关键词表模板 (1)
论文研究报告格式范文模板(精选23篇)
论文研究报告格式范文模板(精选23篇)一、标题可使用比正文大1—2号的字型与变化了的字体(黑体)来排列，上空2—3行，下空1—2行。
二、署名接标题下一行，一般写上“××单位课题组”,在右上角打上一个“x”,然后在首页文末划一横线下面加注，也注上“x”号相呼应。
加注时要标明课题的级别、性质、归属、立题年份、负责人姓名、成员(顾问)姓名、研究报告的撰写者以及一些谢辞。
也可单独列一页，或放置正文末尾括号中，将具体的工作与成员予以说明。
三、内容摘要和关键词内容摘要是对研究报告中所描述的背景、采用的主要方法、形成的结论与提出的新见解的简要说明，以100—300字为宜，接着“××单位课题组”空1—2行，其中“内容摘要”用中括号，变体字。
关键词除了帮助检索之外，还在于可提醒本研究报告的阅读者着意理解所列词语，以2—5个为宜，紧接着“内容摘要”,其中“关键词”也用中括号，变体字。
四、正文正文是教育科研报告的主体部分，包括以下几个方面：1、问题的提出⑴是揭示问题或困难;⑵是研究的目的和意义⑶是研究现状的综述⑷是本课题关键概念的界定。
3、课题研究的思路与框架这一部分需说明自己对本课题研究思路的角度和特色，还要将研究对象的选择、研究工具、研究步骤等方面的问题交代清楚。
4、课题已经的内容与方法这是研究成果的主体，是课题研究内容的全面展开。
5、研究结果的分析与讨论结果是根据研究过程中搜集到的资料、数据进行整理后展示的客观事实，它告诉我们最终得到什么，这些东西是什么。
结果可用图直观表达，也可用文字简要说明。
五、结论这是整个研究过程的结晶。
它是在研究结果分析的基础上经过推理、判断、归纳而概括出更高一个层次的成果或观点。
结论指出研究结果说明了什么，今后应怎样办等。
六、存在的问题与后续的研究七、报告落笔的时间：一般放在正文右下方。
参考资料的基本格式引用对象基本格式目录第1章项目总论第3章市场预测与分析第4章项目地点的选址第5章项目总体方案设计第6章设备与物质采购第7章环境保护与安全生产第8章项目的组织与管理第9章项目总投资估算与资金筹措第10章项目经济评价第11章社会效益和生态效益分析第12章可行性研究结论与建议第13章结论与建议第14章附件第1章总论总论部分是对其中一具体项目可行性研究报告内容的总体性和粗线条式概括，并说明可行性研究报告编制的依据。
记叙文阅读理解对应题型答题思路及模板 2023年中考语文一轮复习
记叙文阅读理解对应题型答题思路及模板（1）标题考察考察标题含义：（1）谈谈你对标题的含义的理解。
（2）本文标题的含义是什么？有什么表达效果？（3）文章的标题有哪些内涵？（4）文章标题有哪些含义？答题模板：表层含义+深层含义。
考察标题作用：（1）文章标题的作用是什么?（2）说说这个标题好不好?为什么?（3）分析本文标题的特点。
答题模板：内容+结构+表达（此处表达指的是表情达意，理解为情感表达、表现手法、主旨表达等，3.4.5.6根据实际情况作答，有什么答什么）①(结构上)充当文章线索。
②(内容上)表明写作对象，交代时间、地点、人物、写作缘由，点明故事的背景，概括主要内容。
③(写法上)运用比喻、拟人、夸张等修辞，双关、象征等表现手法，突出主题。
④(形式上)用词新颖别致；化用古诗词、成语，富有诗意；简洁凝练；含蓄隽永，具有象征意义；疑问句式，引人深思；设置悬念，吸引读者；格式新颖，条理清晰(小标题)。
⑤(情感上))寄托了……感情；渲染气氛，营造氛围，奠定文章的感情基调。
⑥(主旨上)文章文眼；暗示(点明、凸显)文章主旨；对主题的体现起画龙点睛的作用。
能否改为另一个标题，为什么？答题模板：①表态。
(一般情况)不能换。
②分析原标题的作用(内容上写了……，结构上……，运用了……情感或揭示了……主旨)。
③改换后，新标题没有这种效果，所以不能换。
给文章拟写一个标题。
①写人的文章:主人公十性格。
②叙事的文章:什么人十做了什么事。
③咏物或借物抒情的文章：可用这个事物作标题。
④以文章线索为标题。
⑤以文章主旨为标题（2）词语赏析1、体会加点词语在表达上有什么好处或作用。
2、加点的词语在文中具体指什么?3、把句子中的“xx”改成“xx”好不好? 或：加点词语能否互换?为什么?4、联系上下文，体会加点词语的含义。
5、结合全文的主题，本文中的“xx”词象征什么?6、段中写“xx”词语的用意是什么?7、对句子中富有表现力的词语进行赏析。
(完整版)行业关键词列表大全
行业关键词列表（共计约2922个）一、衣食住行二、医药健康三、娱乐/旅游/体育四、AAAA级景区五、服务业六、通信与互联网七、科教文化类八、机械电子和工业用品九、金融/保险/投资十、其他行业十一、城市名称十二、洲及国家名称十三、政府机构名称中国搜索联盟行业词列表A、衣食住行（大约475个）衣: 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北小年 世界湿地日
南小年
立春 世界抗癌症日
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冬六九
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三十 10 正月 11 初二
除夕
春节 国际气象节
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国际消费者权益日
初七
17 初八
中国国医节 国际航海日
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全国爱肝日
初十 20 十一 21 十二 22 十三 23 十四 24 十五
春分
世界森林日 世界睡眠日
世界水日
世界气象日
世界防治结核病日
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全国中小学生安全 教育日
十七 27 十八 28
世界戏剧日
十九 29
二十 30 廿一 31 廿二
双向情感障碍日 复活节
备注
3月工作亮点：（1）开展2个项目对接，并获好评；（2）完成1次项目汇报，反响较好；
3月工作不足：（1）未持续在公众号阅读行业资讯；（2）XX项目对接中断；（3）XX软件学习进度较慢。
月份
1月 2月 3月 4月 5月 6月 7月 8月 9月 10月 11月
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本月重点节点
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初三
11 初四
发布产品(1)
2.4发布产品-官方对关键词写法解读
注意： 1、建议您选择买家常用的热门关键词，让买家快速搜索到您的产品； 2、关键词不要太长或添加公司内部产品型号，买家较少用很长的词搜索，若产品型号非行业内通用， 买家搜索热度可能不高； 3、每个产品可设置三个关键词，同等重要且不分先后，不建议设置三个完全一样的关键词；例如： 手机的“产品关键词”为mobile phone，“更多关键词”可设为cell phone，mobile； 4、关键词不区大小写；
非直接下单品：指买家在国际站挑选到合适的产品之后， 不能够直接起草订单，只能够点击Contact Supplier给 卖家发送询盘的一种商品类型。
02 如何发布高质量产品
发品前的灵魂拷问
消费者是谁
人
你要做什么人的生意？
消费者在哪
主要的目标市场在哪里？
产品偏好
货
消费采购的品类具备什么特征？
产品价格
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再往前面配（营销词）/属性词/修饰词
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以公司定位企业优势出发，迎合现货赛道 or 定制赛道 ，选择发品类型
2.4发布产品-官方对标题标题写法解读
如何设置产品名称？
产品名称是买家搜索的第一匹配要素，名称的设置决定了买家是否能精准的搜索定位到你的产品，换 句话说（同等产品信息质量的前提下）产品名称书写是否专业，决定了你的产品排词表、禁用词表。 ③ 对应每个型号产品参数表。 ④ 整理图片、视频银行
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2024中考语文一轮复习知识清单8-记叙文阅读 03(知识)
2024年中考语文一轮复习知识清单专题03：记叙文阅读（三）（五大考点：文章思路记叙人称主旨情感表达方式写作特色）考点11：文学作品阅读之梳理文章思路【考点分析】梳理文章的思路是文学作品阅读中常见的题型之一。
这种题型主要考查学生对文章的整体把握能力。
梳理文章思路，要善于分辨文章的领起段、过渡段、中心段、归旨段、结语段，理清文章思路及整体结构。
阅读赏析时，首先要能准确把握文章的线索，理清故事情节的展开过程；其次，要弄清情节内在逻辑联系，理解作者情节设计的用心。
好的结构往往出人意料而又合乎情理，错综复杂而又连贯统一。
梳理文章思路类题目考查的设问方式通常有：1、请根据故事情节，补全相关内容。
2、结合文章内容，在方框内将情节补充完整。
3、纵观全文，“我”的情感（心理）发生了3次变化，请按顺序各用一个词语概括。
4、根据文章内容，梳理情节，完成填空。
【技巧点拨】阅读文章首先要理清文思、分清结构，这样文章的内容和思路也就清晰起来，为接下来更加深入地阅读品析奠定了基础。
答题时，要学会通过对文章语意层次的理解，抓“神”找“线”理清文脉；要关注文中起承转合处的描写，画线切割，还要养成着眼全篇的习惯，前后关联。
一、答题三部曲1．寻找线索、明确线索。
抓住线索，也就抓住了作者的思路，就能理清文章的结构。
找线索的方法：（1）抓标志。
抓住时间标志的词语或地点方位标志的词语，文章线索常常就是以时间为线索或以地点（行踪）为线索。
（2）抓物品。
以物写人、借物抒情、托物言志的文章线索常常就是这个“物”，就是以“某某物”为线索。
（3）抓事情。
文章中写一件核心的事件，事件的发展过程就是文章的线索。
（4）抓细节。
反复出现的同一个细节（同一句话、同一个动作、同一种表情等）这些反复出现的常常是文章的线索。
（5）抓情感。
反复出现的抒情议论语句及表达感情词句常常是文章的线索。
2.划出能表示线索的标志性语句。
（1）划出与线索中的人、物、事情发展的时间等有关系的语句；（2）划出能体现作者感情变化的语句或对某一事物的认识、看法变化的语句；（3）如果是线索表达不够直白的文章，一时找不出头绪来，可从题干中提供的信息得到启示，然后再去寻找。
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规范答题模板：沉淀的洗涤、沉淀洗涤是否干净的判断
规范答题模板(一)沉淀的洗涤、沉淀洗涤是否干净的判断一沉淀的洗涤[掌握规则规范答题赢取满分]典例导引(2017·哈尔滨模拟)铬是硬度最大的金属，有多种化合物，在工业上有广泛的用途。
实验室模拟工业冶炼铬。
将铬铁矿(FeO·Cr 2O 3)与氢氧化钠固体混合后，在空气中焙烧；再经过一系操作，除去Fe 元素，使Cr 元素转化生成Cr 2O 3，最后用铝热法制取铬单质。
除杂过程中，需要对沉淀进行洗涤，在过滤器中洗涤沉淀的操作方法是____________________________。
(2分)抽样评析失分之鉴阅卷点评①凡是出现“将沉淀放在……”的，不得分；②凡是不写“浸没沉淀”的，不得分；③凡是不写“重复操作2～3次”的，不得分。
满分答案沿玻璃棒向过滤器中注入蒸馏水至浸没沉淀，待蒸馏水流尽后，重复操作2～3次答题模板注洗涤液(沿玻璃棒向漏斗中注入洗涤液)↓标准(使洗涤液完全浸没沉淀或晶体)↓重复(待洗涤液流尽后，重复操作2～3次)类题试解1.食盐是日常生活的必需品，也是重要的化工原料。
粗食盐中常含有少量K ＋、Ca 2＋、Mg 2＋、Fe 3＋、SO 2－4等杂质离子，实验室提纯NaCl 的流程如下：提供的试剂：饱和Na 2CO 3溶液、饱和K 2CO 3溶液、NaOH 溶液、BaCl 2溶液、Ba(NO 3)2溶液、75%乙醇、四氯化碳。
选择最好的试剂洗涤除去NaCl 晶体表面附带的少量KCl ，洗涤的操作为___________________________________________________________________。
答案：沿玻璃棒向漏斗中注入75%乙醇，使溶液完全浸没NaCl 晶体，待溶液流尽后，重复操作2～3次二沉淀洗涤是否干净的判断[掌握规则规范答题赢取满分]典例导引以磷石膏(主要成分CaSO 4，杂质SiO 2、Al 2O 3等)为原料可制备轻质CaCO 3。
道德与法治主观题答题技巧与模板
道法主观题答题技巧与模板中考政治主观题答题技巧及模板，不能死搬硬套，要灵活运用主观题答题格式：材料+观点（关键词）+阐述+点题一、评析类：（最关键因素：运用所学知识（关键词或短语），结合材料）(一)观点简析答题步骤：(1)这个观点是片面的(正确的，错误的)(2)是正确的，因为，(教材中的观点，结合材料)。
但是观点是错误的，因为，(教材中的观点，结合材料)。
(3)总结表态。
所以我们既要……，又要……例题略(二)不限定知识评析特点：材料限定，知识不限定提示：此类题目考察知识广度，答题的关键是用准关键词(短语)结合材料分点作答即可，一般不需要过多阐述。
答题样式：材料+观点(关键词)+阐述+点题(表态或者回到题目中提问)(三)限定知识分析1.限定范围：特点：材料限定，知识限定提示：此类题目考察某个范围的知识，作答此题只需运用限定范围内的知识，其余知识不会成为得分点。
答题范式：材料+观点(关键词)+阐述+点题(表态或者回到题目中提问)2.限定具体知识(1)找出相关的知识点并写出来。
(2)按照材料+观点(关键词)+阐述+总结(表态或者回到题目中提问)格式进行回答二、联系题：(一)双向联系：答题步骤(1)二者之间是相互联系、相互影响、相互促进的(2)A对B的影响：材料一___________(和材料二___________)体现了A观点，A观点的实施可以(有助于)作用(教材中的知识、材料中的作用)，这促进了(有助于、有利于)B观点。
B对A的影响：材料一___________(和材料二___________)体现了B观点，B观点的实施可以(有助于)作用(教材中的知识、材料中的作用)，这促进了(有助于、有利于)A观点。
(3)总结：所以……(二)单向联系题思路：首先要从材料中找出相应关键词，再联系到问题中所限定的观点。
方法：对于这类观点并非来源于书本所学知识的，直接用"材料+观点+解释(作用)+这一观点"方法答题即可。
高考语文考试必备万能答题模板归纳2023
高考语文考试必备万能答题模板归纳2023高考必备的语文答题模板一、诗歌答题模式1.意境类：描绘画面(忠于原诗，语言优美)+概括氛围+分析思想感情2.手法类：揭示手法+结合诗句分析(怎样用)+思想感情+作用效果3.语言特色类：揭示语言特色+结合诗句具体分析+思想感情+作用效果4.炼字类：该字在句中的含义+技巧(活用、倒装、手法)+放入句中描述景象+意境感情(作用效果)5.关键词类：主旨作用+结构作用6.感情类：通过__内容+抒发(寄寓/揭露)__感情7.概括主旨类：诗歌定位+各句内容+通过__手法+抒发__感情+评价8.鉴赏类：写了什么+怎样写的(技巧+语言风格+字句特色)+表达效果(感情)9.形象类：找到诗句+分析基本含义+为何要写(主旨)+作用效果10.诗歌含义：表层含义+深层含义二、现代文答题模式1.开放型试题：评+引+析+结2.谈看法或补叙结尾：感悟+引申3.原因题：客观原因+主观原因4.词语的表达作用：形象性+感情性+精确性+结构性5.联想感悟型：A.感：根据文本，联系全文B.悟：联系实际，结合自身，另举一例，提出建议6.句子的作用：A.思想内容上：联系本句含义+突出强调内容或揭示段意+联系中心、态度、感情+用了修辞或表现手法的要揭示表达效果B.结构上：引起下文、设置悬念、伏笔、渲染气氛、照应前文、总结上文、使结构严谨、承上启下、揭示文章脉络层次7.关键句子理解：抓句中关键词+联系上下文8.写X为什么要从Y写起：揭示X与Y的关系+引出写作主体+突出主体特点9.怎样论证：论证方法+论证过程高考语文答题模板干货一、修辞手法1、注意佳句在文章中的位置及地位2、公式:①比喻:……采用了比喻的修辞手法，描写了……，表现了对……的感情，形象生动。
②拟人:……采用了拟人的修辞手法，将……赋予人的情感与性格来写，表现了对……的感情，十分形象，生动(或栩栩如生，逼真]③夸张:……采用了夸张的修辞手法，描写了……，表达了……的情感，联想奇特，富于形象感。
路桥工程预制梁施工技术分析——以龙洲路伦桂节点改造工程为例
路桥工程预制梁施工技术分析——以龙洲路伦桂节点改造工程为例【内容摘要】路桥工程预制梁施工工艺环节多而繁杂、且施工操作对技术的要求较高，因此，为提高公路桥梁预制箱梁施工质量，必须要重视对各施工环节的质量控制，注重工程质量控制与施工技术优化，以有效确保桥梁工程的建设质量和应用安全。
基于此，结合龙洲路伦桂节点改造工程，讨论了预制梁施工中的模板、钢筋、波纹管、混凝土等技术要点，并就预应力施工展开具体阐述，旨在建立一种综合、全面的路桥工程预制梁施工技术控制策略，为同类工程提供参考。
【关键词】路桥工程；预制梁；施工技术龙洲路是顺德“四横六纵”主干道网中的“一横”，是顺德境内最重要的一条东西走向的交通主干道。
本项目是将现状龙洲路与伦桂路不完全互通立交改造为完全互通型立交，实现龙洲路与伦桂路之间转向交通的连续性和快速性，路线设计全长1.7km。
采用一级公路技术标准，设计范围内龙洲路两侧新建辅道共2704m，新建辅道桥23m/1座，新建匝道桥1435.9m/4座，拼宽匝道桥100.9m/1座。
本工程预制梁主要分布于G、J匝道桥、龙洲路辅道桥和I匝道桥共计115片，其中GK0+519.696匝道桥预制小箱梁80片，JK0+220.151匝道桥预制小箱梁共计18片，龙洲路辅道桥LZYK1+088.527预制空心板梁7片和I匝道桥IK0+451.219预制空心板梁10片。
1.预制梁施工准备1.1施工工艺流程预制梁施工工艺流程见图1所示。
图1.预制小箱梁、空心板梁施工工艺流程图1.2准备工作人员和设备按时进场，并对机械设备等进行检测、标定，不因机械等原因影响施工进度。
施工中所用的主体结构材料和辅助材料计划由工区编制报物资部，物资部按照材料计划进场，进场后有物资部同试验室共同验收。
进场前，用于永久结构的材料、设备均需有关材料质量保证书。
施工中所用的砂、石水泥、水、矿粉、外加剂、钢筋、波纹管、钢绞线、钢板等。
进场后，均必须按规范要求，进行全面复检，不合格的材料坚决不允许用于本工程，检验结果报监理工程师审核。
一般关键词论文题目中的常见写法(1)
---------------------------------------------------------------范文最新推荐------------------------------------------------------ 一般关键词论文题目中的常见写法(1)关键词是科技论文的文献检索标识，是表达文献主题概念的自然语言词汇。
科技论文的关键词是从其题名、层次标题和正文中选出来的，能反映论文主题概念的词或词组。
关键词是为了适应计算机检索的需要而提出来的，位置在摘要之后。
早在1963年，美国Chemical Abstracts从第58卷起，就开始采用电子计算机编制关键词索引，提供快速检索文献资料主题的途径。
在科学技术信息迅猛发展的今天，全世界每天有几十万篇科技论文发表，学术界早已约定利用主题概念词去检索最新发表的论文。
作者发表的论文不标注关键词或叙词，文献数据库就不会收录此类文章，读者就检索不到。
关键词选得是否恰当，关系到该文被检索和该成果的利用率。
1 关键词分类关键词包括叙词和自由词。
叙词——指收入《汉语主题词表》、《MeSH》等词表中可用于标引文献主题概念的即经过规范化的词或词组。
英文摘要书写技巧论文中参考文献书写合同编号：___________借款人名称：________________________________住所：______________________________________法定代表人或主要负责人：____________________1 / 21电话：______________________________________邮政编码：__________________________________贷款人名称：________________________________住所：______________________________________法定代表人或主要负责人：____________________电话：______________________________________邮政编码：__________________________________签订合同日期：______________________________签订合同地点：______________________________借款人：_______________________（以下称甲方）贷款人：_______________________（以下称乙方）甲方为支付____________________项目所需外币资金，向乙方申请__________贷款。
案例分析报告格式与范文
案例分析报告的格式与范文一、案例分析报告的格式1.格式（封面）标题×××小组编号小组成员（目录）（正文）5号，宋体，三级标题式，至少一万字。
正文后附上小组分工说明2.案例分析报告模板摘要字号：小四字体：宋体行间距：1.25倍字数：300－500字。
关键词：（3-5个）；目录摘要 (Ⅰ)一、……………………………………………………………………………（）1.……………………………………………………………………………（）2.……………………………………………………………………………（）二、…………………………………………………………………………（）1.……………………………………………………………………………（）2.……………………………………………………………………………（）三、………………………………………………………………………………（）1.……………………………………………………………………………（）2.……………………………………………………………………………（）……………………结束语…………………………………………………………………………（）参考文献…………………………………………………………………………（）附录A……………………………………………………………………………（）附录B……………………………………………………………………………（）案例分析报告题目以下为案例分析报告正文，格式要求如下：一级标题：三号字，黑体，段间距1.5倍；二级标题：小三号字，黑体，段间距1.5倍；三级标题：四号字，黑体，段间距1.25倍；正文：小四号字，宋体，段间距1.25倍；图表应有序号和标题。
附录A：团队基本情况**团队基本情况附录B：指导教师评语及成绩团队整体成绩：团队成员个人成绩：3.写作要求案例分析报告的写作（50分）★★★★★[复习要求：框架必背，范文需理解]注意事项：1.保险起见，每个部分均需加余量，比如第三部分的具体问题最好写4个而不是3个，第四部分的基本原因需要写6至8条，根本原因要写3条，第五部分的建议也需6至8条。
《法学研究》论文格式要求怎样的
《法学研究》论文格式要求怎样的法学研究论文的要求主要是以有关国家标准、各校自拟格式要求与模板是规范毕业论文格式的主要依据，对论文的写作格式与排版格式均提出了要求。
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2、参考文献排列顺序按：先中文后英文(中文按首汉字拼音的首字母顺序排列，英文按首字母顺序排列，如首字母相同按第二个字母排序)。
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见附件八。
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九、其他说明：1、除封面、原创性声明和封底以外，每页均填加页眉，内容为“贵州大学硕士研究生学位论文”，格式为Word文档默认，勿改动。
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课题申报书：中小学学校教育质量综合评价系统开发与实践研究（1）
课题申报书：中小学学校教育质量综合评价系统开发与实践研究（1）课题申报范例精选【导语】课题要坚持正确的政治方向，充分体现中央有关精神和要求，具有鲜明的问题导向和创新价值。
应用对策类选题要有现实性、针对性和前瞻性；基础理论类选题要立足学术前沿，具有原创性和开拓性；跨学科类选题要体现学科交叉渗透的属性和特点。
选题文字表述科学、严谨、规范。
以下是课题优秀成果，是各类教师进行课题申报、开展课题研究、撰写研究报告的参考模板和范例。
中小学学校教育质量综合评价系统开发与实践研究课题名称：中小学学校教育质量综合评价系统开发与实践研究关键词：学校教育质量、指标体系、软件开发申报级别：全国教育信息技术研究课题课题类别：重点课题学科分类：综合实践研究类型：综合实践预期研究成果：立项号：146122321课题设计论证一、问题提出《教育部关于推进中小学教育质量综合评价改革的意见》（教基二[2013]2号）指出，教育质量评价是教育综合改革的关键环节。
但现实很严峻，由于教育内外部多方面的原因，单纯以学生学业考试成绩和学校升学率评价中小学教育质量的倾向还没有得到根本扭转，在评价内容、方法、结果应用上存在问题，严重影响了学生的全面发展、健康成长和学校教育发展。
要解决这些突出问题，就必须大力推进中小学教育质量综合评价改革。
中小学教育质量综合评价，是以学生综合素质评价为依据的评价，需要大量收集各类数据资料。
而实践发现，纸质媒介的易损性严重阻碍了评价的有序发展。
由于计算机、网络信息等技术具有时空便捷性、数据处理的强大性等特点，将其应用到学生综合素质评价进而应用到中小学教育质量综合评价中，已成为社会发展的必然趋势。
本课题拟在调查了解当地中小学学校教育质量评价现状和问题的基础上，结合当地教育资源特点，开发具有鲜明时代特征和区域特色的中小学教育质量综合评价系统，以推进中小学学校教育质量评价工作，促进学生的全面发展。
二、文献综述（一）关于学校教育质量评价的研究随着教育改革的不断深入，学校教育质量及其评价问题成为教育的核心问题。
柱花草SgALMT1基因克隆与表达分析
第32卷第4期V o l.32N o.4草地学报A C T A A G R E S T I A S I N I C A2024年4月A p r.2024d o i:10.11733/j.i s s n.1007-0435.2024.04.010引用格式:缪野,刘怀锦,刘莉婷,等.柱花草S g A L M T1基因克隆与表达分析[J].草地学报,2024,32(4):1078-1086 M I A O Y e,L I U H u a i-j i n,L I U L i-t i n g,e ta l.C l o n i n g a n d E x p r e s s i o n A n a l y s i so f S g A L M T1i n S t y l o s a n t h e sg u i a n e n s i s[J].A c t aA g r e s t i aS i n i c a,2024,32(4):1078-1086柱花草S g A L M T1基因克隆与表达分析缪野1,2,3,刘怀锦1,刘莉婷1,罗丽娟1,陈志坚2,3*(1.海南大学热带农林学院,海南海口570228;2.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业农村部华南作物基因资源与种质创制重点实验室,海南海口571101;3.热带作物生物育种全国重点实验室,海南三亚572024)摘要:为探索铝激活苹果酸转运蛋白(A l u m i n u m-a c t i v a t e dm a l a t e t r a n s p o r t e r,A L M T)在植物适应酸性土壤铝毒害中的重要作用,本研究以柱花草(S t y l o s a n t h e s g u i a n e n s i s)为研究材料,克隆了柱花草S g A L M T1基因,并进行了生物信息学㊁亚细胞定位及基因表达分析㊂结果表明:S g A L M T1基因全长为1350b p,编码450个氨基酸残基,蛋白分子量为50.6k D a,包含6个跨膜结构域;亚细胞定位分析表明,S g A L M T1蛋白定位在拟南芥原生质体细胞膜上,为膜蛋白㊂定量P C R结果表明,S g A L M T1基因在柱花草叶中的表达量高于根中的表达量;铝处理增强了S g A L M T1基因在柱花草根中的表达,表明S g A L M T1基因可能参与了柱花草应对铝胁迫;另外,缺氮处理增强了S g A L M T1基因在柱花草叶中的表达,而缺磷处理增强了S g A L M T1在根中的表达㊂本研究结果为解析柱花草响应铝毒害和养分缺乏的机理提供了候选基因资源㊂关键词:柱花草;铝毒害;基因表达;苹果酸;亚细胞定位中图分类号:S541文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2024)04-1078-09C l o n i n g a n dE x p r e s s i o nA n a l y s i s o f S g A L M T1i n S t y l o s a n t h e s g u i a n e n s i sM I A O Y e1,2,3,L I U H u a i-j i n1,L I U L i-t i n g1,L U OL i-j u a n1,C H E NZ h i-j i a n2,3*(1.C o l l e g e o fT r o p i c a lA g r i c u l t u r e a n dF o r e s t r y,H a i n a nU n i v e r s i t y,H a i k o u,H a i n a nP r o v i n c e570228,C h i n a;2.I n s t i t u t e o fT r o p i c a l C r o p G e n e t i cR e s o u r c e s,C h i n e s eA c a d e m y o fT r o p i c a lA g r i c u l t u r eS c i e n c e s/K e y L a b o r a t o r y o fC r o p G e n eR e s o u r c e sa n dG e r m p l a s m E n h a n c e m e n t i nS o u t h e r nC h i n a,M i n i s t r y o fA g r i c u l t u r e a n dR u r a lA f f a i r,H a i k o u,H a i n a nP r o v i n c e571101,C h i n a;3.N a t i o n a lK e y L a b o r a t o r y f o rT r o p i c a l C r o p B r e e d i n g,S a n y a,H a i n a nP r o v i n c e572024,C h i n a)A b s t r a c t:T o i n v e s t i g a t et h e i m p o r t a n tr o l eo fa l u m i n u m(A l)-a c t i v a t e d m a l a t et r a n s p o r t e r(A L MT)i n p l a n t a d a p t a t i o nt o A lt o x i c i t y i n a c i d i cs o i l s,S g A L MT1g e n e w a sc l o n e df r o m s t y l o(S t y l o s a n t h e s g u i a n e n s i s),i t sb i o i n f o r m a t i o n,s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o na n de x p r e s s i o n p a t t e r nw e r e s u b s e q u e n t l y a n a l y z e d i n t h i s s t u d y.T h e r e s u l t ss h o w e dt h a t t h e S g A L MT1g e n ew a s1350b p i n l e n g t h,e n c o d i n g450a m i n o a c i d s.T h eS g A L MT1p r o t e i n p o s s e s s e d am o l e c u l a rw e i g h t o f50.6k D a a n dw a s p r e d i c t e d t o i n c l u d e s i x t r a n s m e m b r a n e d o m a i n s.S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n a n a l y s i s i n A r a b i d o p s i s p r o t o p l a s t s s h o w e d t h a t S g A L MT1w a s l o c a l i z e d o n t h e p l a s m am e m b r a n e,s u g g e s t i n g i tw a s am e m b r a n e p r o t e i n.R T-q P C Ra n a l y-s i s d e m o n s t r a t e d t h a t t h e e x p r e s s i o no f S g A L MT1i n l e a v e sw a sh i g h e r t h a nt h a t i nr o o t s.A l t r e a t m e n t e n h a n c e d t h e e x p r e s s i o no f S g A L MT1i nr o o t so f S.g u i a n e n s i s,s u g g e s t i n g t h a t S g A L MT1m a y b e i n-v o l v e d i n t h e r e s p o n s e o f S.g u i a n e n s i s t oA l t o x i c i t y.I na d d i t i o n,t h e t r a n s c r i p t so f S g A L MT1i n l e a v e s w a s i n c r e a s e db y n i t r o g e n d e f i c i e n t t r e a t m e n t,w h i l e i t s e x p r e s s i o nw a s u p-r e g u l a t e d i n r o o t s b y p h o s p h o r u s d e f i c i e n c y.T a k e n t o g e t h e r,t h e s t u d yp r o v i d e s a c a n d i d a t e g e n e f o r d i s s e c t i n g t h e a d a p t a t i v em e c h a n i s mo f S.g u i a n e n s i s t oA l t o x i c i t y a n dn u t r i e n t d e f i c i e n c y.K e y w o r d s:S t y l o s a n t h e s g u i a n e n s i s;A l u m i n i u mt o x i c i t y;G e n e e x p r e s s i o n;M a l a t e;S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n收稿日期:2023-12-24;修回日期:2024-02-23基金项目:国家自然科学基金项目(31861143013,31672483);财政部和农业农村部:国家现代农业产业技术体系(C A R S-34)资助作者简介:缪野(1999-),女,汉族,四川内江人,硕士研究生,主要从事热带牧草抗逆研究,E-m a i l:3326848781@q q.c o m;*通信作者A u-t h o r f o r c o r r e s p o n d e n c e,E-m a i l:j c h e n@s c a u.e d u.c n第4期缪野等:柱花草S g A L MT1基因克隆与表达分析酸性土壤是p H值低于5.5的土壤,占全球耕地面积50%以上,并主要分布在热带和亚热带地区[1-2]㊂在我国,酸性土壤主要分布在南方省区,约占全国耕地面积的21%[3]㊂在酸性土壤中,存在有影响作物产量的诸多不利因素,包括有机质含量低㊁铝(A l)和锰(M n)元素毒害以及磷(P)㊁钙(C a)和镁(M g)等营养元素缺乏[4]㊂其中,铝毒害是酸性土壤中限制作物生长的主要障碍因素之一㊂在低p H酸性条件下,土壤溶液中的铝主要以3价铝离子(A l3+)形式存在[5-6],而铝离子会抑制植物根尖细胞的伸长,减少植物对水分和养分的吸收[7]㊂植物在长期进化过程中形成了内部忍耐和外部排斥的耐铝毒机制㊂内部忍耐机制包括有机酸在细胞质内螯合铝和将铝隔离在液泡等,而外部排斥机制包括根系分泌有机酸螯合铝㊁提高根际p H值和细胞壁固定铝等方面[2]㊂其中,根系分泌有机酸(如苹果酸㊁柠檬酸和草酸)螯合铝离子,阻止铝进入根尖细胞,减少铝的吸收被认为是植物耐铝的重要机制[8-9]㊂近年来,介导有机酸转运的基因已被克隆,其生物学功能也已被鉴定㊂例如,铝激活苹果酸转运蛋白(A l u m i n u m-a c t i v a t e dm a l a t e t r a n s p o r t e r,A L M T)负责苹果酸的转运,而多药物及毒性化合物外排转运蛋白(M u l t i d r u g a n d t o x i c c o m p o u n de x t r u s i o n,M A T E)负责柠檬酸的转运[9],它们在植物耐铝中发挥重要作用㊂小麦(T r i t i c u ma e s t i v u m)T a A L M T1是首个被克隆的植物A L M T基因㊂T a A L M T1是细胞膜蛋白,该蛋白能被铝离子激活表达,在铝胁迫下参与根系苹果酸的转运,从而增强小麦的耐铝能力[10]㊂在拟南芥(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a)[11-13]㊁油菜(B r a s s i c an a-p u s)[14]㊁紫花苜蓿(M e d i c a g o s a t i v a)[15]和大豆(G l y-c i n e m a x)[16-17]等植物中也相继报道了A L M T的同源基因㊂例如,在拟南芥中,包含有14个A t A L M T s基因[11-13]㊂A t A L M T1也被发现具有介导苹果酸转运从而参与铝耐受性的功能,而A t A L M T6和A t A L M T9参与了气孔调节[11-13]㊂另外,在油菜中共鉴定到39个B n A L M T s基因[18],其中,B n A L M T1和B n A L M T2具有调控苹果酸转运的功能,外源表达B n A L M T1和B n A L M T2均增强了烟草(N i c o t i a n a t a b a c u m)细胞的耐铝性[19]㊂因此,A L M T家族成员在响应铝胁迫㊁气孔调节和阴离子平衡等方面发挥作用[20]㊂柱花草(S t y l o s a n t h e s g u i a n e n s i s)是重要的热带豆科牧草,起源于热带和亚热带地区㊂柱花草可广泛用于绿肥覆盖㊁果园间作和牧草饲料等方面[21]㊂因柱花草种植于热带亚热带地区,而这些地区同时也是酸性土壤分布的主要区域,表明柱花草对酸性土壤养分逆境胁迫具有较强的适应性,是研究植物适应酸性土壤生长的豆科先锋牧草[22-23]㊂前期研究对不同柱花草的耐铝能力进行了评价分析[24-25],发现柱花草苹果酸酶和苹果酸脱氢酶具有调控根系苹果酸合成的生物学功能,参与了柱花草响应酸铝胁迫[26-27]㊂然而,迄今为止,未有对柱花草苹果酸转运蛋白基因进行克隆及分析的报道,苹果酸参与柱花草耐铝毒的分子机制仍不清楚㊂因此,本研究克隆了柱花草S g A L M T1基因,并进行了生物信息学㊁亚细胞定位及基因表达分析,为深入研究S g A L M T1基因参与柱花草耐铝毒的功能提供参考㊂1材料与方法1.1试验材料本研究所用试验材料为 热研5号 圭亚那柱花草(S t y l o s a n t h e s g u i a n e n s i s)㊂柱花草种子由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供㊂1.2试验方法1.2.1试验材料培养及处理柱花草种子去种皮后放入装有去离子水的离心管中,并置于80ħ水浴锅中加热3m i n,随后将种子平铺在放有浸湿滤纸的培养皿中,避光萌发2~3d㊂将萌发后的柱花草幼苗转移至H o a g l a n d营养液(p H5.8)中进行培养[28]㊂柱花草正常培养28d后,分别进行以下处理:①收获叶和根系样品,并收获距离根尖0~1 c m,1~2c m和大于2c m的不同根段样品,用于基因组织表达分析[28];②由于500μm o l㊃L-1C a C l2溶液可以有效维持细胞的渗透压,因此,将柱花草转移至含有0,100μm o l㊃L-1A l C l3,40μm o l㊃L-1 C d C l3和20μm o l㊃L-1L a C l2的500μm o l㊃L-1 C a C l2溶液(p H4.2)中分别进行铝(A l)㊁镉(C d)和镧(L a)处理[29],处理24h后收获根系样品,用于分析不同金属处理对基因表达的影响;③将柱花草置于0,100,200和400μm o l㊃L-1A l C l3处理液(p H 4.2)中,处理48h后收获根系样品,另外,将柱花草置于200μm o l㊃L-1A l C l3处理液(p H4.2)中,分别于处理第0,12,24,36和48h收获根系样品,用于基因表达分析;④将柱花草置于缺氮(-N)㊁缺磷(-P)和缺钾(-K)的H o a g l a n d营养液(p H5.8)中[27],处理14d后,收获叶和根系样品,用于分析不9701草 地 学 报第32卷同缺素处理对基因表达的影响㊂以上处理均包括3个生物学重复㊂1.2.2 柱花草R N A 的提取与c D N A 的合成 取0.1g 柱花草叶或根系样品用T R I z o lU n i v e r s a l R N A 提取试剂(T i a n ge n ,中国)提取总R N A ,取2μg 总R N A 使用H i S c r i p tI I I1s tS t r a n dc D N A S y n t h e s i eK i t 试剂盒(V a z y m e ,中国)合成c D N A ,c D N A 置于 20ħ保存备用㊂1.2.3 S gA L M T 1基因的全长克隆 参考S o n g 等[27]方法,获得S g A L M T 1基因全长序列,根据基因序列信息设计全长克隆引物S g A L M T 1-O R F -F /R (表1)㊂以柱花草c D N A 为模板进行P C R 扩增,P C R 反应体系为:2μL10ˑP C Rb u f f e r ,1.6μLd N T P,1μL 引物(10μm o l ㊃L -1),0.1μLE xT a q (T a k a r a ,中国),1μLc D N A 模板,补充d dH 2O 至20μL ㊂P C R 反应程序为:94ħ4m i n ,94ħ30s ,55ħ30s ,72ħ1.5m i n ,35次循环㊂获得S gA L M T 1基因全长片段,将P C R 产物连接到p M D 18-T 载体上(T a k a r a ,中国)㊂通过热击法,将连接产物转化大肠杆菌D H 5α(上海唯地生物技术有限公司,中国),将菌液涂布到含100μg ㊃m L -1氨苄青霉素的L B 固体培养基(10g 胰蛋白胨,5g 酵母提取物,10g N a C l 和15g A ga r )上,于37ħ培养箱倒置培养12h ,挑取单克隆于L B 液体培养基(10g 胰蛋白胨,5g 酵母提取物和10g N a C l )上,P C R 鉴定阳性克隆后,于生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析㊂1.2.4 S gA L MT 1基因生物信息学分析 使用E x p a s y (h t t p s ://w e b .e x p a s y .o r g /p r o t pa r a m /)分析蛋白基本信息;通过I n t e r P r o (h t t p s ://w w w.eb i .ac .u k /i n t e r p r o )分析蛋白结构域;使用M E G A 6来构建进化树,并使用E v o l v i e w (E v o l v i e w :T r e e V i e w )进行进化树美化㊂1.2.5 S gA L MT 1基因实时荧光定量(R T -q P C R )分析 参考S o n g 等[27]方法,用Q u a n t S t i d u o T M R e a l -T i m eP C R (T h e r m o F i s h e r ,美国)和S Y B RG r e e n (V a z y m e ,中国)进行基因表达分析㊂R T -qP C R 反应体系为:10μL2ˑS Y B R G r e e n P C R m a s t e rm i x ,6μLd dH 2O,1μL 引物(10μm o l ㊃L -1),2μL 稀释50倍的c D N A 模板㊂R T -q P C R 反应程序为:94ħ1m i n ,94ħ15s ,58ħ15s ,72ħ30s ,40次循环㊂以S g E F 1a 为内参基因计算基因的相对表达量㊂R T -q P C R 引物如表1所示㊂表1 基因克隆、R T -qP C R 和亚细胞定位引物T a b l e 1 P r i m e r su s e d f o r g e n e c l o n i n g ,R T -q P C Ra n d s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o na n a l ys e s 引物名称P r i m e r n a m e引物序列(5'-3')P r i m e r s e qu e n c e 退火温度A n n e a l i n g t e m pe r a t u r e /ħS gA L MT 1-O R F -F A T G A A T G G G A A A A A C G G G A G C A T A 56.5S g A L MT 1-O R F -R C T A C T T T C C A T C A T G C T T G A A C T T 52.6S g A L MT 1-R T -F G T T C A C A G C G C T A C C A A A A G G 57.0S g A L MT 1-R T -R C C A A G T A G T C A A C C C T C G C C58.6S g A L MT 1-G F P -F C A G T G G T C T C A C A A C A T G A A T G G G A A A A A C G G G A G C A T A53.6S g A L MT 1-G F P -R C A G T G G T C T C A T A C A C T T T C C A T C A T G C T T G A A C T T53.1S g E F 1a -R T -F C A C T T C A G G A C G T G T A C A A G A T C 58.3S gE F 1a -R T -R C T T G G A G A G C T T C A T G G T G C A58.81.2.6 S gA L MT 1蛋白亚细胞定位分析 根据S g A L MT 1基因序列设计S g A L MT 1-G F P -F /R 特异引物(表1)进行P C R 扩增,并将P C R 产物连接到p BWA (V )H S -c c d b -G L o s g f p 瞬时表达载体上[27]㊂参考Y o o 等[30]制备原生质的方法,即切取2~4片生长3周的拟南芥叶片,并切成1m m 宽的长条,迅速放入10~15m L 酶解液(20m m o l㊃L -1吗啉乙磺酸,含1.5%纤维素酶R 10㊁0.4%离析酶R 10㊁0.4m o l ㊃L -1甘露醇和20m m o l ㊃L -1K C l ,p H5.7)中,27ħ70r ㊃m i n -1反应3h ㊂4ħ100ˑg(离心力)离心2m i n ,弃上清液㊂加入5~10m L 预冷的W 5溶液(2m m o l ㊃L -1吗啉乙磺酸含154m m o l ㊃L -1N a C l ㊁125m m o l ㊃L -1C a C l 2和5m m o l ㊃L -1K C l ,pH 5.7),轻轻重悬沉淀,4ħ100ˑg 离心2m i n ,弃上清液㊂加入10m L 预冷的W 5溶液,重悬沉淀,冰上静置30m i n ,4ħ100ˑg 离心2m i n ,小心收集沉淀㊂加入适量预冷的MMG 溶液(4m m o l ㊃L -12-吗啉乙磺酸含0.4m o l ㊃L -1甘露醇和15m m o l ㊃L -1M g C l 2,p H 5.7),小心重悬原生质体㊂取10μL 质粒加入至制备好的100μL 原生质体中,加入110μL P E G (聚乙二醇)/C a2+溶液,轻轻混匀,室温放置15m i n ㊂加入500μL W 5溶液,轻轻混匀,100ˑg 离心2m i n ,弃上清,重复该步骤2次,加入1m L W 5溶液混匀,室温避光培养12h ㊂采用激光共聚焦显微镜N i k o nC 2(N i k o n ,日本)进行荧光观察并拍照㊂1.3 数据统计分析采用M i c r o s o f tE x c e l 2021进行数据分析和作0801第4期缪 野等:柱花草S gA L MT 1基因克隆与表达分析图㊂使用S P S S V 26.0(S P S SI n s t i t u t e ,美国)进行单因素方差分析㊂2 结果与分析2.1 柱花草S gA L M T 1基因全长克隆本研究首先根据S g A L MT 1基因序列设计全长克隆引物,以柱花草c D N A 为模板进行P C R 扩增,获得S g A L MT 1基因全长片段㊂D N A 凝胶电泳分析发现,P C R 产物片段在1000~1500b p 之间(图1),经测序后发现,S gA L MT 1基因全长为1350b p㊂图1 S gA L M T 1基因的克隆F i g .1 G e n e c l o n i n g o f S gA L M T 12.2 S g A L M T 1蛋白特性和结构分析利用E x p a s y 在线工具分析发现S g A L MT 1蛋白包含450个氨基酸残基,蛋白分子量为50.6k D a ,等电点为7.4,属于亲水性蛋白㊂利用I n -t e r P r o 在线工具分析发现S gA L MT 1蛋白属于A L MT 家族成员,包含A L MT 蛋白的保守序列P F 11744㊂此外,S g A L MT 1蛋白具有6个跨膜螺旋结构,分别位于N 端的40~58,65~87,97~116,123~140,150~167和180~202氨基酸㊂2.3 系统进化树分析系统进化树分析表明,不同植物的A L MT 蛋白可被分为3大组(图2)㊂第1组包括拟南芥㊁大豆㊁水稻(O r y z a s a t i v a )㊁玉米(Z e am a ys )㊁小麦(T r i t i -c u ma e s t i v u m ),油菜等植物的A L MT 蛋白;第2组包括大豆㊁水稻和拟南芥的A L MT 蛋白;柱花草S gA L MT 1蛋白被分在第3组,与大豆的G m A L MT 3和水稻O s A L MT 1/3同源性较高,且与大豆G m A L MT 1㊁拟南芥的A t A L MT 3/4/5/6和绣球花(H y d r a n g e am a c r o p h y l l a )Hm A L MT 9在同一大组中,表明其可能具有这些A L MT 同源蛋白类似的功能㊂图2 A L M T 蛋白进化树分析F i g .2 P h y l o g e n e t i c a n a l ys i s o fA L M T p r o t e i n 注:G m ,大豆;O s ,水稻;A t ,拟南芥;Z m ,玉米;T a ,小麦;B n ,油菜;S l ,番茄;M t ,苜蓿;C s ,柑橘;Hm ,绣球;S g,柱花草㊂红色星号表示柱花草S gA L MT 1蛋白N o t e :G m ,G l y c i n em a x ;O s ,O r y z a s a t i v a ;A t ,A r a b i d o ps i s t h a l i -a n a ;Z m ,Z e am a y s ;T a ,T r i t i c u ma e s t i v u m ;B n ,B r a s s i c a n a p u s ;S l ,S o l a n u ml y c o p e r s i c u m ;M t ,M e d i c a g o s a t i v a ;C s ,C i t r u s s i n e n s i s ;Hm ,H y d r a n g e a m a c r o p h y l l a ;S g ,S t yl o s a n t h e s g u i a n e n s i s .T h e r e d a s t e r i s k i n d i c a t e s t h eS g A L M T 1p r o t e i n f r o m S .gu i a n e n s i s 2.4 S gA L M T 1蛋白亚细胞定位分析本研究在拟南芥叶片原生质体中瞬时表达S g A L M T 1蛋白,分析S gA L M T 1的亚细胞定位情况㊂由图3可以看出,空载体对照(35S ʒG F P )的荧光信号在整个细胞中均可观察到,并主要集中在细胞质中,而S g A L M T 1蛋白(35S ʒS gA L M T 1-G F P )的荧光信号定位在细胞膜上,表明S g A L M T 1为膜蛋白,可能具有转运功能㊂图3 S gA L M T 1蛋白亚细胞定位分析F i g .3 S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o no f S gA L M T 1p r o t e i n 注:35S :G F P ,G F P 空载体对照;G F P ,绿色荧光蛋白信号;A u t o ,叶绿体自发荧光信号;D I C ,明场细胞图;M e r ge ,融合G F P ,A u t o 和D I C 的图㊂比例尺均为20μmN o t e :35S :G F P ,G F Pe m p t y v e c t o r ;G F P ,s i gn a l o fG F Pf u s i o n p r o -t e i n ;A u t o ,s i g n a lo fc h l o r o p h y l la u t o f l u o r e s c e n c e ;D I C ,b r i gh t -f i e l d i m a g e s ;M e r g e ,t h em e r g e d i m a ge s .S c a l e b a r i s 20μm 1801草地学报第32卷2.5柱花草S g A L M T1基因组织表达分析本研究进一步通过R T-q P C R方法分析了S g A L M T1基因在柱花草叶和根中的表达情况㊂从图4A可以看出,S g A L M T1基因在叶和根中均有表达,且在叶中的表达量高于根中的表达量㊂另外,S g A L M T1基因在不同根段中的表达差异不显著(图4B)㊂图4S g A L M T1基因在柱花草叶和根(A)以及不同根段(B)中的表达F i g.4 E x p r e s s i o n s o f S g A L M T1i nv a r i o u s t i s s u e s o f S.g u i a n e n s i s注:图中不同字母表示不同组织间差异显著(P<0.05)N o t e:D i f f e r e n t l e t t e r s r e p r e s e n t s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s a m o n g v a r i o u s t i s s u e s a t P<0.052.6不同金属处理对S g A L M T1基因表达的影响从图5可以看出,与对照(C K)相比,铝(A l)处理显著增强了S g A L MT1基因在柱花草根中的表达,而镉(C d)和镧(L a)处理对S g A L MT1基因表达的影响不显著;在铝处理下,S g A L MT1基因的表达量是对照处理的7.5倍,差异显著(图5)㊂结果表明S g A L MT1基因特异地响应金属铝毒害㊂图5不同金属处理对S g A L M T1基因表达的影响F i g.5 E f f e c t s o f d i f f e r e n tm e t a l t r e a t m e n t s o n S g A L M T1e x p r e s s i o n注:C K,对照;A l,铝处理;C d,镉处理;L a,镧处理;图中不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)N o t e:C K,C o n t r o l;A l,a l u m i n i u m t r e a t m e n t;C d,c a d m i u m t r e a t-m e n t;L a,l a n t h a n u mt r e a t m e n t.D i f f e r e n t l e t t e r sr e p r e s e n ts i g n i f i-c a n td i f fe r e n c e s a m o n g v a r i o u s t r e a t m e n t s a t P<0.052.7不同铝浓度和铝时间处理对S g A L M T1基因表达的影响由图6A可以看出,随着铝处理浓度的增加,S g A L MT1基因的表达量逐渐增加,当铝浓度为200μm o l㊃L-1时,S g A L MT1表达量达到最高,是对照处理(0μm o l㊃L-1)的2.8倍;类似的,随着铝处理时间的延长,S g A L MT1基因的表达量逐渐增加,当铝处理48h后,S g A L MT1表达量最高,是0h处理条件下的110.0倍,差异显著(图6B)㊂2.8不同缺素处理对S g A L M T1基因表达的影响本研究进一步分析了缺氮(-N)㊁缺磷(-P)和缺钾(-K)处理对S g A L MT1基因在柱花草叶和根中表达的影响㊂如图7A所示,与对照(C K)相比,缺氮处理显著增强了S g A L MT1基因在叶中的表达,而缺磷和缺钾处理对S g A L MT1基因表达的影响不显著;与对照相比,缺磷处理显著增加了S g A L MT1基因在柱花草根中的表达,而缺氮和缺钾处理对S g A L MT1表达的影响不明显(图7B)㊂结果表明S g A L MT1基因在叶和根中对缺素的响应有所差异㊂2801第4期缪 野等:柱花草S gA L MT 1基因克隆与表达分析图6 不同铝浓度(A )和铝时间(B )处理对柱花草S gA L M T 1表达的影响F i g .6 E f f e c t s o fA l t r e a t m e n t s o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s (A )a n dd u r a t i o n s (B )o n S gA L M T 1e x p r e s s i o n 注:图中不同字母表示不同处理间差异显著(P <0.05)N o t e :D i f f e r e n t l e t t e r s r e p r e s e n t s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s a m o n g va r i o u s t r e a t m e n t s a t P <0.05图7 不同缺素处理对S gA L M T 1基因在叶(A )和根(B )中表达的影响F i g .7 E x p r e s s i o n s o f S g A L M T 1i n l e a v e s (A )a n d r o o t s (B )o f S .gu i a n e n s i s u n d e r v a r i o u sn u t r i e n t d e f i c i e n c y 注:C K ,对照;-N ,缺氮处理;-P ,缺磷处理;-K ,缺钾处理;图中不同字母表示不同处理间差异显著(P <0.05)N o t e :C K ,C o n t r o l ;-N ,n i t r o g e nd e f i c i e n t t r e a t m e n t ;-P ,p h o s p h o r u s d e f i c i e n t t r e a t m e n t ;-K ,po t a s s i u md e f i c i e n t t r e a t m e n t .D i f f e r e n t l e t -t e r s r e p r e s e n t s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s a m o n g va r i o u s t r e a t m e n t s a t P <0.053 讨论3.1 柱花草S gA L M T 1具备植物A L M T 膜蛋白的结构特征铝毒害是酸性土壤中限制作物生长和产量的重要障碍因素㊂在长期进化过程中,植物形成了多种耐铝毒机制,其中,调节根系分泌苹果酸是植物重要的耐铝机制之一[2,31]㊂此外,苹果酸也可作为渗透调节剂,参与气孔调节㊁矿质营养吸收㊁果实酸度和种子发育调节等过程[32]㊂铝激活苹果酸转运蛋白A L MT 被报道具有转运苹果酸的生物学功能[33-35]㊂因此,本研究克隆了柱花草S g A L MT 1基因,并对其蛋白结构进行了分析㊂以往研究发现,A L MT 家族成员具有高度保守的二级结构,包括含有5~6个跨膜结构域的N 端以及强亲水性的C 端[20]㊂N 端由不同的基序组成,是离子通道并参与铝信号传导,而C 端则调节了基因对铝离子的响应,这些高度保守的结构特征表明了它们对A L MT 蛋白的重要性[32,36]㊂与已报道的植物A L MT 蛋白相似,柱花草S gA L MT 1包含A L MT 蛋白的保守序列,且其N 端具有6个跨膜螺旋结构,表明柱花草S gA L MT 1具备植物A L MT 蛋白的典型结构特征㊂亚细胞定位分析发现,柱花草S g A L MT 1蛋白定位于细胞质膜上(图3),属于膜蛋白,进一步表明S gA L MT 1具有转运苹果酸的生物学功能㊂3.2 S gA L M T 1可能参与不同的生理过程蛋白系统进化分析表明,柱花草S g A L MT 1蛋白与大豆㊁水稻㊁拟南芥㊁番茄和小麦等植物A L MT蛋白被分在第3组(图2)㊂在该组中,大豆G m A L MT 1是一种质膜定位的苹果酸转运蛋白,铝处理会增强其编码基因的表达,进一步分析发现3801草地学报第32卷G m A L MT1具有介导根系分泌苹果酸,提高转基因大豆和拟南芥耐铝能力的功能[16]㊂在绣球花中, Hm A L MT9蛋白也具有增强酵母细胞耐铝能力的功能[37]㊂另一方面,拟南芥A t A L MT4,A t A L MT6和A t A L MT9均定位于液泡膜上,被报道参与调节了保卫细胞运动[38-39]㊂A t A L MT4可以介导液泡释放苹果酸,并且响应脱落酸而关闭气孔,表明A t A L MT4通过调节细胞内苹果酸稳态响应干旱胁迫[39]㊂A t A L MT6和A t A L MT9也参与了液泡苹果酸的运输,且它们在液泡苹果酸转运中存在功能冗余[38]㊂在番茄(S o l a n u m l y c o p e r s i c u m)中, S l A L MT5蛋白定位于内质网上,可以转运苹果酸和无机阴离子,如硝酸盐和氯化物,超量表达S l A L MT5提高了转基因番茄成熟种子中苹果酸和柠檬酸的含量,表明由S l A L MT5介导转运的苹果酸影响了成熟种子中有机酸的含量[40]㊂因此, S g A L MT1可能参与了柱花草不同的生理过程㊂3.3S g A L M T1基因可能通过转运苹果酸参与柱花草耐铝毒和低磷胁迫基因表达分析表明,铝处理增强了S g A L MT1基因在柱花草根系中的表达(图5和6)㊂研究表明,铝处理能增强小麦[41]㊁拟南芥[42-43]㊁大豆[16]㊁苜蓿[15]㊁油菜[19]和黑麦(S e c a l ec e r e a l e)[44]等植物A L MT同源基因的表达㊂例如,在大豆中,不同铝浓度和铝时间处理增强了G m A L MT1在根系中的表达,且G m A L MT1基因表达与根系苹果酸分泌密切相关[16]㊂在苜蓿中,不同铝时间处理也增强了M s A L MT1基因的表达,并且,超量表达M s A L MT1促进了转基因烟草根系苹果酸分泌,并增加了铝胁迫下转基因烟草的相对根长[15,45]㊂在绣球花中,铝处理增强了多个Hm A L MT s基因的表达,且外源表达Hm A L MT9能显著增强酵母细胞的耐铝能力[37]㊂以上结果表明,铝诱导表达的A L MT基因具有转运苹果酸㊁增强植物耐铝能力的生物学功能㊂另外,本研究发现,缺氮和缺磷处理分别增强了S g A L MT1基因在柱花草叶和根中的表达(图7),表明S g A L MT1可能参与了柱花草响应养分缺乏胁迫㊂类似的,大豆G m A L MT s家族成员对磷饥饿表现出不同的响应,其中,受缺磷增强表达的G m A L MT5具有转运苹果酸活化土壤难溶性磷的功能[17]㊂在柑橘(C i t r u s s i n e n s i s)中,缺磷处理也增强了C s A L MT1的表达,表明其可能参与柑橘对磷饥饿的响应[46]㊂小麦T a A L MT1和拟南芥A t A L MT1也被报道参与了植物对缺磷的响应[47-48]㊂另一方面,S g A L MT1基因在柱花草叶部的表达量高于根部,表明其在叶部中也发挥功能,但具体的生物学功能有待深入研究㊂4结论本研究克隆了柱花草S g A L MT1基因,发现S g A L MT1蛋白定位于细胞质膜上㊂铝处理增强了S g A L MT1基因在根中的表达,表明了S g A L MT1可能参与柱花草响应铝毒害㊂本研究为深入解析S g A L MT1介导苹果酸参与柱花草耐铝毒的生物学功能提供参考㊂参考文献[1] U R R A HMA N S,H A NJC,A HMA D M,e ta l.A l u m i n u mp h y t o t o x i c i t y i na c i d i ce 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