荧光显微镜的原理和使用方法

透射式荧光显微镜效果图
透射式荧光显微镜光路图
• 2．落射式荧光显微镜 ：这是近代发展起来的新 式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下
落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器 和收集荧光的物镜(图2―6)。光路中需加上一个 双色束分离器，它与光铀呈45°角，激发光被反 射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧
• 激发滤色镜加放于汞灯和二向色镜（dichotic mirror）之间，物镜之前。滤镜的型号不同，数量 较多，可按不同需要选用。
• 阻断滤色镜（barrier filter）:阻断滤色镜 位于物镜之上，二向色镜和目镜之间，用 以阻断或吸收光路中的激发光或某些波长 较短的光线，以防伤害眼睛，使荧光透过。 选用的原则，以能完全阻断或吸收波长短 于所需荧光的光线，并透过样品发出的荧 光。所以，阻断滤色镜的选用，应视荧光 染料的荧光光谱而定，以能最大限度地透 过荧光和阻断短波光。
• (2)光吸收器的组装：
• 反射式荧光装置无需聚光器，由一底部 封闭的圆筒状的光吸收器取代，用以吸收 射入的光线，防止四射。
• 组装方法：降下聚光器架，将光吸收器 插入楔形神内，固紧、回升最高位。
• (3)操作程序 • 转动镜臂旋转台，至相应的标志位。旋转台为
一圆盘状结构，上有5个定位标志：U、V、B、G、 O，分别代表不同的荧光激发方法及其不同的滤 色镜系统组合。 • 点亮汞灯，接通电源，按压启动器按钮，使汞 灯点亮。 • 将镜臂左侧的DIA转换钮调至EPI位。 • 确认汞灯点亮，照明系统正确，灯位调中，电 弧像聚焦准确。 • 用荧光染料染色的样品，放在载物台上，用 10×物镜聚焦。 • 孔径光阑的调整使用：光阑位于镜臂中，用外 露手杆操纵。在汞灯调中、聚焦时，光阑应全开。 荧光显微时，孔径应缩小，使之小于视场。
• 激发方法：共有四种激发方法：紫外、紫、蓝 和绿激发法，各适用于各种不同的荧光染色方法。
观察
在演示台上的荧光显微镜下（用蓝紫光 滤光片），可见经0.01％的丫啶橙荧光染料 染色的细胞，细胞核和细胞质被激发产生 两种不同颜色的荧光(暗绿色和橙红色)。
双重染色标本的单色和双色观察
度稳定。汞灯的构件，中间为一球形石英玻璃管， 有两个钨电极，内充汞滴和少量氩氖混合气体。 汞灯装在牢固的灯室中，有调中、聚焦和集光装 置。使用中严禁频繁启闭，点亮后欲暂停使用时，
不可切断电源，可用光阀阻断光路。当汞灯熄灭 后，不能立刻点亮，经5～10min，汞灯冷却后再 通电点亮。
•
HBO200Ｗ汞灯的发射光谱为200～600nm，
• 反射荧光显微术的光路:反射荧光又称落射 荧光，因激发光由物镜后部进入物镜，向 下落射样品，激发出荧光，荧光反射向上 再进入物镜。其光路如图3-1和3-2所示。
• 汞灯发出高强的激发光，经集光透镜， 吸热玻璃，孔径光阑，激发滤色镜，视场 光阑，通过二向色镜，在此处一定波长以 上的长波光线透过二向色镜，脱离光路， 一定波长以下的短波光线反射向下进入物 镜，透过物镜射向样品，激发荧光物质发 出可见的荧光，荧光反射向上再次进入物 镜，复经二向色镜其中波长较短的光线反 射至光源方向，荧光和长波光线透射向上 经阻断滤色镜进入目镜。
光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发
光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发
光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。
如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤
片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。
此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清
晰，放大倍数愈大荧光愈强
荧 光 显 微 镜 内 部 构
• 细胞内大部分物质经短光波照射后，可发出较弱 的自发性荧光。有些细胞成分与能发出荧光的有 机化合物——荧光染料结合。激发后呈现一定颜 色的荧光，借以对组织进行细胞化学的观察和研 究。
• 2.1 荧光显微镜的基本装置及其光路
•
荧光显微镜因制造厂家、型号的不同，结构
各异，但主要构件，基本相同。
• 2.1.1光源:采用高压汞灯。汞灯能以最小的表面 发出最大数量的紫外光和蓝光，且光亮度大，光
• 2根据照明方式的 不同，荧光显微镜分为落射式荧光显微镜和透 射式荧光显微镜两种。目前常用的是落射式荧 光显微镜，特点是光源通过物镜落射于样品， 激发产生的荧光再通过物镜进入目镜。
• 透射荧光显微术光路:透射荧光显微术是激 发光束通过聚光器自下而上的透射样品，诱发 的荧光从物镜前方进入物镜。汞灯发出的强光 经集光透镜、吸热滤色镜、镜臂反光镜、激发 滤色镜、光路转换反光镜后光线转射向上，进 入视场光阑，暗视场聚光器，进入样品，激发 出的荧光射入物镜经阻断滤色镜进入目镜。
• 视场光阑的调整使用：视场光阑位于孔径光阑 之后，亦由外露手杆操纵。视场光阑用于限定样 品表面的照明区域，其开度一般应与孔径光阑的 开孔相当。
• 辅助激发滤色镜滑动阀的使用:滑动阀位于镜臂 专用槽中，可拉出或推入。有三个挡位供不同使 用。全拉出位：供常规使用；中间位：用于Ｂ激 发法，辅助滤色镜进入光路；全推入位：用作光 阀，阻断全光线．
• 二向色镜（chromatic beam splitter）:荧光 显微镜中，除上述两类滤色镜外，尚有一 重要的分色镜系统——二向色镜位于汞灯 汞激发滤色镜构成的水平光轴与目镜和物 镜构成的竖直光轴的两轴垂直相交处，斜 向安装于光路之中。由镀膜的光学玻璃制 成，其镜面方位与上述两光轴交角均呈 45°，兼有透射长波光线和反射短波光线 的功能。在荧光显微术中承当色光的“分 流”作用。
特殊显微镜的使用（3） 荧光显微镜的原理及其应用
• 一、实验目的： • 掌握荧光显微镜的原理和使用方法 • 二、实验原理 • 荧光显微镜(fluorescence microscope) 是荧光显微
术的基本装置。荧光显微术是利用一定波长的光 （通常是波长短的紫外光和蓝紫光）照射被检样 品，激发荧光物质发出可见的荧光。通过物镜和 目镜的成像、放大，以供检视和拍摄。荧光显微 镜具特殊光源，提供足够强度和波长的激发光， 诱发荧光物质发出荧光。视场中所见的像，主要 是样品的荧光映像。
落射荧光显微镜光路图
使用方法
• (1)高压汞灯的调中：汞灯调中检验器似物 镜状，使用时将其全部旋入物镜转换器， 中部有一圆形屏，能映现汞灯的电弧像， 用以观察调中。按通电源，按压启动钮， 点亮汞灯。完全开放视场光阑和孔径光阑。 转动汞灯室右侧的水平和垂直调中螺旋， 通过调中器圆形屏观察，至调中器内部被 充分照明止。旋转集光透镜调焦钮，使汞 灯电弧像聚焦，再用调中螺旋将电弧像驱 于水平对称位置（调中）。
• 荧光显微镜的光学原理见图3-3：
图3-1落射荧光显微镜光路图
图3-2落射荧光显微镜光路图
图3-3荧光显微镜的光学原理
荧光的种类
二次荧光
自发荧光（固有荧光）
荧光显微镜的类型
1、透射式荧光显微镜：激发光源是通过聚光 镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视 野集光器，也可用普通集光器，调节反光 镜使激发光转射和旁射到标本上．这是比 较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时 荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光 减弱．所以对观察较大的标本材料较好。
其中在365nm和435nm处有两个高峰。
• 2.2.2滤色镜系统:荧光显微术的滤色镜，按用途 或功能，主要分为下列两类：
• 激发滤色镜（exciter filter）:激发滤色镜的作 用，在于为被检样品的荧光染料提供最佳波段的 激发光。荧光染料均有一定的吸收光谱（激发峰 值），利用滤色镜对光线选择吸收的能力，选用 其透射光谱，恰为荧光染料的最大吸收光谱（激 发高峰）的激发滤色镜，以便从汞灯发出的广谱 光波中，选择透过最宜波段的光线供用。
• 某些物质经波长较短的光线照射后，分子被激活， 吸收能量后呈激发态。其能量部分转化为热量或 用于光化学反应外，相当一部分则以波长较长的 光能形式辐射出来，这种波长长于激发光的可见 光称作荧光。生物体内有些物质受激发光照射后 可直接发出的荧光，称为自发荧光（如叶绿体中 的叶绿素分子受激发所发出的火红色的荧光）； 本身不发荧光，在吸收荧光染料之后所发出的荧 光称为次生荧光。常用的荧光染料包括丫啶橙、 荧光素、罗丹明、GFP、PI、PE、DAPI等。