。
酶溶法的特点（外加酶）：
（1）酶溶法需要特定的反应条件。 （2）酶具有高度专一性，必须根据细胞壁的结构和 化学组成选择适当的酶或溶酶系统，并确定相应 的次序。 （3）酶溶法的优点是：具有选择性释放产物，条件 温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。 （4）酶溶法的不足：一是溶酶价格高；二是酶溶法 通用性差，且不易确定最佳的溶解条件；三是存 在产物抑制，在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有 抑制作用。
3.3.1 珠磨法
细胞破碎率可用一级反应动力学表示 ： 间歇操作： ln[1/(1-R)]=Kt 连续操作： ln[1/(1-R)]=Kτ 其中 τ =V/F
式中： R—破碎率（g/g） K—反应速率常数(1/s) t—破碎时间(s) τ —平均停留时间(s) V—破碎室悬浮液体积（L） F—进料速率(L/s)
《生物分离工程》 Bioseparation Engineering 第三章 细胞破碎
生物分离过程的一般流程
原料液 原料液 细胞分离 ( 细胞分离 ( 离心，过滤 离心，过滤 )) 细胞－胞内产物 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲 加盐酸胍、脲 ) 复性 细胞破碎 碎片分离 碎片分离 粗分离( 盐析、萃取、超过滤等 盐析、萃取、超过滤等 ) 纯化( 层析、电泳 层析、电泳 ) 脱盐( 凝胶过滤、超过滤 凝胶过滤、超过滤 ) 浓缩( 超过滤 超过滤) 精制( 结晶、干燥 结晶、干燥 ) 路线一 路线二 清液－胞外产物
细胞分离与胞内产物的溶解
细胞破碎
1
生物分离过程的一般流程
原原料料液液 细细胞胞分分离离(( 离离心心，，过过滤滤))
路线一 细细胞胞－－胞胞内内产产物物
路线二 清液－胞外产物
路线一B 包含体
细胞破碎 碎碎片片分分离离
路线一A
溶解(加加盐盐酸酸胍胍、、脲脲)
粗分离(盐盐析析、、萃萃取取、、超超过过滤滤等等)
复性
纯化( 层层析析、、电电泳泳)
本章内容
脱盐(凝凝胶胶过过滤滤、、超超过过滤滤)
浓缩(超超过过滤滤)
精制( 结结晶晶、、干干燥燥)
2
本节的主要内容
常见的细胞壁结构
细胞破碎技术
包涵体的纯化方法
3
概述
不同类型的细胞分泌目标产物的类型： 动物细胞多分泌到细胞外培养液 植物细胞多为胞内产物 微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外
高压匀浆器各种阀型设计
20
高压匀浆器的种类
高压匀浆器的种类较多： WAB公司的AVP Gaulin 31MR型 Bran and luebbe 公司SHL40型 意大利Niro Soavi
高压匀浆机
21
高压匀浆法使用时注意事项
高压匀浆器的操作温度上升约２-３℃/10MPa 为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节 温度，使出口温度调节在20℃左右。
30
3）超声波破碎
超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波 振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞 悬浮液。
超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介 质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。
超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超 声波的声频、声能有关。
31
1
生物分离过程的一般流程
原原料料液液 细细胞胞分分离离(( 离离心心，，过过滤滤))
路线一 细细胞胞－－胞胞内内产产物物
路线二 清液－胞外产物
路线一B 包含体
细胞破碎 碎碎片片分分离离
路线一A
溶解(加加盐盐酸酸胍胍、、脲脲)
粗分离(盐盐析析、、萃萃取取、、超超过过滤滤等等)
复性
纯化( 层层析析、、电电泳泳)
本章内容
脱盐(凝凝胶胶过过滤滤、、超超过过滤滤)
浓缩(超超过过滤滤)
精制( 结结晶晶、、干干燥燥)
2
本节的主要内容
常见的细胞壁结构
细胞破碎技术
包涵体的纯化方法
3
概述
不同类型的细胞分泌目标产物的类型： 动物细胞多分泌到细胞外培养液 植物细胞多为胞内产物 微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外
高压匀浆器各种阀型设计
20
高压匀浆器的种类
高压匀浆器的种类较多： WAB公司的AVP Gaulin 31MR型 Bran and luebbe 公司SHL40型 意大利Niro Soavi
高压匀浆机
21
高压匀浆法使用时注意事项
高压匀浆器的操作温度上升约２-３℃/10MPa 为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节 温度，使出口温度调节在20℃左右。
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3）超声波破碎
超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波 振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞 悬浮液。
超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介 质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。
超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超 声波的声频、声能有关。
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高中生物必修1《第3章细胞的物质代谢第1节细胞内外的物质交换三物质进出细胞...》195北师大PPT课件
B. CO2由静脉血进入肺泡内
C．原尿中的葡萄糖进入肾小管上皮细胞 D．水分子进出细胞
A 葡萄糖进入红细胞的方式是（ ） 2 A．协助扩散 B．自由扩散 C．主动运输 D．渗透作用
植物细胞发生质壁分离的原因是（A）
① 外界溶液浓度大于细胞液浓度 ② 细胞液浓度大于外界 溶液浓度 ③ 细胞壁的伸缩性大于原生质层的伸缩性 ④ 原生质层的伸缩性大于细胞壁的伸缩性
并且需要载体蛋白的协助，这种方式叫主动运输。
2.特点： 需要载体蛋白，同时需要能量。 3.运输方向：一浓般度为高从的浓一度侧低运的输一侧向
4.举例：
植物根细胞对矿质元素（Na+、 K+、I-等）的吸收，氨基酸和
葡萄糖进入小肠绒毛上皮细胞。 16
项 目 自由扩散 协助扩散
主动运输
浓度梯度 顺浓度梯度 顺浓度梯度 一般逆浓度梯度
7
细胞质壁分离和复原与外界溶液浓度的关系
表达交流
2.细胞发生质壁分离的原因是什么？质壁分离有的能复原、 有的不能复原，其原因是什么？
外界溶液浓度>细胞液浓度 时，细胞失水，引起原生质 层与细胞壁分离。
若为活细胞，则可以复原；
若细胞死亡或外界溶液浓度
过大时，则不会复原。
8
细胞质壁分离和复原与外界溶液浓度的关系 表达交流
3.在农业生产中，为什么会由于施肥不当而产生“烧苗” 现象？为什么干旱情况下作物会发生枯萎现象，浇水后有 时会恢复正常生长，有时候不能恢复正常生长？
施肥后导致土壤溶液浓度过大，细胞不能吸水甚至失水， 从而产生烧苗现象。
干旱情况下有的植物已经死亡，浇水仍不能恢复正常。
9
1
1.概念： 物质通过简单的扩散作用进 出细胞，叫做自由扩散。
高中生物必修一第三章第二节细胞器
细胞器——系统内的分工合作1、分离各种细胞器的方法：差速离心法。
2、线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，是细胞的“动力车间”。
细胞生命活动所需的能量，大约95%来自线粒体。
3、叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞含有的细胞器，是植物细胞的“养料制造车间”和“能量转换车间”。
4、内质网是膜连接而成的网状结构，是细胞内蛋白质合成和加工，以及脂质合成的“车间”。
5、内质网的类型：粗面内质网（上有核糖体）、滑面内质网6、高尔基体主要是对来自内质网的蛋白质进行加工、分类和包装的“车间”及“发送站”，功能：与动物细胞分泌物形成有关；与植物细胞细胞壁形成有关。
7、核糖体的功能：是“生产蛋白质的机器”分布：有的附着在内质网上，有的游离在细胞质中。
8、溶酶体：是“消化车间”，内部含多种水解酶，能分解衰老、损伤的细胞器，吞噬并杀死侵入细胞的病毒或病菌。
9、液泡：调节植物细胞内的环境，充盈着的液泡还可以使植物细胞保持坚挺，主要存在于植物细胞中。
10、中心体：由两个互相垂直的中心里及周围物质组成，与细胞的有丝分裂有关，分布于动物和某些低等植物的细胞中。
11、细胞质的组成：主要包括细胞器和细胞质基质。
12、细胞质基质存在状态：胶质状态成分：含有水、无机盐、脂质、糖类、氨基酸、核酸和多种酶功能：是多种化学反应进行的场所13、叶绿体分布：叶肉细胞中、形态：扁平的梭形、颜色：绿色14、线粒体普遍存在于动植物细胞中，形态多样，有短棒状、圆球状、线形、哑铃形等。
15、细胞骨架是由蛋白质纤维围成的网架结构，与细胞运动、分裂、分化以及物质运输、能量转换、信息传递等生命活动密切相关。
16、分泌蛋白：有些蛋白质是在细胞内合成后，分泌到细胞外气作用的，这类蛋白质叫做分泌蛋白。
17、分泌蛋白合成途径：核糖体（合成肽链）→内质网（加工成具有一定空间结构的蛋白质）→囊泡→高尔基体（进一步修饰加工）→囊泡→细胞膜→细胞外18、生物膜的组成：细胞器膜和细胞膜、核膜等结构19、分泌蛋白在形成过程中，要发生不同膜的融合，膜融合的原理是膜的流动性。
细胞破碎、蛋白质复性、固液分离
以及细胞碎片进一步变小，影响后面对碎片的分离。
被破碎的破碎率符合如下公式： ln[1/(1-R)]=KNPɑ 式中 R — 破碎率，为N次循环后，蛋白质的释放
量Rn与最大释放量Rm之比；
K － 与温度、粘度等有关的破碎速度常数；
P － 操作压力，MPa；
ɑ－ 与微生物种类有关的常数。
活损失可以忽略。对于温度敏感性物质低温操作是
必需的。高压匀浆一般需多级操作，每次循环前往 往进行级间冷却。尽管提高压力有利于细胞破碎， 但是提高压力需增加能耗（3.5kW/100MPa），同 时为移走产生的热量（23.8℃/100Mpa）需要付出
代价。机械破碎的能耗主要包括提供动力（如压力）
消耗的能量以及低温操作耗费的能量。
影响高压匀浆器细胞破碎因素
升高压力有利于破碎，
减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达
到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过 小。 Brokman等人已研究了能适应于高压操作的匀 浆阀，试验表明在约175 MPa的压力下，破碎率可达 100％，
但压力大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实
糖结构为多层网状结构，其中75%的肽聚糖亚单位
相互交联，网格致密坚固。
革兰氏阴性细菌的细胞壁
O-特异多糖 (O-polysaccharide)
核心多糖(corepolysaccharide)
蛋白质 类脂A
孔蛋白
(脂多糖)
(Lipid A)
革兰氏阴 性细菌的 外膜
脂蛋白
磷脂分子
壁膜间隙
革兰氏阴性细菌的细胞壁包括内壁层和外壁层，内 壁层较薄（2~3nm），由肽聚糖组成；外壁层较厚
高中生物必修1《第3章细胞的物质代谢第1节细胞内外的物质交换三物质进出细胞...》143北师大PPT课件
大分子和颗粒物质运输的特点：
运输形式
胞吞和胞吐
运输方向 有无载体 是否需要能量
与浓度无关 不需要，细胞膜和囊泡 由ATP供能
被动运输 自由扩散
小分子、离子
协助扩散
物质 跨膜 运输 方式
主动运输(逆浓度梯度)
消
胞吞 耗
大分子和颗
粒物质
胞吐
能 量
顺浓度 梯度
载体蛋白
随堂训练
1、下列哪些物质进出细胞时与细胞中的核糖体和线粒 体密切相关（ ）
二、协助扩散 进出细胞的物质借助载体蛋白的扩散
特点： ①从高浓度到低浓度； ②需要载体蛋白的协助； ③不需要能量。
实例： 葡萄糖进入红细胞
自由扩散与协助扩散有什么异同？
相同： 都是顺浓度梯度跨膜运输，不 需要消耗能量
自由扩散不需要载体蛋白的参与； 不同：
协助扩散需要载体蛋白的参与。
被
自由扩散 协助扩散
① 甘油通过细胞膜 ②人的红细胞从血浆中吸收葡萄糖 ③ 肾小管上皮细胞吸收原尿中的Na+
④ 小肠绒毛上皮细胞吸收氨基酸
A ①②
B ③④ C ②③ D ①②③④
2，红细胞吸收葡萄糖和无机盐的共同点是
（ C）
2
A. 都可以从低浓度一侧到高浓度一侧
B. 都需要供给ATP
C. 都需要载体协助 D. 既需要载体协助又需要消耗能量
大分子和颗粒性物质的运输
有些物质在细胞膜内被一层 膜所包围，形成小囊泡，囊泡膜 与细胞膜融合在一起，小囊泡逐 渐移到细胞表面，并且向细胞外 张开，使内含物质排出细胞外， 这种现象叫做胞吐作用。
如：分泌蛋白的合成与运输。
胞 吐
分泌蛋白分泌到细胞 外穿过几层生物膜？
细胞产物分析技术细胞产物分离方法优秀课件
经典分离方法——液相微萃取法
与液液萃取法比较 ❖适应了绿色分析技术发展的需要（液液萃取消耗
mL 级有机溶剂，液相微萃取仅需μL 级） ❖富集倍数大，萃取效率高（富集倍数达1000 倍），
可使分析方法的灵敏度提高两个数量级以上 ❖便于与具有微量进样方法的特定仪器联用。 ❖样品溶液用量少(l~10mL 左右)
经典分离方法——液相微萃取法
单滴液相微萃取( SD-LPME)是将萃取用的有机溶 剂液滴悬挂在微量进样器的针端。同液-液萃取一 样，单滴液相微萃取也是基于分析物在不同相中分 配系数不同而达到萃取的目的。有机相液滴体积一 般为1-5微升，远远小于样品体积，所以可以达到 对待测物的富集。
经典分离方法——液相微萃取法
经典分离方法——液相微萃取法
连续流动液相微萃取法（CFME）是在直接液相 微萃取方法上改进而来。先用泵将被萃取的水溶 液充满PEEK管以及萃取单元的玻璃容器中，再将 所需体积的有机溶剂用微量注射器从玻璃容器的 注射口注射到样品水溶液中，并在针尖形成液滴 悬挂，在蠕动泵的作用下，不停流动的水溶液不 断与有机液滴接触，分析物不断被富集到微滴中， 萃取完成后将有机液滴吸回，直接进样分析。
待分离的一相称为被萃相，萃取后成为萃余相，用 做分离剂的相 称为萃取相。
经典分离方法——液-液萃取法
被萃取组分在萃取相中的溶解度要大于被萃取 相。
一般一相为水相，一相为有机相。在水相中增 加盐离子浓度可以降低有机相在水中的溶解度。
萃取应采用少量多次原则。 从水相中萃取有机物质时，单级萃取时一般选
根据悬挂液滴位置的不同可以分为直接液相微萃取 (D-LPME) 和顶空液相微萃取(HS-LPME) ；
根据操作方式的不同可以分为静态液相微萃取( SLPME) 、动态液相微萃取(D-LPME) 和连续流动 液相微萃取(CFME) ；
3细胞破碎与胞内产物的溶解
• 概述
红面包霉菌( 红面包霉菌(Neurospora crassa)细胞壁结构示意图 crassa)
•最外层 是α-和β-葡聚糖 最外层(a)是 和 葡聚糖 最外层 的混合物； 的混合物； •第2层(b)是糖蛋白的网状 第 层 是糖蛋白的网状 结构， 结构，葡聚糖结合到蛋白 质结构中； 质结构中； •第3层(c)主要是蛋白质； 主要是蛋白质 第 层 主要是蛋白质； •最内层 主要是几丁质， 最内层(d)主要是几丁质， 最内层 主要是几丁质 几丁质的微纤维嵌入蛋白 质结构中。 质结构中。 红面包霉菌细胞壁的结构示意图
概述
各种微生物细胞壁的结构与组成
概述
• 概述
植物细胞壁的化学组成和结构
• 对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生 壁和次生壁两部分。 壁和次生壁两部分。 • 初生壁是细胞生长期形成的。 初生壁是细胞生长期形成的。 • 次生壁是细胞停止生长后 ， 在初生壁内部 次生壁是细胞停止生长后， 形成的结构。 形成的结构。
• 概述
真 核 细 胞
• 概述
细胞器(organelle) 细胞器(organelle)
• 概述
细胞膜的结构
• 概述
细胞壁的组成和结构 （细菌肽聚糖结构示意图）
• 概述
• 几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖 几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖 （peptidoglycan）组成，它是难溶性的聚糖链 ）组成，它是难溶性的聚糖链 ），借助短肽交联而成的网状 （glycan chain），借助短肽交联而成的网状 ）， 结构，包围在细胞周围， 结构，包围在细胞周围，使细胞具有一定的形 状和强度。 状和强度。 • 短肽一般由四或五个氨基酸组成，如L-丙氨酰 短肽一般由四或五个氨基酸组成， -D-谷氨酰-L-赖氨酰-D-丙氨酸。而且短肽中 谷氨酰- 赖氨酰- 丙氨酸。 常有D 氨基酸与二氨基庚二酸存在。 常有D-氨基酸与二氨基庚二酸存在。
第三章 细胞分离与胞内产物的溶解
31
n
n
超声波破碎是细胞破碎中的一种普通方法，在许多实 验室研究或生化物质的分离制备中都能见到，但是要 向大量细胞悬浮液中通入足够的能量是很因难的，故 在工业范围中还未采用这种破碎方法。 一般来讲杆菌比球菌易破碎，革兰氏阴性菌较阳性菌 易破碎，对酵母菌的效果较差。
32
不同机械破碎方法的比较
技术
匀浆法 (孔型)
原理
效果 成本
举例
珠磨破 碎法
超声波 法 研磨法 匀浆法 (片型)
须使细胞通过的小 剧烈 适中 细胞悬浮液大规模 处理 孔，使细胞受到剪 切力而破碎 细胞被玻璃珠或铁 剧烈 便宜 细胞悬浮液和植物 珠捣碎 细胞的大规模处理 用超声波的空穴作 适中 昂贵 细胞悬浮液小规模 用使细胞破碎 处理 细胞被研磨物磨碎 适中 便宜 细胞被搅拌器劈碎 适中 适中 动物组织及动物细 胞
27
3）超声波破碎
超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波 振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞 悬浮液。 超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介 质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。 超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超 声波的声频、声能有关。
28
超声波破碎的机理
高压匀浆器的操作温度上升约２-３℃/10MPa 为了控制温度的升高，0℃左右。 可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方 式。 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎 的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用 多次循环的操作方法。
19
高压匀浆法适用的范围
革兰氏 阴性细菌 10-13 nm
酵母菌 100-300nm
真菌 霉菌 100-250nm
层次
n
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超声波破碎是细胞破碎中的一种普通方法，在许多实 验室研究或生化物质的分离制备中都能见到，但是要 向大量细胞悬浮液中通入足够的能量是很因难的，故 在工业范围中还未采用这种破碎方法。 一般来讲杆菌比球菌易破碎，革兰氏阴性菌较阳性菌 易破碎，对酵母菌的效果较差。
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不同机械破碎方法的比较
技术
匀浆法 (孔型)
原理
效果 成本
举例
珠磨破 碎法
超声波 法 研磨法 匀浆法 (片型)
须使细胞通过的小 剧烈 适中 细胞悬浮液大规模 处理 孔，使细胞受到剪 切力而破碎 细胞被玻璃珠或铁 剧烈 便宜 细胞悬浮液和植物 珠捣碎 细胞的大规模处理 用超声波的空穴作 适中 昂贵 细胞悬浮液小规模 用使细胞破碎 处理 细胞被研磨物磨碎 适中 便宜 细胞被搅拌器劈碎 适中 适中 动物组织及动物细 胞
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3）超声波破碎
超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波 振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞 悬浮液。 超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介 质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。 超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超 声波的声频、声能有关。
28
超声波破碎的机理
高压匀浆器的操作温度上升约２-３℃/10MPa 为了控制温度的升高，0℃左右。 可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方 式。 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎 的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用 多次循环的操作方法。
19
高压匀浆法适用的范围
革兰氏 阴性细菌 10-13 nm
酵母菌 100-300nm
真菌 霉菌 100-250nm
层次
暨南大学徐明芳-第三章细胞的破碎和分离_20...
3.3 细胞破碎技术—匀浆法
2)、液体剪切法(最常用的方法之一)
操作
JJ-2组织捣碎匀浆机
高压匀浆法是液体剪切破碎方法中的一种。它的主要设备是 高压匀浆机，
高压匀浆法是液体剪 切破碎方法中的一种。 它的主要设备是高压 匀浆机，它有一个高 压位移泵和一个可调 节进料速度的针形阀 （见图）。当菌体悬 浮液经过高压泵加压 后，通过阀芯与阀座 之间的通道时，悬浮 液突然改变方向，向 球撞击。在通过阀门 时产生高剪应力，向 环撞击时产生巨大的 冲击力，将细胞破碎， 然后排出 高压匀浆机的排出阀装置
3.1 分 类
物理法 化学法
固体剪切法(珠磨法) 液体剪切法
撞击法 超声法 渗透法
酶溶法 化学降解法（酸碱法）
表面活性剂法 有机溶剂膨胀法 萃取法
3.1节回顾一下细胞壁的结构。从中可知，在大规模 生产中，细胞破碎方法是十分有用的。
我们很容易将这些方法划分为两大类，化学法和机 械法。 化学法我们将在后面作详细介绍，有渗透冲击法、 表面活性剂增溶法或有机溶剂溶解法。这些化学法 较温和，细胞破坏后产物也不会不可逆的变性，规 模也容易放大：如果需要处理10倍量的生物有机体， 只需要加入10倍的化学药品剂量。
3.3 细胞破碎技术
计算
服从一级反应定律 式中，R为pro释放量，Rm为pro最大释放量.
影响因素
操作压力p：p, R ;相反, R 。温度 2C /10MPa 。 破碎次数N：N，R 。 温度：比速度k与温度有关，温度25C，k1.5倍。 细胞抗破碎系数a：a酵母=2.9，a大肠杆菌 = 2.1。 细胞种类：影响k值。 细胞浓度： Z：常数，p0：破碎所需的最低压力，：细胞浓度的参数。
3.3 细胞破碎技术
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细胞悬浮液自高压室针 形阀喷出时，每秒速度 高达几百米，高速喷出 的浆液又射到静止的撞 击环上，被迫改变方向 从出口管流出。细胞在 阀杆 这一系列高速运动过程 阀座 撞击环 阀杆 中经历了高速剪切、碰 压力控制手轮 撞及压力骤降，造成细 APV Manton Gaulin 高压匀浆器针型阀结构 胞破碎。
革兰氏 阴性细菌 10-13 nm
酵母菌 100-300nm
霉菌 真菌 100-250nm
层次
单层
多层
肽聚糖 (5-10%) 脂蛋白 脂多糖(11-22%) 磷脂 蛋白质
多层
葡聚糖(30-40%) 甘露聚糖(30%) 蛋白质(6-8%) 脂类(8.513.5%)
多层
多聚糖 (80-90%) 脂类 蛋白质
16
标准阀
细胞破碎阀
锯齿阀
刀型阀 锥型阀 球型细胞破碎阀 高压匀浆器各种阀型设计
17
高压匀浆器的种类
高压匀浆器的种类较多：
WAB公司的AVP Gaulin 31MR型 Bran and luebbe 公司SHL40型 意大利Niro Soavi
第三章 微生物细胞破碎
1
生物分离过程的一般流程
原料液 原料液 细胞分离 ( 细胞分离 ( 离心，过滤 离心，过滤 )) 细胞－胞内产物 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲 加盐酸胍、脲 ) 复性 细胞破碎 碎片分离 碎片分离 粗分离( 盐析、萃取、超过滤等 盐析、萃取、超过滤等 ) 纯化( 层析、电泳 层析、电泳 ) 脱盐( 凝胶过滤、超过滤 凝胶过滤、超过滤 ) 浓缩( 超过滤 超过滤) 精制( 结晶、干燥 结晶、干燥 )
9
真菌的细胞壁
真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次 还含有较少量的蛋白质和脂类。 不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同， 其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚 糖构成，少数含纤维素。 与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的 强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此， 它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所 以强度有所提高。
2
路线一
路线二
清液－胞外产物
路线一A
本章内容
本章的主要内容
常见的细胞壁结构
细胞破碎技术
包涵体的纯化方法
3
概述
n
n
n
n
微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数小分子代谢产 物，以及细菌产生的碱性蛋白酶、霉菌产生的糖化酶、淀粉 酶等等，称为胞外产物。 但有些目的产物存在于细胞内部，如大多数的酶、蛋白、类 脂等，称为胞内产物。 自80年代以来，基因工程广泛应用，许多具有重要价值的生 物产品应运而生，如胰岛素、白细胞介素、干扰素等。许多 基因工程产物都是胞内产物，分离提取这些产物时，首先必 须将细胞破碎，使产物释放，才能进一步提取分离。 因此，破碎技术已引起了基因工程专家和生化工程专家的极 大关注。
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。 通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎 通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎
机械破碎 物理破碎
捣碎法 研磨法 匀浆法 超声法 温度差破碎法 压力差破碎法 有机溶剂： 表面活性剂： 酸碱 自溶法 外加酶制剂法
主要 肽聚糖(40-90%) 组成 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖(1-4%)
12
3.2 细胞破碎技术
破碎方式 机械法 非机械法
固体剪切 作用 压榨 研 磨
液体剪切 作用 高 压 匀 浆 超 声 破 碎
干燥 处理 酶溶法
溶胞 作用 化学法 物理法
珠磨法
13
细胞破碎方法及其原理
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
10
红面包霉菌细胞壁具有同心圆层 状结构主要存在三种聚合物 最外层 (a) 是α- 和β- 葡聚糖的 混合物， 第2层(b)是糖蛋白的网状结构 第3层(c)主要是蛋白质， 最内层(d)主要是几丁质。
红面包霉菌细胞壁的结构示意图
11
细胞壁的组成和结构
微生 物 壁厚
革兰氏 阳性细菌 20-80 nm
4
概 述
细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破
坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产 物成分释放出来的技术。
细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌
型生化物质（产品）的基础。
为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了
解各种微生物细胞壁的组成和结构。
5
3.1 细胞壁结构对破碎的影响
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。
6
细菌细胞壁结构
14
化学破碎
酶促破碎
一、机械法
机械破碎法又可分为 高压匀浆破碎法（homogenization） 高速珠研磨破碎法（bead grinding） 超声波破碎法（ultrasonication）
15
1.高压匀浆法 （High-pressure homogenization）
采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。
药物名称
胰岛素
宿主
大肠杆菌
用途
治疗糖尿病
人生长激素
α-干扰素
大肠杆菌
大肠杆菌
治疗侏儒病
治疗毛状细胞白血病等
8
酵母细胞壁的结构示意图
最里层是由葡聚糖的细纤维 组成，它构成了细胞壁的刚 性骨架，使细胞具有一定的 形状， 上面的是一层糖蛋白， 最外层是甘露聚糖，由 1,6磷酸二酯键连接成网状。在 该层的内部，有甘露聚糖 酶的复合物。 破碎酵母细胞壁的阻力主要 决定于壁结构交联的紧密程 度和它的厚度。
几乎所有细菌的细胞壁都是 由肽聚糖组成，它是难溶性 的聚糖链； 相邻聚糖链上的短肽又交叉 相联，构成了细胞壁的三维 网状结构，包围在细胞周围；
使细胞具有一定的形状和强 度。
7Leabharlann 细菌细胞壁结构
破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构， 其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存 在的肽键的数量和其交联的程度。 革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大 不同。 革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种 细胞生产了很多细胞重组的产物。