大豆NBS类抗病相关基因的克隆与序列分析

大豆NBS 类抗病相关基因的克隆与序列分析

①

杨秀红②　陈庆山③　杨庆凯　李文滨③

(东北农业大学大豆研究所　哈尔滨150030)

摘　要　根据拟南芥RPS 2基因、烟草N 基因和亚麻L 6基因的保守结构域设计简并引

物,采用RT 2PCR 方法从大豆抗疫霉根腐病品种绥农10号的RNA 中扩增获得两个通读的大豆NBS 类抗病基因同源片段RN E AU 21和RN E AU 22,长度均为513bp ,编码171个氨基酸。以RN E AU 21为靶序列,采用RACE 方法获得了全长3574bp 的大豆抗病相关基因SR 1,该基因包括3411bp 的开放读码框,72bp 的5′非翻译区(non 2translated region ,NTR ),68bp 的3′非翻译区和20bp 的多聚腺苷酸尾。编码1137个通读的蛋白质氨基酸序列,基因编码产物具有TIR 、NBS 、LRR 、H D (conserved domain 1)和conserved domain 2等一系列抗病基因的保守结构域。同源性比较和序列分析显示,该基因为大豆中TIR 2NBS 2LRR 类抗病相关基因。S outhern 杂交结果表明,SR 1基因(或其同源基因)在大豆中具有2～4个拷贝。RT 2PCR 检测表明,SR 1基因在大豆中为低丰度组成型表达,其表达不受病原菌接种和水杨酸的诱导,亦无组织特异性。以绥农10号基因组DNA 为模板扩增得到长度为3972bp 的SR 1基因转录区核苷酸序列,其结构包含5个外显子和4个内含子。SR 1基因在G enBank 上的登录号为AY 193892。

关键词　大豆,NBS 类抗病相关基因,克隆,内含子

0　引言

大豆是具有重要经济价值的油料作物和粮食作物,病害造成大豆产量和品质严重下降,因此,培育抗病优良品种是大豆育种的重要目标。生物技术的发展和完善,使得许多植物的抗病基因得以分离,目前已经从植物中分离了30多个抗病基因[1,2],为获得抗病优质转基因植物奠定了基础,对探究抗病机制也具有重要意义。

经典的植物抗病基因分离方法主要为图位克隆法和转座子标签法,这两种方法适用于基因组较小的植物(如拟南芥、番茄等),而对于基因组较复杂的小麦、大豆等植物则很困难[3]。已克隆的植物抗病基因在氨基酸水平上表现出了一定程度的相似性,在一些区段高度保守[426],这一特性使得同源性克隆成为可能。同源性克隆是近年来兴起的基因分离技术,目前已广泛应用于植物抗病基因及其同源物的分离,已经在拟南芥[7,8]、菜豆[9,10]、水稻[11,12]、小

麦[13]、大麦[11,13]、番茄[14]和莴苣[15]等植物中分离

到了许多抗病基因同源片段,Fenillet 等利用该技术已经成功地分离小麦抗叶锈病基因Lr 10[16]。

与其他作物相比,大豆抗病基因的分离相对滞后,迄今为止,尚未分离到功能性大豆抗病基因,但已有一些抗病基因同源片段和少数几个抗病相关基因全长cDNA 被分离。Y u 等根据烟草N 基因和拟南芥RPS 2基因的NBS 区同源序列设计简并引物,从大豆中分离出11类含NBS 序列的基因片段[5];K anazin 等采用类似方法,从大豆中分离出9类抗病基因同源片段[4];贺超英等采用同源性克隆技术从大豆中分离出4个NBS 类抗病基因同源片段(K NBS 1、K NBS 2、K NBS 3、K NBS 4),以这4个同源片段为混合探针,筛选cDNA 文库,获得了大豆抗病相关基因全长cDNA 序列[3,17]。这些研究证明了同源性克隆技术分离大豆抗病基因的可行性。本研究根据已克隆的植物抗病基因的保守结构域设计简并引物,采用同源性克隆技术从大豆抗疫霉根腐病品种绥农10号中分离出大豆抗病基因同源片段,并通过

①②③联系人,E 2mail :qshchen @ ,wenbinli @

(收稿日期:2004207230)

女,1974年生,博士;研究方向:植物分子生物学与基因工程,E 2mail :xhyang @ 863计划(2001AA211041)资助项目。

RACE技术获得大豆抗病相关基因全长cDNA序列,并初步研究了该基因在大豆基因组中的组织结构和表达特性,为功能性大豆抗病基因的分离和遗传转化奠定了基础。

1　材料与方法

1.1　植物材料与核酸提取

大豆抗疫霉根腐病品种绥农10号种植于盆钵中,对生真叶展开后取样,采用TRI zol Reagent(Invit2 rogen)提取大豆叶片总RNA。

1.2　RT2PCR方法分离大豆抗病基因同源片段

取1μg大豆叶片总RNA,以M2M LV(Promega)逆转录RNA合成一链cDNA,PCR扩增用的5′端引物为5’2GG AATGGGIGGIG TIGGI AA(A/G)ACI AC23’,3′端引物为5’2A(A/G)IG CI A(A/G)(A/T)GG(A/C)A (A/G)ICC23’,其中I=A/G/C/T。引物根据拟南芥RPS2基因、烟草N基因和亚麻L6基因保守的NBS 结构域的P环(G MGG VGK T)和疏水结构域(G LP LA L)设计。PCR反应条件为94℃变性3mim, 94℃变性1min,55℃复性1min,72℃延伸1min,共35个循环,最后72℃延伸10min。1%琼脂糖凝胶(1xT AE)电泳分离,扩增产物采用T aK aRa公司的PCR fragment recover kit回收,回收产物用p GE M2T easy vector(Promega)进行连接转化。

1.3　5′RACE和3′RACE

以绥农10号叶片总RNA为模板,采用5′RACE System for Rapid Am plification of cDNA ends(Invitrogen)对抗病基因同源片段RN E AU215′端未知序列进行分离(操作按试剂盒说明),在RN E AU21序列5′端设计3条反向基因特异引物。3′端未知序列的分离采用3′RACE System for Rapid Am plification of cDNA ends (Invitrogen)进行(操作按试剂盒说明),在RN E AU2 13′端设计两条基因特异引物。将5′RACE、3′RACE 获得的序列与靶序列RN E AU21拼接,结合测序峰图进行序列校正,最后获得拼接好的序列。在此序列两端设计引物S1和A1,S1:5’2T AAT AATGG CTG C2 G AC AA23’;A1:5’2ATG AAGG T AGGG CG AAC A23’,再次RT2PCR扩增全长cDNA,所得片段进一步测序鉴定。

1.4　Southern杂交

将大豆绥农10号基因组DNA用6种限制性内切酶(Eco RⅠ、Eco RⅤ、Hin dⅢ、Bam HⅠ、DraⅠ和TaqⅠ)完全消化,经1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离后,转移到尼龙膜上,按照DIG High Prime DNA La2 beling and Detection Starter K it Version1(R oche)的方法用Dig oxigenin2112dUTP DIG2High Prime标记大豆抗病基因同源片段RN E AU21,以此做探针,65℃杂交16h。杂交后在室温下用2×SSC,0.1%S DS洗膜2次,每次洗10min,在65℃下用0.1×SSC,0.1%S DS 洗膜2次,每次洗15min。

1.5　转录表达检测

将大豆品种绥农10号种于盆钵中,对生真叶展开后,分别提取根、茎、叶的总RNA,用DNaseⅠ处理总RNA后,分别取等量1μg RNA用SuperScript T MⅡReverse Transcriptase逆转录总RNA合成一链cDNA,以S12A1为引物,进行RT2PCR。PCR反应条件94℃变性2mim,94℃变性30s,64℃复性30s,72℃延伸3. 5min,25个循环,最后72℃延伸7min。将另外两组绥农10号种于盆钵中,对生真叶展开后,分别接种大豆疫霉根腐病1号生理小种和喷洒水杨酸,均在处理后12、24、36、48、60、72h取样,同时取未处理的对照样,提取大豆叶片总RNA,进行RT2PCR。PCR 反应条件同上。

1.6　基因组结构分析

将大豆品种绥农10号种于盆钵中,第二片三出复叶展开后,采用S DS法提取叶片总DNA,用RNase A去除RNA污染后,以S12A1为引物进行PCR,PCR 反应条件同全长基因扩增。回收产物用p GE M2T easy vector(Promega)进行连接,采用CaCl2法转化大肠杆菌DH5α。

1.7　序列分析

测序委托上海生工和博亚公司完成。同源性检索和序列分析采用NC BI和DNAM AN等软件完成。

2　结果

2.1　大豆中NBS类抗病基因同源片段的分离

根据拟南芥抗丁香假单孢杆菌基因RPS2、烟草抗花叶病毒基因N和亚麻抗锈病基因L6中保守的NBS结构域的P环(G MGG VGK T)和未知功能的保守的疏水结构域(G LP LA L)设计简并引物,从大豆抗疫霉根腐病品种绥农10号的RNA中扩增获得了约100个克隆,从中鉴定了两个通读的大豆NBS类抗病基因同源片段,分别命名为RN E AU21和RN E AU2 2,片段大小均为513bp(图1(a)),编码171个氨基酸。它们均具有抗病基因的NBS特征结构域(P环、激酶2a和激酶3a)和疏水结构域H D(hydrophobic