免疫细胞化学实验技能总结

免疫化学相关实验
技能
1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中
某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定
性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学
（ immunohistochemistry ）技术或免疫细胞化学
（immunocytochemistry）技术。
2、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理 , 组织切片或 细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标 记生物素、荧光素等的二抗进行反应，最后通过呈 色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光
（2）组织块在高浓度，特别是无水乙醇内不能放臵 的时间太长。无水乙醇吸水能力太强，容易造成组 织块的过度硬化，使得切片病理组织易碎裂。
（3）在脱水的过程中可以将组织块停留在70%~80% 的酒精中。
（4）每次更换新的脱水剂时（组织块从低浓度到高 浓度），都要把组织块放在吸水纸上吸干，以免将 水及低浓度脱水剂带入高浓度脱水剂中，影响脱水 效果。
固定的目的和作用在于：
①防止组织自溶和腐败； ②使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保 存下来从而保存细胞的各种组成成分使其保持与 生活时相近似的形态和结构；
③因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生 不同的折光率，造成光学上的差别，使原来在生 活情况下看不清楚的结构变得清晰易见，且有的 固定剂还有助染作用(如醋酸、苦味酸)，从而使细 胞各部易于染色； ④固定剂还兼有硬化作用，使柔软组织硬化而不易 变形，有利于操作。
固定
取材后，应立即进行固定。固定是制片极为关键 的一个步骤，制片质量的优劣除与材料的新鲜程度 有关外，还取决于最初的固定是否适当和完全。

固定的意义 新鲜的组织被割取后,由于细胞内酶的作用和细菌 的繁殖，可引起组织的自溶和腐败。因此，割取组 织块后，应立即采用一种方法．将组织尽可能保持 原有的形态结构，且有利于保存和适于制片的操作， 这一步骤称为固定。
（6）取材固定应同时作好记录，包括组织名称、固定液 和时间等内容。
脱水
乙醇：高浓度的酒精对组织有强烈收缩及脆化的缺
点，因此用乙醇脱水不能直接入纯酒精中脱水，
而必须经过由低到高的一系列不同浓度的酒精，
逐渐取代组织中水分，以保证组织脱水彻底，并
避免组织过度收缩和硬化。
注意事项：
（1）脱水的时间应根据组织块的大小和组织的类型 而定。
学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的
抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切
片上原位确定某些化学成分的分布和含量。
常用的标记物有荧光素、酶和放射性同位素：
标记荧光素的称为免疫荧光法，常用的荧光素有异硫氰 酸荧光素(FITC)、罗丹明(rhodamine)等。
标记酶的称为 免疫酶法 ，常用的酶有辣根过氧化物酶
10%甲醛 4%多聚 甲醛 固定效果 好 好
源自文库
名称
苦味酸 沉淀一 切蛋白 大 不单独 使用
冰醋酸 对染色 质固定 好 小 不单独 使用--核型 使组织 膨胀， 一般不 单独使 用
锇酸 好
组织收缩
大
小 免疫化 学
小 电镜
主要用途 常规病理 切片 缺 点
长期用其 固定的 渗透力 固定的组 时间不 弱，对 织变为酸 宜太长， 组织收 性不利于 以24小 缩大 染色，特 时以内 别是细胞 为宜 核的着色
3．用二甲苯或氧仿清除
（2）冰冻切片的制作
取材 冰冻胶固定 冰冻切片机切片
展片
(一）优点： 1．简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等 手续即可进行切片，减少了一些中间环节。 2．快速，用时短。
3．组织变化不大。
4．能很好保存脂肪，类脂等成分。
5．能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对
4．蜡块的一边较另一边为软
或两边的硬度不一致 5．材料未居蜡块正中央
6．在大的一边切去少许石蜡
6．材料大而形不正
缺 点：切片分离、不能连成 带状 原 因： 1．室温过低
补救办法：
1．在切片机上方开一电灯或提 高室温
2．石蜡过硬
3．材料边缘留蜡太少 4．刀的角度不适合
2．在蜡块面加一层45℃的软蜡 或用手指蜡摩擦块面
3．重新包埋 4．矫正刀的角度
缺 点：切片卷起呈圆筒状
原 因： 1．室温过低
补救办法： 1．提高室温 2．加软蜡 3 用毛笔将蜡片摊开压住，切 2—3 片即成带 4．减小倾角
2．石蜡过硬
3．刀口太钝 4．刀的倾角太大
缺 点：切片粘附于切片刀， 皱摺在一起 原 因： 1．室温过高 2．石蜡过软
补救办法：
透明
臵换组织内的脱水剂，为下一步的浸蜡起到桥梁作用； 二甲苯：是现在应用最广的一种透明剂，价格较便宜，不能 和水混合，遇水则变成乳白色浑浊，因此必完全脱水后才
能使用；易溶于酒精又能溶解石蜡，透明力强；
其最大的缺点是容易使组织收缩变硬变脆，所以组织不能在 其停留过久，透明时间视组织块的大小、性质而定；有的 组织如肌肉、肌腱、软骨、骨、皮肤、头皮及眼球等，不 宜用二甲苯透明，因组织过硬不易切片；长时间接触，对
1．降低室温 2．将蜡块投入凉水中稍浸 3．切片厚度，改用硬蜡包埋， 用二甲苯拭去刀口的石蜡 4．磨刀或移动刀口
3．刀口上留有一层石蜡
4．刀口钝
缺 点：石蜡块将蜡带抬起
原 因： 1．由于摩擦而产生静电荷所 致 2．石蜡块上面附有石蜡碎屑 3．刀口上附有石蜡碎屑
补救办法： 1．提高室温
2．用刀片将碎屑清除
缺 点：材料发生裂隙破碎或 脱落
原 因：
常见问题分析
补救办法：
1．脱水不干净
2．有透明剂残留 3．石蜡透入时，温度过高或 时间过长 4．由于脱水剂和透明剂的影 响，使组织变硬发脆 5．材料太硬或太粗
1．无法弥补
2．增加浸蜡时间，重新包埋 3．无法补救
4．用正丁醇、叔丁醇和二氧六 环等进行脱水和透明
脱蜡、复水 抗原修复 细胞通透 封闭 一抗孵育
浸洗
二抗孵育
浸洗
DAB显色 封片、镜检
脱蜡和复水：这是为了后面的抗体等试剂能够充分
与组织中抗原等结合反应。若脱蜡和水化不全易
出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背
景着色。
抗原修复：由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛 固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭
5．在蜡块表面涂一薄层火棉胶 溶液
缺 点：石蜡带弯曲不直 原 因： 1．石蜡块上下两边不平行 2．石蜡块的上下两边不和刀 口平行 3．刀口锋利不一，局部产生 差异
补救办法：
1．取下台木，将两边修干 2．调节标本台，使两者平行 3．移动刀片，改用新的刀口 4．待蜡块冷却后再切，或重新 包埋 5．用刀片切去部分石蜡，使材 料居中
透明、浸蜡
包埋、切片 展片、烤片
取材



根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要 求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、 干枯。 所采集材料应立即放入固定液，并编号，注明采 集时间、名称、组织部位，所取组织块要大小适 当，即要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能 力。 如：角膜、TE-HC等组织材料 细胞材料 肝脏、鱼卵
⑤包埋框或纸盒内的蜡逐渐凝结，若表面已凝结形成一层固 体状，即可放入冷水中，加速其凝固。
⑥待蜡块完全凝固以后，便可拆卸包埋框架， 或拆开纸盒， 取出蜡块。
（2）注意事项
①包埋时夹取组织的镊子，用酒精灯随时烧热，以免石蜡凝 结后粘附在镊子上，造成蜡块凝固不均匀。 ②包埋操作要迅速，组织从浸蜡杯中取出臵入包埋框中的时 间应尽量缩短。 ③包埋后的蜡块应呈均质半透明状，如果出现白色混浊状， 一般出现在组织周围或组织的底部，应考虑这样几个方面 的问题：a. 脱水不彻底。b.包埋蜡温度低了，组织进行包 埋时，包埋框中的蜡已成凝结状。c.组织内还残留有较多 的透明剂。d.石蜡不纯。 ④包埋箱中的温度必须保持恒定。 ⑤如包埋得不好，可将蜡块溶化，重新浸蜡和包埋。 ⑥较小的组织可在脱水透明时开始用伊红染色
(horseradish peroxidase)等。
标记同位素的称为 放射免疫法 ，常用的同位素有 3H 、
14C、32S和31P等。
讲解提纲
一、石蜡切片/冰冻切片
二、免疫酶/免疫荧光 三、酶联免疫吸附试验
（1）石蜡切片的制作
取材、固定 洗涤 酒精脱水
蒸馏水洗涤2遍
50％、 70％ 、80％酒精各15 min ，95％ 酒精Ⅰ、Ⅱ各15 min， 无水乙醇Ⅰ 、Ⅱ各 15 min，无水乙醇/二甲苯(1:1) 15 min 二甲苯约20min、二甲苯/石蜡(1:1) 30min, 纯蜡Ⅰ、Ⅱ各30min 常规石蜡切片，切片厚度为7 µm 于干净载玻片上进行展片，37℃烤干
展片
用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后的脱 蜡、水化及染色等步骤中二者滑脱开。粘附剂是甘油蛋白。 首先在洁净的载玻片上涂抹薄层甘油蛋白，再将一定长
度蜡带（连续切片）或用刀片断开成单个蜡片于温水
（45℃左右）中展平后，捞至玻片上铺正，最后用滤纸吸 除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥，也可在37℃ 温箱中干燥，但需适当延长时间。
作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细
胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。
常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压
修复、微波修复、胰酶修复。一般用微波修复中
火6min*4次，效果不错。注意微波修复后自然冷
却 30min 左右（只要你觉得修复液的温度达室温
即可）。
细胞通透：目的是使抗体能够充分地进入胞内进行
切片
包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许
热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式 切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行， 旋紧。 切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切 片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。 通常切片厚度为4～7微米，切出一片接一片的蜡带， 用毛笔轻托轻放在纸上。
粘膜有刺激作用。
浸蜡
（1）浸蜡的目的 臵换组织中的透明剂，为包埋做准备。 （2）注意事项 温箱中的温度必须严格控制在60℃的范围，不能 超过60℃；浸蜡时间不宜过长。 浸蜡温度过高或时间过长使组织收缩过度收缩和脆 变。
包埋
（1）步骤 ①准备包埋蜡：一般应用硬蜡（56~58℃或60~62℃），所 用的石蜡要求透明无杂质，新的石蜡要反复熔凝，并有一 定的粘韧性。包埋用过的石蜡可以反复使用。 ②准备包埋框：可以用金属的，也可以用硬纸摺叠。 ③点燃酒精灯，准备好无齿尖镊子，需作标记应先写好标签。 ④在包埋框中倒入硬蜡，然后用无齿镊子取组织块放入石蜡 中，臵好方向。
于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面 抗原和水解酶保存较好。
（二）缺点： 1．不容易做连续切片。 2．切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织
冻结不均，影响切片及染色效果。
3．不容易制作较薄的切片。 4．组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的 形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切 片清晰。
石蜡切片和冰冻切片的比较
名称 石蜡切片 冰冻切片
操作步骤
抗原活性 切片厚薄 优点 缺点
繁琐
可能会破坏组织的抗 原性 薄 薄，观察结构清晰； 连续切片 做免疫组化时部分需 抗原修复
简单
完好地保存各种抗原活 性及酶类 厚 抗原活性好，适合免疫 组化；简便操作 不能连续切片；不能较 薄切片
（3）免疫酶法
价格昂 贵；有 毒
混合固定剂 （1）Bouin氏固定液：为常用的良好的固定剂，穿透速度快， 组织收缩性较小，固定均匀，固定后组织有适当的硬度， 对于切片和染色均有良好的效果。一般固定12~24小时，
固定后入70%酒精洗去苦味酸的黄色，在脱水时经各浓度
酒精也可洗去黄色。 （2）Carnoy液：渗透力强，特别适宜于固定染色体、肝糖、 粘液等一些较为细微的结构。显示DNA、RNA效果良好。 （3）改良Bouin氏固定液：此液对一般组织固定效果都很好， 固定时间为4~18小时，固定后直接放70%乙醇脱水，固定 时间较长对组织亦无损害。
固定时应注意的事项
（1）固定液及被固定的组织必须新鲜； （2）固定液的用量一般为组织体积的10~20倍，容器不 要过小，材料也不要太多；应避免组织紧贴瓶底或瓶壁， 以免影响固定液的渗入； （3）固定时间视组织块的种类、性质、大小，固定液的 种类、性质、渗透力的强弱，固定时的温度的高低，实 验目的等； （4）固定所用的固定液，以新配的为好，放臵过久会失 效； （5）在固定期间摇动组织或摇动容器有利于固定液的渗 入，对长期固定的标本，可经常更换固定液;