分子标记

缺口平移原理示意图
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5 以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
酶标系统标记法 末端标记法(End filling) 利用Klenow酶的催化活性，在粘性末端处合成互补链（即填补粘性末 端），从而达到标记放射性核素的目的 很少剪切DNA分子，但无法标记平末端DNA
末端填补法原理示意图 PCR标记法 在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记的dNTP，这样标记的dNTP就 可在PCR反应的同时掺人到新合成的DNA链上
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5 以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
1. RFLP标记(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)
称为限制性片段长度多态性,发展最早的DNA标记技术,1974年Grodzicker 等创立,是一种以DNA/DNA杂交为基础的第一代遗传标记 RFLP基本原理： 利用特定限制性内切酶酶切基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，DNA片 段数目和各片段的长度反应了DNA分子上不同酶切位点的分布情况；通过凝胶 电泳分析这些片段形成不同带，然后与克隆的DNA探针进行Southern杂交和放 射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱
随机引物标记法原理示意图
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5 以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
化学标记法 2-乙酰基芴标记法：利用N-乙酰基-2-乙酰基芴(N-ACO-AAF)与核酸进行反应，将AAF(2-乙 酰基芴)引入到DNA中，主要引入位点在鸟嘌呤的C-8位点，简单、快速、可生成稳定探针， 但2-乙酰基芴有毒，是致癌物质，使应用受到限制 硫代物标记法：通过硫代物在胞嘧啶C-6位点插入，单链的探针即得到标记，该反应在亚硫 酸氢钠催化下进行，约有10-15%的胞嘧啶被硫代 汞标记法：通过汞在胞嘧啶C-6位点位点渗入而使DNA得到标记，汞的毒性限制了应用 光亲和素标记法：用对光敏感的复合物如光亲和生物素、光亲和地高辛对探针DNA进行标记 引物原位标记法 引物原位标记法：先用一个特定的序列与靶序列杂交，然后在DNA聚合酶或反转录酶的作 用下，将已经的杂交的DNA作为标记的核苷酸原位渗入的引物进行标记的一种方法 克隆的DNA， 合成的寡核苷酸、PCR扩增的DNA均可作为原位标记反应的底物
DNA分子标记 限制性内切酶酶切 聚合链式反应（PCR）扩增 或两者结合
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3 理想分子标记的条件
(1)具有高的多态性 (2)共显性遗传，可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型 (3)能明确辨别等位基因 (4)遍布整个基因组 (5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组
(6)选择中性（即无基因多效性）
植物分子生物学实验技术
颜泽洪
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第三部分 主要分子标记
1 遗传标记及其发展 形态学标记 Morphological marker 细胞学标记 Cytological marker
生化标记 Biochemical marker
分子标记 Molecular marker
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2.遗传标记
形态学标记（morphological marker) 20世纪前 主要是一些表观上易于识别的性状 如植物的植株高度、花色等
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4 分子标记种类
2. 以PCR技术和电泳技术为基础的分子标记
RAPD：随机扩增多态DNA (Random Amplified Polymorphic DNA) AP-PCR：任意引物PCR (Arbitrary primed PCR) DAF ：DNA扩增指纹（DNA Amplification Fingerprinting） STS：序列标签位点 (Sequence Tagged Site) SSR: 微卫星(Simple Sequence Repeat) SSLP(Simple Sequence Length Polymorphism) SCAR：序列特异扩增区域 (Sequence Charactered Amplified Region) SPAR：单引物扩增反应 (Single Primer Amplification Reaction) SSCP：单链构象多态性 (Single Strand Conformation Polymorphism) ddF:双脱氧指纹法（Dideoxy Fingerprints, ddF) \ ISSR: 微卫星间DNA多态性(Inter-Simple Sequence Repeat) RAMP：随机微卫星扩增多态性 (Random Microsatellite Amplified Polymorphism) AFLP：扩增片段长度多态性 (Amplified Fragment Length Polymorphism) CAPS：剪切扩增多态性 (Cleaved Amplified Polymorphism Sequences) dCAPS：酶切特异扩增多态性 (Digested Character Amplified polymorphism sequences)
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5 以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
3. FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) ：荧光原位杂交 4. GISH (Genomic In Situ Hybridization)：基因组原位杂交 植物染色体原位杂交 基本原理： 根据核酸分子碱基互补配对原则（A-T、A-U、G-C)将放射性或非放射性 的外源核酸（探针，Probe)与染色体上经过变性的单链DNA在适宜条件下互 补配对，结合形成专一的核酸杂交分子，再经过相应的检测手段将待测核酸 在染色体上的位臵显示出来
优点
缺点
肉眼可见、直观方便
数量少 多态性差 易受环境条件影响 有些标记对农艺性状有不利影响
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2. 遗传标记
细胞学标记（cytological marker） 染色体数目变化 缺体 单体 三体 端体 等 染色体结构变异 缺失 易位 等 染色体分带 C G N带 缺点： 必需以熟练的细胞学技术作为支撑
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4 分子标记种类
3. 以DNA序列为基础的分子标记 SNP (Single Nucleotide Polymorphism) 单核苷酸多态性 ITS (Internal Transcribed Spacer) 转录间隔区 EST (Expressed Sequence Tags) 表达序列标签
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2. 遗传标记
生化标记（biochemical marker） 20世纪初 种子贮藏蛋白
品种鉴定 转化为PCR标记遗传多态性
同工酶 共显性遗传 品种指纹分析
位点数量不够 基因表达的组织特异性
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2. 遗传标记
DNA分子标记 20世纪80年代后期 分子标记概念的界定
广义: 指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质 蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的 酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶 的不同分子形式） 狭义: 指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳
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5 以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
探针标记
根据标记物质 放射性标记：32P、36S、3H等 非放射性标记：生物素、地高辛、荧光素等 根据标记系统 酶标系统标记法：利用修饰核苷酸合成标记核酸，可将放射或非放射标记物渗 入DNA,化学修饰的双螺旋DNA也可进行非放射性标记 缺口平移标记法(Nick translation) 末端标记法(End filling) 随机引物标记法 PCR标记法 化学标记法： 2-乙酰基芴标记法 硫代物标记法 汞标记法 光亲和素标记法 引物原位标记法
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5 以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
酶标系统标记法 缺口平移法(Nick translation) 制备放射性DNA探针的产用方法 以DNA酶消化双链DNA，得到 具有许多缺口的双链DNA。DNA聚 合酶I的5’-3’聚合作用能在缺口 的3’末端加入32P标记核苷酸并使 链得以延伸，该酶又具有5’-3’的 外切活性，能从缺口的5’末端去 掉核苷酸，这样缺口的两端一边 加入32P标记核苷酸，一边切割原 DNA链上的核苷酸，最后得到小片 段的放射性探针 可标记任何DNA,但在某些条 件下可导致DNA分子的剪切降解
(7)检测手段简单、快速（如实验程序易自动化） (8)开发成本和使用成本尽量低廉 (9)在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换）
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4 分子标记种类
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以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
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以PCR技术和电泳技术为基础的分子标记
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以DNA序列为基础的分子标记
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4 分子标记种类
1. 以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 限制性片段长度多态性 VNTR (Variable Number Tandem Repeat) 可变数目串连重复位点 FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) 荧光原位杂交 GISH (Genomic In Situ Hybridization) 基因组原位杂交
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以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
RFLP技术主要基本步骤：
DNA提取
Biblioteka Baidu
凝胶电泳分开 DNA片段
放射性标记 探针杂交 (Southern杂交)
限制性内切酶 酶切DNA
转移DNA片段 到支持膜上
显示特定的 DNA片段差异
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以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
2. 数目可变串联重复多态性 (Variable Number of Tandem Repeats，VNTR) 又称小卫星DNA (Minisatellite DNA)，是一种重复DNA小序列，为十到几 百bp，拷贝数10～10001不等。 基本原理：与RFLP大致相同，只是对限制性内切酶和DNA探针有特殊要求 (1)限制性内切酶切点不在重复序列中，以保证小卫星或微卫星序列的完整性 (2)限制性内切酶在基因组的其他部位有较多酶切位点，则可使卫星序列所在片 段含有较少无关序列，通过电泳可充分显示不同长度重复序列片段的多态性。 (3)分子杂交所用DNA探针必须是小卫星或微卫星序列，通过分子杂交和放射自 显影后，可一次性检测多个小卫星或微卫星位点，得到个体特异性DNA指纹图谱 优点：多态信息含量较高(17～19) 缺点：数量有限，且在基因组上分布不均匀 实验操作繁琐、检测时间长、成本高的缺点
它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异； 由于不同个体的等位基因之间碱基替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶 识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异
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以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
RFLP标记的主要特点 1. 无表型效应，RFLP标记的检测不受环境条件和发育阶段的影响 2. RFLP标记在等位基因之间是共显性的，因此在配制杂交组合时不受杂交方 式的影响 3. 在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应，因而互不干扰 4. RFLP标记起源于基因组DNA的自身变异，在数量上几乎不受限制 5. DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中 在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP转换成以PCR为基础的标记
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5 以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
DNA分子杂交：变性的双链DNA分子和带有互补性顺序的同源单链间的配对过程 探针：指经过放射性或非放射性等物质标记的已知或特定的DNA或RNA序列（通 常是与某DNA或RNA片段序列相同或相近的一段同源序列） 基因组DNA限制性酶切产生的酶切片段、利用基因克隆和细菌精确复制能力 获得大量单一的DNA限制片段（DNA顺序克隆），产生探针文库 可作为探针的DNA顺序克隆：特殊基因的DNA克隆、反转录DNA(cDNA)克隆、随机 的基因组DNA克隆、合成的特殊低聚核苷酸克隆、重复序列或多拷贝序列等 Southern blotting: 将电泳凝胶上的DNA直接转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上 的技术，用DNA探针与固定在膜上的DNA片段进行杂交再通过放射自显影（或特 殊检测手段）获得分子杂交的结果
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5 以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
酶标系统标记法 随机引物标记法 利用随机引物作为合成 DNA 探针的引物，通常是6个核苷酸 的寡聚核苷酸片段。这些寡聚核 苷酸片段包含了各种可能的排列 顺序，因此它们中总有一些片段 可结合到模板（探针）分子上去 充当引物。在DNA聚合酶的作用 下合成探针片段 这些片段一般比原模板短， 但由于合成片段多，因而标记效 果好