第四章 基因克隆的质粒载体分析

8.质粒ＤＮＡ的分离与纯化
(1)氯化铯密度梯度离心法
(2)碱变性法
(3)微量碱变性法
氯化铯密度梯度离心法
1、质粒DNA占总DNA的1%～2%； 2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子 量的细菌染色体易断裂成线性片段，而质 粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的 状态； 3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链 的碱基中，导致链的解旋；而且形成的 EB- DNA复合物中，EB含量越高，密度会 越低。
质粒的转移与迁移.
转移一般指一个质粒独立地从一个细胞转移到另一个细胞. 迁移则指本身不能转移,在另一个接合型质粒存在下,从一个细 胞移至另一种细胞.
质粒迁移的条件（自身编码） ①bom位点(col E1) nic 位点. ②mob基因.结合动员基因.编码迁移蛋白,实质是一种核酸酶, 切割nic位点.
具有三种不同的构型：
共价闭合环形DNA(cccDNA):两条多核苷酸链均保持完整的 环形结构。DNA呈超螺旋的SC构型。 开环DNA(ocDNA)：有一条保持完整的环形结构，另一条链 出现有一至数个缺口。即OC构型。 线性分子（lDNA)：经限制性内切酶切割之后，双链断裂而 形成。称L构型。
什么是超螺旋(superhelix 或supercoil) ？ DNA是以双螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的，当双螺 旋DNA的这个轴再弯曲缠绕时，DNA就处于超螺旋状态， DNA超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是DNA三级结构 的一个重要特征。
•根据质粒的表现分为:
显性质粒和隐蔽质粒
定义：质粒除了与控制本身复制和转移相关的基因外， 有的质粒还携带一些其他的基因，宿主细胞由于含有 这样的质粒而呈现出新的性状，这样的质粒称为显性质 粒。 相反，即使宿主细胞含有某种质粒，但无异样性状表露， 这样的质粒称为隐蔽质Biblioteka Baidu。 受检测手段的限制，现定为隐蔽型的质粒未必是真正的 隐蔽质粒。
迁移作用(mobiligation): 由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程.
从基因工程安全角度考虑，接合型质粒不宜作为克隆载体。
因为从理论上存在着发生使ＤＮＡ跨越生物种间遗传屏障 的潜在危险.
而利用迁移作用可能将非接合型质粒从一种细胞转移至另 一种细胞,这种方法叫三亲杂交法.
一般将受体菌、供体菌及辅助转移菌 三者共培养过夜.
流程：
1、取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在 微量离心管中，离心收集细胞沉淀； 2、加入100微升冰冷的液，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA，4~5mg 溶菌酶）静置5分钟； 3、加入200微升微冷的液（0.2NaOH， 1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟。 65度水浴一段时间会加强染色体DNA的变性作用。 4、加入150毫升冰冷的PH=4.8的3M醋酸钠，振荡 后，冰浴5分钟。 5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收 集质粒DNA。
大多数质粒都会产生出一种控制质粒复制的阻遏蛋白质， 其浓度与质粒的拷贝数成正比。
阻遏蛋白通过同其靶序列间的相互作用，使双链ＤＮＡ 中的一条断裂从而导致质粒ＤＮＡ复制的启动。并建立起一 种调节质粒拷贝数的负反馈环。当质粒面临高拷贝数和高 浓度的阻遏蛋白时，其复制活动便被抑制了。反之，复制 反应继续进行。
根据质粒的转移功能分类
按接合转移功能分 类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因 自主复制基因，抗菌素抗性基因
按抗性记号分类
Col质粒 R质粒(R因子)
接合型质粒
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区 F质粒（ F因子） 段 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基 Col质粒 因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基 R质粒(R因子) 因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基 Ent质粒 因
在基因工程中得到大量的应用.
重 组 质 粒
受 体 细 胞
接 合
供 体 细 胞
辅 助 质 粒 D N A 转 移
三亲杂交法
•根据质粒的性状特征，可分为五种不同的类型：
F(Fertility)质粒: Ｒ(Resistance)质粒 Col质粒 降解质粒（Degradative plasmids） 致瘤质粒（Virulence plasmids）农杆菌Ti质粒
另外两种质粒（psc101和p15A）的复 制子的复制受质粒上编码的蛋白因子的正
调节。氯霉素抑制蛋白质合成后，这类质
粒便不能持续复制。
质粒复制控制的分子模型
抑制蛋白稀释模型 阻遏蛋白在低浓度时处于单体状体，高浓度时处于多体 状态。只有多体状态具有活性
自体阻遏蛋白质模型
阻遏蛋白具有自体阻遏活性。
7、质粒的不相容性(不亲和性)
质粒绝大多数是环形双链的DNA
但也存在有线形质粒 、RNA质粒（酵母的杀伤质粒） 质粒DNA分子可以稳定存在于染色体外，呈游离状态,有 一些质粒在一定条件下能可逆地整合到寄主染色体上，随 染色体的复制而复制,称为附加体。
3.环形双链DNA质粒分子组成与构型 多数为双链环状DNA分子. 分子量从不足2kb 到100kb以上,多数为10kb左右.
根据其复制或存在 方式可分为:
自主复制型载体和
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第四章 基因克隆的质粒载体
一、与构建克隆载体相关的质粒性质
质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制 的遗传成份. Plasmid一词由Joshua Lederberg于1952年提出。
质粒的命名:
例:pBR322 p代表质粒; “BR”代表两位研究者 Bolivar和Rogigerus 姓氏的字首,“322”是实验编号 .
基因克隆载体系统
•质粒载体
•噬菌体载体
•柯斯质粒载体
•单链噬菌体载体
•噬菌粒载体
•染色体定位整合载体
•人工染色体载体
•其它特殊用途载体
一、基因工程四大要素：
目的基因
工具酶
克隆载体 受体系统
二、为什么要用克隆载体？
• 单独的基因不易进入细胞 • 进入后不能维持. 三、什么是克隆载体？
vector 通过不同途径能将承载的外源DNA片段带 入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分 子称为DNA克隆载体或基因克隆载体。
与一个起始点相连而没有被终点隔断的任何序列, 都是作为复制子的一部分而被复制. 起始点是一种顺式作用位点,只能作用于该位点所 在的DNA分子.
质粒的拷贝数定义: (1) 通常定义:生长在标准培养条件下(LB培养基)每个细菌细胞 中平均所含有的质粒的拷贝数. (2) 特殊定义:在营养富有余的培养基中,每个细胞当中每条 染色体所拥有的平均质粒DNA分子数.
质粒拷贝数还与寄主状况有关。
即同一种质粒在不同的寄主类型中可能属于严紧型的，也 可能属于松驰型的。
如ColE1-K30在大肠杆菌中属于松弛型的,在奇异变形杆菌 中是严紧型的。
氯霉素扩增:
pMB1或ColEI类质粒复制子的复制完全依靠 宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白因子 （DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、 dnaC、dnaD、dnaZ的产物），因此在蛋白质合成 中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素 抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有 pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大 量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝， 这叫做氯霉素扩增。
4.必须是安全的。
五、克隆载体的种类
根据来源可分为：
质粒载体
病毒或噬菌体载体 质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的克隆载体 质粒DNA与染色体DNA片段组成的克隆载体等
根据用途可分为： 表达克隆载体 启动子探针型载体 cDNA克隆载体等
根据应用对象可分为： 原核生物克隆载体、植物克隆载体和动物克隆载体等。
1. 质粒的特点： •已在形形色色的细菌类群中发现，大多数质粒的宿主范围 较窄，只能生存于亲缘关系很近的少数细菌种类中。 •是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。 •已进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝 并将质粒分子精确地分配给子代细胞。
•其复制和转录或多或少依赖于宿主编码的酶和蛋白质。
严紧型（stringent plasmid) 份的拷贝。
松弛型（relaxed plasmid) ６０份的拷贝。
每个寄主细胞中仅有１－３
每个寄主细胞中仅有１０－
一般接合型的质粒是严紧型，具有较高的分子量。而非 接合型的质粒是松驰型的，具有较低的分子量。例外，接合 型的质粒Ｒ6K分子量较小，为松驰型。
•常常含有一些编码对细菌宿主有利的基因。 这些基因可赋予宿主迥然不同的特征，其中不少具 有重要的医学和商业价值。由质粒产生的表型包括产生 抗生素、大肠杆菌素、肠毒素、限制酶与修饰酶，以及 降解复杂的有机化合物等。
质粒通过合成长 效致死物和短效 解毒剂得以在细 菌中生存.
2.质粒的生物学特征
只能在在寄主细胞内独立增殖，随寄主分裂而遗传。 自然界中，无论是真核生物还是原核生物细胞，甚至真菌的 线粒体中都发现有质粒的存在。
5、 质粒的类型
•根据分子特性，革兰氏阴性细菌的质粒可分为两种
接合型 又叫自主转移的质粒 具有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一套 控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
可以在不同细胞间转移。
非接合型的质粒 不能自我转移的质粒，失去控制细菌配对和质粒接合 转移的基因。 不能自主转移。
F质粒的tra区包含细菌接合所需的基因
正超螺旋(positive supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方同相同 负超螺旋(negative supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反
4. 作为克隆载体质粒的条件
适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必须包括 三种共同的组分： 复制子 选择性标记基因 克隆位点 基因克隆载体还需要满足具有较小的分子量和较高的拷贝数
(3) <基因工程原理>中定义: 在LB液体培养基中生长的每个细胞,如果具有20个及以上的 质粒DNA分子,就叫高拷贝质粒,如果低于20个则叫低拷贝质 粒.
质粒中已鉴定的复制子已逾30个，但分子克隆中常用的几 乎都带有一个来源于pMB1的复制子，可使每个细菌细胞中维持 １５－２０个拷贝。 质粒就其复制方式而言分为两类：
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠 （SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。 将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。 在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。 在PH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA 会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变 性。 通过冷却或恢复中性PH值使之复性，线性 染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅 速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有 cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质 粒DNA
•人工构建的质粒根据其功能及用途分为:
(1) 多拷贝质粒 (2) 测序质粒 (3) 整合质粒 (4) 穿梭质粒 (5) 表达质粒 (6) 探针质粒
6、质粒的复制
质粒的复制子决定其拷贝数。
复制子是一个遗传单位，包括DNA复制起点,相关的 调控元件,复制终点。
复制起点是一段特定的DNA片段，长约几百碱基对，其相关 的顺式作用调控元件中含有参与DNA合成起始的由质粒或宿 主编码的可扩散因子的结合位点。 定义：质粒DNA中能自主复制并维持正常拷贝数的一段最小 的核酸序列单位。
载体具有如下功能:
1.运送外源基因高效转入受体细胞
2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件
四、作为克隆载体的DNA分子必须具备主要条件：
1.有1至多个克隆位点，供外源DNA片段组入克隆载体DNA分子。 2.能自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而 同步复制。 3.必须具有用于选择克隆子的标记基因。
指在没有选择压力下，两种亲缘关系密切的不同质粒， 不能够共存于同一个寄主细胞系中的现象。 只有当两种质粒在同一寄主细胞中都不受限制时，才能判断。 亲缘关系较近的质粒，彼此之间互不相容，它们属于同 一种不亲和群。 大肠杆菌质粒中至少已鉴别出３０种以上的不亲和群。
质粒不相容性现象与质粒的拷贝数及分离的调控有关。 携带相同复制子的不同质粒属于同一不相容组。带有 不可互换成分的复制子的质粒则属于不同的不相容组。