石蜡切片法
石蜡切片法的原理及应用
石蜡切片法的原理及应用1. 石蜡切片法的原理•石蜡切片法，也称为石蜡切片技术，是一种常用于生物组织切片和植物切片的方法。
它是将生物样本或植物材料浸泡在石蜡中，并使用切片机将其切割成薄片的技术。
石蜡切片法的原理基于石蜡的特性和切片机的工作原理。
•石蜡是一种固态蜡状物质，具有良好的可模塑性。
它的熔点较低，在55-60摄氏度范围内熔化，使得将样本浸泡在石蜡中能够快速固化和切割。
切片机通过旋转刀片和样本的移动来切割石蜡固化后的样本，从而得到薄片。
•石蜡切片法的原理包括以下几个步骤：–样本固定：将生物组织或植物材料固定在切片床上，通常通过福尔马林等化学物质进行固定。
–组织处理：将固定后的样本进行去水化和脱脂处理，以去除水分和脂肪等物质，使样本更易于渗透和固化。
–石蜡浸渍：将处理后的样本浸泡在石蜡中，使石蜡渗透到样本组织中，并使其固化。
–切片制备：将石蜡固化的样本放置在切片机上，通过旋转刀片和样本的移动来切割石蜡，得到薄片。
–切片染色：将薄片固定在载玻片上，并进行染色处理，以增强样本的可视化效果和对细胞结构的观察。
2. 石蜡切片法的应用•石蜡切片法在生物医学研究、临床医学和植物学等领域具有广泛的应用价值。
以下是石蜡切片法的一些主要应用：2.1 生物组织切片•生物组织切片是石蜡切片法最常见的应用之一。
通过石蜡切片法可以将生物组织固化并切割成薄片，用于观察和研究组织的结构和功能。
生物组织切片可用于研究疾病的病理学特征、细胞增殖和分化等过程。
2.2 病理分析•石蜡切片法在病理学方面具有重要的应用。
通过切割和染色石蜡切片，可以观察到细胞核、细胞质和细胞间质等组织成分的细微结构，实现对肿瘤、感染和其他疾病的病理分析和诊断。
2.3 细胞学研究•石蜡切片法可用于细胞学研究，通过切割和染色石蜡切片，可以观察细胞的形态、结构和功能等特征，对细胞的增殖、分化和凋亡等过程进行研究。
细胞学研究在癌症和其他疾病的研究中具有重要的意义。
石蜡切片法
石蜡切片法在显微镜下观察植物体内部的细微结构之前,必须根据植物材料的特性,采用不同的方法,对植物材料进行处理,把材料制成透明的玻片标本.根据材料的性质和制作法的不同,常用的植物显微制片技术可以分为切片法与非切片法两大类,前者常用的有徒手切片法,冰冻切片法,火棉胶切片法,石蜡切片法,冷冻切片法等,其中以石蜡切片法最为常用.后者包括整体封藏法,涂布法,压片法等.石蜡切片法石蜡切片法是以石蜡作包埋剂,用旋转切片机将材料切成薄片,经一系列处理制成永久制片的方法.在研究植物的细胞,组织,胚胎以及形态等方面石蜡切片法是最理想的制片方法.石蜡切片法的一般流程为:取材→固定→抽气→洗涤→脱水→透明→浸蜡→包埋→修块→切片→粘片→染色→封片.取材用锋利的刀片切取新鲜的植物材料,选定适宜的材料,立即固定.取材的注意事项如下:(1)取材料要新鲜.动作要迅速,以免挤压损坏组织;取病理材料时,应设置对照材料.(2)所取材料大小要适当:根和茎一般直径≤5mm,切取成5-10mm小段;叶片一般取过中脉处,切成2-5mm宽,5-8mm长.在切材料时,必须注意刀片与中轴成直角,两切面平行,否则制成的切片细胞是斜的.雌,雄蕊一般不需分割.(3)取材时间可根据切片要求有所区别.如:在进行植物发育的研究过程时,需要找到细胞分裂相,一般在晴天的早晨9:00-10:00时取材,此时植物细胞分裂活动较明显.(4)取材不易过老,否则制片有难度(过老的材料须在滑走切片机上进行);对纵切的材料适当多取材,如根尖,茎尖等,因为切到材料正中的概率较低.(二)固定将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液中.借助固定液的作用,使细胞的新陈代谢瞬时停止,并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变化.从而达到使组织变硬从而便于切片,增强内含物的折光度,令细胞易于着色的目的,同时具有防腐作用.以新鲜配制固定液效果较好.固定的时间依材料的种类,性质,大小等而定.材料固定完毕,保存于加盖的容器内,贴上标签.良好的固定剂,应是穿透力强,使细胞立刻致死,原生质全部凝固;不发生任何变形,增强折光率,并且不妨碍染色.常用固定液:简单固定液以一种化学药品配制的固定液.⑴乙醇为凝固型固定剂.常用无水乙醇或95%乙醇.⑵甲醛为非凝固性固定剂.具强烈刺激性气味.纯净的甲醛为无色透明液体.固定用的浓度为4%-10%.⑶醋酸为凝固型固定剂.为无色透明的液体,刺激性极强,低温下凝结成冰,故又名冰醋酸.2.混合固定液:由几种试剂,适量配制而成.混合遵循原则:①优缺点互补;②膨胀与收缩相互平衡;③强氧化剂与还原剂应分别配置.常用混合固定液有下列几种:⑴FAA固定液(福尔马林-冰醋酸-乙醇)广泛适用于根,茎,叶,花药,子房的组织切片,所以又称为万能固定液.一般固定时间不低于24h.该固定液优点是在较低温度下(10℃左右)适用于材料的长期保存,可兼作保存液.并且固定的材料,不妨碍染色,但用于细胞学上的固定效果较差.⑵纳瓦兴(Navaschjn's)固定液1912年首创.适用于细胞学与组织学研究的切片观察.但渗透慢,不能长期保存;主要用于显示分裂相.(三)抽气植物材料内部多由于含有空气,导致固定液不能完全深入.材料投入固定液后需要立即抽气.以便让固定液有效透入材料组织中,并排除材料内气泡的干扰.一般抽气时间为20-30min.抽过气的材料在停止抽气,应沉入底部.(四)洗涤固定液中的成分有可能会妨碍染色或发生沉淀或结晶,影响观察;有的还会继续作用,使材料变质等.因此,在使用材料时,需根据固定液的种类,用水,缓冲液或70%乙醇洗去渗入细胞内部的固定液.如:用FAA固定的材料在脱水时用70%乙醇反复洗涤数次.如用水洗涤,可将材料自固定液中取出,放入指形管,加入半管水,用纱布将管口扎紧,置于水槽内,进行流水冲洗.流水冲洗时间一般为12-24h.(五)脱水材料经洗涤后含有部分水分,会使材料分解.而且透明剂与水是不相混合的,不利于材料的透明和包埋等后期处理.因此需用脱水剂逐渐除去材料中的水分,以便让石蜡渗透进细胞.所以,脱水是制片的关键环节.脱水剂要求能与水混合,而且能与其他有机溶剂互相替代.脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行,防止吸收空气中的水分;在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料,以免损坏材料.(六)透明透明剂要具有既能与脱水剂相混合又能和石蜡相混合的性质,可以将材料中的脱水剂置换出来,使石蜡能顺利进入材料中.二甲苯是目前应用最广的透明剂,作用迅速,但易使材料变脆..(七)浸蜡是指逐步清除材料中的透明剂,以使石蜡充分渗透于材料内部的过程.这样,材料的各部分都能保持原来的结构与位置,切片不致发生破裂或其他变形.浸蜡是一个渐进的过程,常用的正丁醇.每次浸蜡的时间,视材料大小而调节.(八)包埋材料经过足够时间的浸蜡后,需包入蜡块,以备切片.操作方法:根据切片材料大小,确定所需纸盒的尺寸,用表面光滑的磅纸预先叠好纸盒.(九)切片即将包埋好的材料块用切片机切成所需厚度的切片带.(十)贴片是用黏贴剂把切片平铺贴在载玻片上,以便于染色和观察.常用的粘片剂有下列二种:(1)明胶黏片剂(2)蛋清黏片剂(十一)染色即根据植物细胞中不同的化学性质,用染料分别进行染色,以利于观察切片中细胞与组织的形态与构造及其内含物等.染色基本程序为脱蜡,染色,分色封片.染色方法可分为下列几类:①单染只用一种染料染色.②双重染色两种染料染色,如番红--固绿;苏木精---曙红.③多重染色多种染料染色,如番红—固绿—桔红G;酸性品红—苯胺蓝—桔红G等.(十二)封藏封藏于中性树胶中,使材料能在显微镜下清晰地显示出来,并能长期保存.方法:将含材料的载玻片放在吸水纸上(切片一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴树胶(必须在二甲苯干燥前进行),用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧,稍微倾斜使其左侧与封藏剂接触,然后再缓慢地放下,避免产生气泡.补充：注意事项：１、制片是一个连续的操作过程，往往要连续几天才能完成，因此，事先一定要制订工作日程计划，应按顺序进行工作。
石蜡切片制备方法和操作技术过程
醋酸-乙醇)、纳瓦兴(Navaschjn’s)固定液。
材料固定完毕，保存于加盖的容器内，贴上标签。
(三)抽气
植物材料内部由于含有空气，导致固定液不能完全渗入。
材料投入固定液后需要立即抽气，以便让固定液有效透入 材料组织中，排除材料内气泡的干扰。
一般抽气时间为20-30min。抽过气的材料在停止抽气后， 应沉入底部。
保持组织原有形态 熟悉要取材的部位 选择好组织的切面
• (二)固定
将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液 中，使细胞的新陈代谢瞬时停止，并保持细胞或组织的形态构 造及其内含物的状态不发生变化，使组织变硬，便于切片、着
色，同时具有防腐作用。
常用固定液：乙醇、甲醛、醋酸、液中的成分有可能会妨碍染色或发生沉淀、结晶，影
响观察；有的还会继续作用，使材料变质等，因此需要洗
去渗入细胞内部的固定液。
根据固定液的种类，需要用到不同的洗涤液，
常用的洗涤液有：水、70%乙醇或缓冲液
• (五)脱水
材料洗涤后残留的洗涤液，可能使材料分解变形，因此需用
脱水剂除去材料中的洗涤液，使组织逐渐变硬，以便让石蜡浸
在研究细胞、组织、胚胎以及微生物形态等方面石蜡切片 法是最理想的制片方法。
发 展 ：
石蜡切片技术应用已有300多年历史：
1665年，英国人胡克用来制作薄片的小刀可以称得上最早的 “切片机”； 一个世纪以后，英国植物学家John Hill设计了世界上第一台真 正意义上的切片机； 1883年，剑桥大学车间制造了一台轮转式切片机； 1894年Rudolf Jung开发了第一台能重复切片的滑动式切片机；
石蜡切片的具体步骤与做法
石蜡切片的具体步骤与做法？石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。
石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法，因此用得最多，它有很多优点：比较省时间，容易操作，可切成极薄的切片（4um以下），能制作连续切片，组织块可包埋在石蜡中永久保存。
缺点是只能用于较小的组织块，较大的组织块不易切好，容易破碎，组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。
制片时间太长。
石蜡切片的制作过程（一）材料与用具1．材料：鱼皮肤、性腺、肠、肝胰脏等。
2．用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。
（二）实验内容与步骤1．取材及固定取动物体上的小块组织成为组织块。
组织块的大小以不超过0.5立方厘米为宜。
切去组织块时动作要轻，切忌用力牵引或挟持，以免组织内部发生变化。
组织块取下后，先用先用0.85％的生理盐水漂洗以戏曲血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。
由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24小时。
如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。
材料由动物体取下后应当迅速固定，固定的目的是尽快使固定液渗入组织内部，将组织固定，以保持其原有的结构。
不同的组织应选用适当的固定液。
固定液的用量与组织块体积之比一般在20：1。
不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。
2．冲洗固定后的组织块在进行脱水前必须用流水洗去固定液。
组织块应用纱布包好，注名，放金属水洗网中用流水冲洗，甲醛固定液固定的组织一般水洗24小时，Bouins固定液固定的组织水洗24小时。
AFA固定液则不需要水洗。
3．脱水和硬化经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。
实验八石蜡切片法一
盐酸、蛋清、甘油。 • 3、材料 • 各类你感兴趣的固定标本。
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四、实验步骤
• 1、取材 • 2、固定 • 3、漂洗 • 4、脱水 • 5、透明 • 6、透蜡 • 7、包埋 • 8、修块 • 9、切片 • 10、染色
实验八 石蜡切片法
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1
一 、实验目的
• 学习石蜡切片法 • 了解组织染色原理
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2
二、实验原理
• 用石蜡渗透固化组织；
• 用碱性染料如苏木精、碱性品红等，使细 胞核着色；
• 用酸性染料如伊红、酸性品红等，使细胞 中的嗜酸性成分着色，如蛋白质。
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3
三 、实验用品
• 1、器材： • 切片机、水浴锅、染色缸、玻片、显微镜、试剂瓶、剪刀、
• 未注明时间的一律处理2-3min。
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五、作业
• 简述石蜡切片过程，绘制你所观察到的细 胞形态。
• 提交一张你认为制作较好的玻片。
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9
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பைடு நூலகம்
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取材到切片
• 取材——固定（Cannoy’s），材料厚度 2mm。
• 100%酒精——100%酒精——二甲苯:酒精 （1:1）——二甲苯——二甲苯——二甲苯: 石蜡（65℃ 1:1）——石蜡（65℃）——石 蜡（65℃），以上处理各10-30min，视材 料大小而定，最后一步石蜡20min 。
• 包埋——修块——切片——贴片
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6
脱蜡与复水
• 二甲苯——二甲苯——二甲苯/无水乙醇 (1/1)——无水乙醇 ——无水乙醇——95% 乙醇——80%乙醇——70%乙醇——50% 乙醇——蒸馏水。
组织胚胎学研究方法和技术—石蜡切片与HE染色
是最常用的经典技术
02 石蜡切片术基本步骤
取材和固定 脱水和包埋 切片和染色 封片ห้องสมุดไป่ตู้
03 HE 染色
最常用的染色方法是苏木精和伊红染色法，简称HE 染色法
原理： 苏木精（Hematoxylin）-- 伊红（Eosin）
碱性染料
酸性染料
嗜碱性
将嗜碱性物质 （本身酸性）
构具有被碱性染料着色的性质称嗜碱性。
光镜技术— 石蜡切片术和HE染色
目录
CONTENT
01 光镜技术概述
02 石蜡切片术
03 HE染色
01 光镜技术概述
应用一般光学显微镜(简称光镜)观察是组织学研究的最基本方法 放大倍数可达1500，分辨率约为0.2μm 光镜下能被分辨的微细结构称光镜结构（LM） 组织学研究需要制备能使光线透过、微细
染成蓝色
中性
细胞核中的染色质、 细胞质中的核糖体
将嗜酸性物质 （本身碱性） 染成红色
嗜酸性
细胞质、膜性结构（线粒体、溶 酶体、滑面内质网）、细胞间质
脑垂体，H&E, x400
特殊染色法
镀银染色法
醛复红染色法
活体染色法
小结
1. 组织学最常见的研究方法是采用光镜观察。 2. 石蜡切片术是光镜观察时标本制备最常用的经典技术。 3. 组织切片常用的染色法是苏木精—伊红染色法，称HE染色。 4. 凡组织结构具有被酸性染料着色的性质称嗜酸性，凡组织结
实验三 石蜡切片法
石蜡切片的流程
• • • • • • • • • • • • 1、取材 2、固定 3、组织块修整 4、洗涤 5、脱水 6、透明 7、浸蜡与包埋 8、切片与贴片 9、脱蜡、复水（水化） 10、染色 11、脱水、透明 12、封固
1.取材
动物致死方法：常用方法有麻醉法、空气栓塞法、断头
法、击头法、股动脉放血法等；无尾两栖类常用探针破 坏脑和脊髓的方法处死，鼠类可用两手（戴手套）用力 拉，使颅骨和颈椎分离而导致延髓损伤致死。
料进入组织、细胞中而不易染色。
• 复水：从第二杯二甲苯取出的切片经100%→95%→80%→ 70%→蒸馏水。在各液中停留1~5min。
方法：
二甲苯（ⅰ）→二甲苯（ⅱ）→无水酒精 → 95% → 80% 10min 10min 5min 5min 5min
→ 70%→ 蒸馏水 5min 5min
10.染色
则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度 而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。
3.组织块修整
组织块修整：经过固定后的组织有一定的硬度，此时就可以 做一些修整，但改变不要太大，只要将组织材料切取平整，
修掉一些不规则的部位；过大、过厚的组织改小、改薄。
4.洗涤
洗涤：将残余在组织内的固定液清洗干净，以免影响对组织
切片
修块
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贴片：（粘片、表片、展片）是将已切成的蜡带分割成
小段后粘贴于载玻片的过程。用粘片剂将展平的蜡片牢 附于载玻片上，以免在以后操作中材料脱落。
• 在载玻片上涂抹粘片剂，再滴蒸馏水，放上蜡带，置于 调好温度的水浴锅上铺展。将载玻片放入45℃温箱中干
燥。
9.脱蜡及复水
石蜡切片法
包埋过程中易出现的问题及解决办法
问题：包埋后的石蜡块应为均匀半透明状，有时出现白色浑浊 结晶（像雪花一样）部分，这样在切片时就有妨碍，不易切出 薄的切片。 原因：①组织内部或石蜡中混有透明剂；②脱水不干净；③石 蜡本身品质不良；④组织块移入纸盒时动作太慢，周围的石蜡 已成凝固状态；⑤冷却用水温度不够低，石蜡凝固太慢。 解决办法：属于前三个原因者应在包埋之前就须注意；属于后 二个原因者，可将包埋块再投入Ⅲ蜡中熔化后重新包埋，但必 须注意熔化包埋过的石蜡块的时间不宜过久。
脱水（常用脱水剂：乙醇；脱水原则：低浓度到高浓度）（目的？） 脱水时间：视材料的性质、大小而定 小鼠肝脏：在各级AL中停留0.5-1h； 植物叶片：在各级AL中停留2-4h； 注意：脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水；如需过夜， 则停留在70%酒精中。
二、实验步骤（2）
透明（置换） 常用透明剂：二甲苯； 透明原则：低浓度到高浓度 （½ 二甲苯+ ½ 100%酒精 二甲苯 二甲苯） 透明时间：小鼠肝脏每级停留0.5-1h；植物叶片每级停留1-3h。
染色原理－－化学作用
化学作用的主要理论根据是染色剂的性质可分为酸性、碱性和 中性染色剂，而动、植物的细胞内—般也可区分为酸性(阴离子) 和碱性(阳离子)部分。当碱性染色剂溶液中的有色部分成为阳 离子时，就能与细胞的阴离子(酸件部分)较牢固地结合，当酸 性染色剂溶液中的有色部分成为阴离子时，就能与细胞内的阳 离子(碱性部分)较牢固地结合。 例如，细胞核，尤其是核内的染色质，主要由核酸组成，是酸 性的组成成分．故和碱性染色剂(苏木精)的亲和力很强，易于 着色。细胞质含碱性物质，故和酸性染色剂(伊红、曙红)的亲 和力很大，易于着色。
甲醛－醋酸－酒精液(FAA) 50%或70％酒精 90ml 冰醋酸 5ml 甲醛 5ml 特点：过去称”标准固定液“或”万能固定液“；是 组织形态中常用的固定液；同时兼作保存液。是植物 制片技术中较为良好的固定液和保存液。除单细胞和 丝状藻类外，均可用此液固定．也通用于昆虫和甲壳 类的固定。
实验十二、石蜡切片法(一)取材、固定、洗涤、脱水
• 洗 涤:是洗去渗入细胞内部的固定液。因材料中的固 定液有的会妨碍染色；有的会发生沉淀或结晶，影响观 察；有的会继续作用，使材料变坏等。 • 脱 水：材料经洗涤后含有大量的水分，必须用脱水 剂脱尽里面的水分，以利于材料的透明和制片的保存。 因为水分会使材料分解，而且透明剂与水是不相混合的， 只有在完全无水的情况下，透明剂才能完全透入。
二、试剂与器材 1. 试 剂：10%中性福尔马林固定液、各级乙醇（50% 70%、 50%、70% 50% 70% 85%、95%、100%） 2.器 材：解剖刀、解剖针、剪刀、镊子、解剖盘、 单面刀片、培养皿、吸管、指形管、 橡皮圈、软木塞、胶布、塑刀片切取材料。 2．固定：将已切好的材料放入10%的福尔马林溶液中 固定12-24小时。固定剂一般为组织块体积的10-15倍。 3．洗涤：材料自固定液中取出，放入指形管，加入 半管水，用纱布将管口扎紧，置于水槽内，进行流水 冲洗。流水冲洗时间一般需要12-24小时。 4．脱水：材料自低浓度至高浓度的酒精进行脱水。 一般经50%、70%、85%、95%直至纯酒精。每级停留 约30分钟至1小时。如需过夜，应停留在70%酒精中。
四、注意事项 取材的注意事项： • 材料应新鲜； • 动作要迅速； • 取病理材料时，应加对照。 固定的注意事项 • 固定液以新配为好 ； • 固定的时间依材料的种类、性质、大小等而定； • 材料固定完毕，保存于加盖的容器，贴上标签。
洗涤的注意事项 • 洗涤的时间、方法视固定液的种类等而定； • 水洗时，水流不宜太急。 脱水的注意事项 • 脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行，防止吸收空气中的水分；
实验十二石蜡切片法一取材固定洗涤脱水一实验原理用于制片的动植物材料应选择新鲜的用陈腐材料制片往往不能反映材料的真正情况
生物显微技术 第一章 石蜡切片制作技术
三、包埋
是把被石蜡浸透的材料连同熔化的石蜡一起 倒入一定形状的容器内，并立即投入冷水中， 使它凝固成含材料的蜡块，以备切片。
从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋 用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯，用温镊 子夹取材料平放于纸盒底部，使之排列整齐。 将纸盒两侧的把手提起，慢慢地平放在面盆 的水面，待石蜡的表面凝固，将 纸盒慢慢 浸入水中，待石蜡完全凝固（约30分钟） 后即可取出备用。
包埋前应先把必需的用具（恒温箱、温台、纸盒） 准备好。 包埋用的镊子要先放在温箱中预热。
第五节 切片、展片和贴片
一、切 片 是把包埋好的材料块用切片机切成所需厚度的切片带。 实验程序 1. 切片前的准备工作 （1）整修：用单面刀片将蜡块四周修整平行。 （2 ）石蜡块的固着：先将蜡块用刀片切成方形或长
四、注意事项
1 透明的注意事项
使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中水 分进入； 更换透明剂，动作要迅速； 材料周围 出现白色雾状，应退回纯酒精中重新脱水。
2 透蜡的注意事项
动物材料常用的石蜡熔点为52-56ºC；植物材料 为54-60ºC。 透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；
3 包埋的注意事项
第一节 动物的选择、杀死和取材
一、动物的选择 根据实验目的选择合适的动物和组织 如：健康状况的选择 观察不同组织、器官选择不同的动物（如：
肥大细胞、肝小叶、环层小体等）
二、动物致死法 根据动物的大小、种类和观察目的不同，进
行适当的选择。 1、麻醉法 2、空气栓塞法 3、断头法 4、击头法 5、股动脉放血法 要求动作迅速、及时取材、迅速固定
植物解剖学方法-石蜡切片
常用的粘片剂为明胶粘贴剂： 甲液：明胶 甘油 1克 15毫升
蒸馏水 100毫升 苯酚
乙液：甲醛 蒸馏水
2克
4毫升 100毫升
8. 脱蜡及复水
顺序： 二甲苯→1/2 二甲苯+1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精 →85％酒精→70％酒精→50％酒精→30％酒精→水→染色 以上各级约需5～10分钟。
6. 切片
常用的切片机为轮转切片机。 通常切片厚度为8～12微米，将切好的蜡带用毛笔 轻托轻放在纸上。
7. 粘片与展片
在载玻片上涂抹粘片剂，再滴蒸馏水，放上蜡片， 至于展片台上铺展，最后用滤纸吸除多余水分， 将载玻片放入25-30℃温箱中干燥。
应将蜡片背面（光滑面）与载玻片接触粘贴。
固定组织时应注意： 保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。 固定液必须有足够的量，一般大于组织20倍以上。 抽气：使固定液尽快渗入材料内部，并排除材料内 气泡的干扰。最简单的抽气方法是将材料及固定液 10-15ml装入医用注射器中，用左手食指堵住注射器 针管吸口，右手抽气，反复多次直至材料下沉为止。 通常在冰箱中4℃存放。
3. 脱水
脱水是用脱水剂逐步取代样品中水分的过程。
酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混。 为了避免组织材料的急剧收缩，应按从低浓度到高浓度递增 的顺序进行. 50%---70%---85%---95%--100%--- 100% 每步30-60分钟左右。 （若固定液酒精浓度为70%，则直接从70%浓度酒精开始梯度 脱水） 材料如需过夜，应当停留在70%酒精中。
脱水后的材料 无水乙醇1/3 二甲苯 2/3
无水乙醇2/3 二甲苯 1/3
无水乙醇1/2 二甲苯 1/2 纯二甲苯
石蜡切片法取材与固定
石蜡切片的主要步骤： 一、取材 三、洗涤 五、透明 二、固定 四、脱水 六、透蜡与包埋
七、切片
九、染色
八、贴片
十、封藏
一、实验原理： 1、取材
指从人体或实验动物体内取下所需观察的组织 材料的过程。 材料的选择是制作切片的第一步。 用于制片的动、植物材料应选择新鲜的，用陈腐 的材料制片往往不能反映材料的真正情况。
⑤ 固定材料的容器应注明固定液、材料来源、日
期、操作者签名等，以免与其他材料混淆。
⑥ 任何固定液对人体都有损害作用，因此固定液
的容器必须密闭，以防挥发损伤器官和眼睛，
忌用手与固定剂直接接触，以免损伤皮肤。
三、常用固定液的种类
（一）单一固定液 1、酒精（C2H5OH）：无色液体，可与水任意比例 混合，是一种还原剂，不可随意与重铬酸钾、铬 酸、锇酸等混合。酒精渗透力很强，易引起组织 收缩，固定用的适宜浓度一般为70％。
3醋酸冰醋酸ch3cooh4苦味酸三硝基苯酚c6h2no23oh5重铬酸钾k2cr2076铬酸三氧化铬水溶液h2cro47四氧化锇锇酸oso48氯化汞升汞或二氯化汞hgcl2二混合固定液1卡诺carrnoy氏固定液2faa固定液醋酸酒精福尔马林混合液3波恩bouin氏固定液4秦克zenker氏固定液5纳瓦兴nawashin氏固定液四实验步骤1动物取材
2、甲醛（HCHO）：无色气体，易挥发，具有强烈 的刺激性气味，37～40％的水溶液称为福尔马林。 甲醛也是一种强的还原剂，不可与铬酸、重铬酸 钾、四氧化锇等氧化剂混合。穿透力虽不如酒精， 但不会象酒精那样引起组织强烈收缩，两者混合 使用效果更好。常用于固定和保存标本的福尔马 林浓度为5～10％。
石蜡切片的实验报告
石蜡切片的实验报告石蜡切片的实验报告石蜡切片是生物学和医学领域中常用的技术手段，它可以将组织样本固定在切片上，以便于观察和分析。
本次实验旨在探究石蜡切片技术的原理、步骤和应用。
一、石蜡切片技术的原理石蜡切片技术是一种常用的组织学研究方法，它的原理基于石蜡的透明性和稳定性。
石蜡是一种具有较高熔点的蜡状物质，具有良好的剪切性和切片稳定性。
在进行石蜡切片前，需要将组织样本进行固定、脱水和浸渍处理，使其具备适合切片的性质。
然后，将固定好的组织样本浸入石蜡中，石蜡渗透进入组织细胞中，将其包裹在石蜡中形成固定的切片。
最后，使用显微镜对切片进行观察和分析。
二、石蜡切片的步骤1. 组织样本的固定：将组织样本取出后，迅速进行固定处理。
常用的固定剂有福尔马林、乙醛等，可以使组织样本保持原有的形态结构。
2. 脱水处理：将固定好的组织样本进行脱水处理，以去除组织中的水分。
脱水过程中，需要逐渐使用浓度递增的酒精进行浸泡，使组织逐渐脱水至无水状态。
3. 浸渍处理：将脱水后的组织样本浸泡在石蜡溶液中，使其充分浸渍。
浸渍时间根据组织样本的大小和类型而定，一般需要数小时至数天。
4. 石蜡包埋：将浸渍好的组织样本放入石蜡模具中，加热使石蜡融化，将组织样本包裹在石蜡中。
包埋过程中需要控制温度和时间，以确保石蜡充分渗透到组织中。
5. 石蜡切片：使用石蜡切片机将包埋好的组织样本切割成薄片。
切片时需要调整切片机的切割速度和刀片的角度，以获得理想的切片质量。
6. 切片染色：将切好的石蜡切片进行染色处理，以增强组织结构的对比度和可见性。
常用的染色方法有血液学染色、组织学染色等。
7. 显微镜观察：将染色好的石蜡切片放置在显微镜下进行观察和分析。
通过显微镜的放大功能，可以清晰地观察到组织样本的细胞结构和组织构成。
三、石蜡切片技术的应用石蜡切片技术在生物学和医学领域中有广泛的应用。
首先，它可以用于病理学研究，帮助医生诊断和治疗疾病。
通过观察石蜡切片下的组织结构，医生可以了解病变的类型、程度和分布情况，从而制定相应的治疗方案。
石蜡切片法
2. 取材取材时，最好用徒手切片等方法，检查一下材料的内部结构是否适合需要，不理想时，再重新取材。
要点：（1）在符合观察要求的情况下，材料越小越好，体积尺寸一般不超过0.5cm。
（2）进行科研用的，材料样本数量要符合统计学的需要，并留有充分的余地。
（3）有特殊需要的材料，如茎尖纵切要看腋芽等结构的，要将材料作好标记——两侧削扁，切片时才有方向性。
（4）材料取下后要设法保持材料的新鲜。
材料取好后要立即固定。
3. 固定（FAA者可免）FAA固定液的配置：（50-70%乙醇90ml+冰醋酸5ml+37-40%甲醛（即福尔马林）5ml），常温下至少24hr或更长（视材料厚薄、大小而定）。
固定后一般的材料都可以在此液中于冰箱长期保存。
要点：①固定液的体积为材料体积的20-50倍；②固定液开始浸泡时，要对材料抽气，5. 脱水材料完成“冲洗”后，将材料上多余的水尽量除去，然后进入第一级脱水剂中。
脱水剂的浓度分为6-7级，从低到高逐级进行，每级脱水约2小时。
材料小和嫩的脱水时间可以缩短，材料大和硬（木质化程度高的）脱水的时间可以长一些，需要多总结经验。
脱水过程长，尤其是在高浓度脱水剂中的时间长，材料会变脆，不利于切片。
见下表。
注意：用FAA固定的材料，因不经“冲洗”，可以直接从2级脱水剂开始脱水。
注意：脱水剂用量不少于材料体积的5倍。
叔丁醇脱水所要求的温度，以叔丁醇不凝固材料进入无水的脱水剂中后，若脱水剂变浑浊，说明材料中的水分未脱干净，必须回到7. 浸蜡（透蜡）材料从叔丁醇脱水后进入装有适量融化的叔丁醇（恒温箱最好从36-40度缓慢升到56-60℃，透蜡的效果才好）的蜡管中，在蜡管中逐渐多次加入碎蜡（熔点48-50℃），直至与叔丁醇等体积为止（每次加蜡后都将透明剂瓶盖上，以免透明剂过渡蒸发），然后在56-60℃温箱中4-8小时或过夜。
此时必须盖紧蜡管塞，以免叔丁醇蒸发。
浸蜡用石蜡的熔点应该低于包埋用石蜡的熔点、逐渐增加石蜡的浓度、逐渐增加透蜡的温度，才能使石蜡易于慢慢透入材料。
石蜡切片和冰冻切片都适合质谱成像分析
石蜡切片和冰冻切片都适合质谱成像分析
石蜡切片和冰冻切片都是质谱成像分析中常用的技术。
它们各自具有优点，可以根据实验需求进行选择。
石蜡切片法是将组织样本固定在石蜡块中，然后用切片机切成非常薄的切片(通常在20-50微米之间)。
这种方法的优点在于其切割厚度均匀，可以提供高质量的细胞和组织的图像。
此外，由于使用的是石蜡作为固定剂，因此可以得到长期保存的切片。
石蜡切片也有其缺点。
石蜡本身是一种有机物质，可能会对某些生物分子产生影响。
石蜡切片需要经过一系列复杂的处理步骤，包括脱水、包埋、切片等，这可能增加实验的复杂性和时间成本。
相比之下，冰冻切片法则是在冷冻状态下快速切割生物组织并立即冻结以保留其完整性。
这种方法的优点在于它可以提供实时观察的活体细胞和组织结构，对于研究动态过程非常有用。
此外，冰冻切片不需要使用石蜡或其他固定剂，因此不会对生物分子产生影响。
然而，冰冻切片也有其挑战。
由于是在冷冻状态下进行切割，因此切片的质量可能受到冷冻损伤的影响。
此外，冰冻切片需要在极短的时间内完成，这可能对切片机的性能要求较高。
石蜡切片和冰冻切片都适合质谱成像分析，选择哪种方法取决于具体
的实验需求。
如果需要长期保存的高质量图像，或者需要研究静态结构和三维形态，那么石蜡切片可能是更好的选择。
而如果需要实时观察活体细胞和组织结构，或者对时间敏感，那么冰冻切片可能更合适。
石蜡切片的操作方法
石蜡切片的操作方法石蜡切片是一种常用的组织切片制备方法，用于细胞学和组织学的研究。
下面是石蜡切片的操作方法：1. 收集样本：选择要制备切片的组织样本或细胞样本。
样本可以是动物组织、植物组织或细胞培养物。
2. 选择合适的浸渍剂：石蜡切片需要将样本浸渍在石蜡之中，以固定和保护样本。
常用的浸渍剂包括甲醇、乙醇和二甲苯。
3. 固定样本：将样本固定在固定剂（如甲醛）中，以保持其形态结构。
固定时间根据样本的类型和大小而定，一般在4C下静置数小时或过夜。
4. 脱水：在一系列浓度逐渐增加的乙醇溶液中，将固定的样本从水中脱水，使其逐渐转移到纯度较高的乙醇中。
5. 渗透：将脱水的样本浸渍在二甲苯或其他有机溶剂中，使其渗透并置换乙醇。
浸渍时间根据样本的大小和组织特性而定，一般在一到数小时之间。
6. 包埋：将渗透后的样本置于石蜡中，使其完全浸润。
石蜡块可以预先加热至液态，然后将样本放入其中，或者将样本以及适量的石蜡放入模具中，然后通过加热使其固化。
7. 切片：将制备好的石蜡块放入石蜡切片机中，使用旋转切片刀将其切成薄片。
切片厚度一般为4-10微米。
8. 取片：用切片刀或镊子将切好的石蜡切片取出，并放置在清洁的显微镜载玻片或切片架上。
9. 脱脂：将石蜡切片置于加热的二甲苯或其他脱蜡剂中，使其脱去石蜡。
10. 染色：根据需要，可对石蜡切片进行染色，例如常用的血液和组织标本染色方法如伊红染色(H&E染色)。
11. 干燥：将染色的切片在室温下晾干或在加热台上加热至干燥。
最后，将切片用显微镜载玻片覆盖，并封口保存。
以上就是石蜡切片的一般操作方法，每个实验室可能会根据具体需求进行微调。
在操作过程中要注意安全，避免接触有毒溶剂和使用锋利的刀片时的切割操作。
石蜡切片方法
石蜡切片方法采样切成直径5mm以内，长5-10mm的长段杀生、固定FAA固定液中固定24小时[根尖用卡诺固定液固定，（95%酒精：冰醋酸3：1），15-30M，不超过24小时，用95%、85%酒精浸洗，每级20M，然后转入70%酒精保存]配方：福尔马林（38%甲醛）5ml 冰醋酸5ml 70%酒精90ml 可保存整染以70%、50%酒精各2~4小时，转入爱氏苏木精稀释液（爱氏苏木清原液1份，加入50%酒精及冰醋酸各半的混合液1份）中整染2-3天爱氏苏木精配制：将苏木精溶于少量酒精中，加冰醋酸后搅拌，加速其溶解加入甘油及其余酒精研碎钾矾，溶于水中并加温将加温的钾矾溶液一滴滴地加入染色剂中，并不断挥动瓶口用双层纱布包扎，放于通风处，并经常摇动，直到颜色变为紫红进即可使用，成熟时间约需2~4周以致数月之久，若加0.2g碘酸钠即可立即成熟，成熟的原液，须用瓶塞密封，置低温暗处长期保存。
[苏木精2g 冰醋酸10ml 甘油100ml 95%酒精100 ml 蒸馏水100ml 硫酸铝钾5g]水洗、返蓝蒸馏水浸洗，勤换水至无浮色渗出，再转入自来水中，换1-2次水，至样品由紫色变为深蓝色为止，共需时约1天{镜检及分色取一小块用刀片切碎后，滴一滴水，覆以盖玻片，进行镜检，要求染色体、核仁清晰，如发现染色过度，细胞核为一团深蓝色，则需以1%盐酸或45%醋酸分色至适度，再用水洗净。
脱水经15%、30%、50%、70%、85%、95%、无水、无水各级酒精，每级2-4小时，70%酒精中过夜，此为整染的步骤，复染直接进行下一步}{脱水及复染经30%、50%、70%、85%各级酒精，每级3-4小时。
含0。
5-1%伊红的95%酒精中4-6小时（可以过夜），无水酒精两次，每次2小时此为伊红复染的步骤}透明5级氯仿透明，每级2-4小时，最后一级纯氯仿两次，每次2小时，隔纸片加蜡，置36℃温箱中一天（将瓶划成五格，吸去一格液体加入一格氯仿，当5级换入后，换纯氯仿二次）浸蜡：分2-3次加入石蜡粉末，宜先少后多，每加完一次放回温箱（38-40℃）渗透、包埋经50%、75%蜡各3小时，再经A、B、C三杯纯蜡各小时，包埋（75%石蜡指75%石蜡+25%二甲苯石蜡应用3-4层桑皮纸过滤后使用）温度处理时间50%石蜡40-42℃0.5-3 H75%石蜡48-50 0.5-3H纯蜡A 56-58 20M-1H纯蜡B 56-58 20M-1H纯蜡C 56-58 20M-1H用玻璃铅笔在盒底作记号包埋纸盒先用水润湿放于玻璃片上材料倒入后用镊子拨动调整位置，表面呈薄膜凝固时可放入水中修蜡块、切片厚8μm展片、粘片、烘片镜检选取合适的材料进行粘片，展开后，置于36℃温箱中烘干粘片剂：将鸡蛋一端打开一个小口，只让蛋白慢慢流入烧杯内，用玻璃棒充分搅拌成泡沫状，然后用粗滤纸或双层纱布过滤至量筒中，经一昼夜能滤出透明的蛋白液。
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取材 固定 浸洗（冲洗） 脱水 透明 浸蜡（透蜡） 包埋
八、 切片 九、 展片和贴片（裱片） 十、 烤片 十一、 染色 十二、 封固（封片） 十三、 贴标签
一、取材
1、用锐利刀、剪剪切组织块，不可来回切割和 用力挤、压，以免损伤组织。 2、组织块大小一般为5×5×2mm。 3、切好的组织块经生理盐水清洗后可用牙签
十、 烤片 1、展片时是利用水使切片展平，但载玻片 与蜡片之间尚留有部分水分，烤干便是将水分 通过温箱加热后除去，使组织在脱蜡后依然能 够粘贴在载玻片上。若水分未烤干，则脱蜡时 组织会脱落。 2、烤干时的温度<60℃，一般以50℃较为 适当；也可置37℃温箱内烤干（约12~24hr，烤 干后蜡片在玻片上呈透明状）。烤干的时间， 以底烤去水分为原则。
四、切片发生严重皱纹： （1）蜡太软、室温过高→用冰块冰一下再切； （2）切片刀不锋利→磨刀； （3）刀的切削角过小→切刀片仅能在蜡块切削面上浮切 →改变切削角 五、蜡片裂纹： （1）切片刀口缺口刀纹； （2）刀刃不干净→干布擦； （3）蜡块中具有坚硬杂质或尘埃：石蜡过滤及修块时用
刀削去各个方面的表面蜡（纸屑）。
十三、 贴标签 切片封后，在切片的右侧贴上标签， 平放于无灰尘或放在左右的温箱中烤几天 ，待树胶干固后便可使用。 如制成的切片上，树胶过多而溢出盖 片，则可候其完全干固后，用刀片轻轻刮 去，再用纸蘸二甲苯少许将胶擦净。
七、包埋 1、目的：使组织与石蜡在硬度上适配， 以利于切片。 2、硬蜡包埋温度65℃。 3、包埋操作要快，材料吸、夹入石蜡后 轻吹使蜡表面凝结成薄膜状，即可将 其没入水中使快速、均匀、完全凝固
八、切片 1、单面刀片修整蜡块，长：宽约3：2，长边与 刀刃平行。 2、木块上先熔上一点蜡，再用烫蜡铲将蜡块牢固 地粘在木块上；之后沿蜡块四周用烧热的解剖 针烫几下，使蜡块粘牢。 3、安装，刀口与蜡块的角度<100。 4、切片：5~8m；左手用毛笔托住蜡带， 右手不断摇动切片机，获连续切片。 5、切片前，将蜡块置冰箱冷藏一下； 较硬、难切的材料，可将蜡块在甘油：50%酒 精=1：1液中半浸泡数天再进行切片。
十一、 染色
1、原理： （1） 物理作用即渗透和吸附等； （2） 化学作用： 细胞核呈酸性，易于为碱性染料（氧化苏木精） 着色； 细胞质呈碱性，易于为酸性染料（伊红）着色； 核仁一般呈碱性（大量组蛋白和少量 RNA），为 酸性染料（伊红）着色。 2、染色液： （1）氧化苏木精：已配 （2）伊红：0.1~1%的酒精溶液，95%酒精配制
挑起放入固定液，不可用镊子夹以防
组织块被损伤。 4、软组织不易切小或易变形组织不宜切小， 可先取稍大的组织块固定2~3小时，待 组织块稍变硬后再修切成薄的小块继续固定。
二、 固定 1、目的：保持细胞生活时的形态、结构，使细胞内各成分 （如蛋白质、糖等）沉淀保存下来而与生活时相仿；防 组织自溶和腐败；助染及造成折光率差异；硬化作用。 2、Bouin’s液：苦味酸饱和水溶液 75 ml 甲醛（40%） 25 ml 冰乙酸 5 ml
六、切片厚薄不匀： （1） 加滑油；（2）螺丝要柠紧；（3）切削角不适宜。
七、切片中组织与蜡分离：透蜡不足，从新浸蜡、包埋。
九、 展片和贴片（裱片） 1、清洗玻片：95%酒精（或95%酒精和盐酸20：1浸泡一夜 除油污，用水冲洗后放入95%酒精）浸泡数小时后用白细布擦干 备用。 2、粘片剂——蛋白甘油： 新鲜蛋白25ml+甘油25 ml+0.5g麝香草酚或石炭酸→100 ml 量筒中，用力振荡使成泡沫→纱布过滤，储存于玻璃瓶中 1~2月 ；使用原液或用蒸馏水1：1稀释后再用。 3、操作：取洁净玻片→用手指抹上一薄层粘贴剂于玻片中 间成一薄层→滴加数滴DW→用刀片切取蜡带选择合适段落，切 片按序自上而下，自左而右排成几行，两端排齐（面积<S盖玻片） →将蜡片放于玻片水面上（蜡带背面较亮、光滑，正面较暗、粗 糙→应将背面与玻面接触，便于展平和贴紧）→将带有蜡片的玻 片放于展片台上，蜡片因受热而伸展（但勿加热过度，使蜡条熔 化，损坏组织；蜡下有气泡必须除去）→展平后用解剖针把蜡片 固定于合适位置上→倾去多余水待切片干后（防蜡片随水倒去） →烤干。
3、染色过程： 二甲苯Ⅰ2~5min→二甲苯Ⅱ2~5min→酒精：二甲苯（1：1 ）5min→100%酒精2min→95%酒精2min→90%酒精2min→80%酒 精2min→70%酒精2min→50%酒精2min→DW2min→苏木精染色 8~15min→自来水冲洗15min，防脱落→50%酒精2min→70%酒精 2min→80%酒精2min→90%酒精2min→0.5%的伊红溶液（95%酒 精配制）数秒~1min→95%酒精Ⅰ2min→95%酒精Ⅱ2min→100% 酒精Ⅰ2min→100%酒精Ⅱ2min→酒精：二甲苯（1：1）2min→ 二甲苯Ⅰ2min→二甲苯Ⅱ2min 4、酒精和二甲苯使用时间过久，浓度会下降，应更换新液 。更换各级酒精时，无须全部更换。可将各级酒精或二甲苯依次 降一级使用，如将第一缸95%酒精降为90%酒精、第二缸无水酒 精降为第一缸无水酒精，那么只要将第二缸无水酒精更换成新液 即可。
(1)95%与100%二级中<2hr，以防组织变硬、脆化；
（2）盛纯酒精的缸子的盖子边缘可涂一层凡士林以防吸收 空气中的水分； （3）纯酒精中如有水分用灰白无水CuSO4(滤纸包卷)吸去。 （4）脱水过程如需过夜应停留于70%酒精中。
五、 透明 1、二甲苯作脱水剂和石蜡的媒介，取代酒精，便 于石蜡渗入组织，利于包埋、切片且能与封片 树胶相混合。 2、透明时间≤30~45min，以防组织强烈收缩、 变硬和变脆。 3、过程：酒精：二甲苯（1：1）10~20min→ 二甲苯Ⅰ10~15min→二甲苯Ⅱ10~15min →二甲苯Ⅲ10~15min→透明为止 4、脱水兼透明：叔丁醇或正丁醇 防组织收缩、脆硬， 适用于较成熟的卵巢组织。
6、质量分析及改正
一、不能形成连续带：
（1） 长：宽=3：2；
（2）注意切片厚度选择； （3）室温过低（如8℃以下）→加台灯； （4）石蜡过硬→加削面不平行（非长方形）→使平行且相等； （2）长边与刀刃不平行 三、蜡片粘附于切片上： （1）室温高（>35℃）； （2）切刀刃残留二甲苯、液体石蜡等。
（1）苦味酸（三硝基苯酚）黄色、剧毒、强酸性、自燃、自爆，故配成溶液保存 （2）苦味酸可沉淀一切蛋白质，对类脂和糖无作用 （3）使用前配置 （4）金属器械不能接触固定液。
3、固定时间：1 mm厚组织块 2~12小时 2 mm厚组织块 12~24小时 4、体积比>100；且须常摇动 防沉底、粘壁产生固定不均匀现象。 5、避光固定；不同的材料最好分瓶固定；固定瓶上贴标签。
三、浸洗（冲洗） 1、目的：洗去过剩的固定液， 防沉渍。
2、Bouin’s液固定的材料直接用 70%的酒精洗数次，以洗去黄 色；千万不能用水洗，防胶原 纤维膨胀而使组织疏离。
四、 脱水
1、目的：浸洗后的组织块含有部分水分，而水与透明剂不能 相混合，故必须彻底脱水以利于组织透明与浸蜡。 2、过程：酒精逐级脱水(45~60 min)以避免组织过度收缩。 70%→80%→90%→95%Ⅰ→95%Ⅱ→100%Ⅰ→100%Ⅱ
六、 浸蜡（透蜡） 1、目的：以石蜡取代透明剂二甲苯，使组织中的一切空隙 为石蜡透入而填满。 2、过程：二甲苯：石蜡（1：1或分级25%、50%、70% 石蜡）20~30min→石蜡Ⅰ45~60min→ 石蜡Ⅱ45~60min→石蜡Ⅲ45~60min 3、温度要恒定，一般比石蜡熔点高2~3℃ 4、石蜡：（1）旧蜡比新蜡好； （2）新蜡要长时间煎炼以除去杂质气体，直至呈 黄色、质地细腻而柔和； （3）旧蜡中含二甲苯要加热使其蒸发干净； （4）必要时添加5~10%蜂蜡以增加石蜡韧度。 5、软蜡（42~50℃）和硬蜡（52~58℃）： 组织硬、切片薄、室温高→用硬蜡 组织软、切片厚、室温低→用软蜡
5、操作要快防切片在空气中停留过长。
十二、 封固（封片） 把切片由二甲苯中取出，用布或纸把组织 四周多余的二甲苯擦去。滴一滴树胶在组织上 ，加盖盖玻片。 树胶浓度要合适，多少也要恰当。如果树 胶滴得太多，不仅浪费，封固后也不美观；滴 得太少，会在盖玻片与载玻片之间留有空隙。 加盖盖玻片时要倾斜地由左边开始盖在树 胶与组织上，慢慢向下放平，这样才不会出现 气泡。