大肠杆菌的分离和培养
实验1-大肠杆菌的培养与分离
原核生物界
真菌
真菌界
原生动物 原生生物界
特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光 学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结 构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.
细菌的外形与大小
大肠杆菌属于杆状菌
细菌的营养类型
根据细菌所利用的能源和碳源的不同将细菌分 为两大营养类型。
自养菌:
二是存留在划破处的单个细胞无法 形成规矩的菌落，菌落会沿着划破 处生长，会形成一个条状的菌落。
（四）大肠杆菌的划线分离
1、划线分离法
注意事项: 1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续 划线多次. 2.划线首尾不能相接 3.划线后,培养皿倒置培养12~24h
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前 都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需 要灼烧接种环吗？为什么？
划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。 涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。
分离后,一个菌体 便会形成一个菌 落,这是消除污染 杂菌的通用方法, 也是用于筛选高 表达量菌株的最 简便方法之一
（五）大肠杆菌分离后保存
1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成 后置于4℃冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形 的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、 高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的 芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随 风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽 孢又可以萌发，形成一个细菌.
【课堂练习】
例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ D） A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量
实验一大肠杆菌的分离和培养
细菌
2.微生物涉及五类 放线菌
真菌
原生动物
(二)培养基
• 1.分类(按物理形态分) • (1)液体培养基 • (2)固体培养基
①常用旳固体培养基: 琼脂固体培养基.
②微生物在固体培养基 表面生长,能够形成 肉眼可见旳菌落.
2.培养基内所含旳基本物质
• (1)水 • (2)碳源 • (3)氮源 • (4)无机盐
a.灼烧灭菌
注意合用范围
微生物旳接种工具 (接 种环、接种针)或其 他金属用具直接在火 焰旳充分燃烧层灼烧
b. 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h
能耐高温旳需要保持干 燥旳物品( 玻璃器皿)
c.高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
一般用于培养基旳灭菌
二、试验操作 • （一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
• 计算－称量－溶化－灭菌－倒平板
• （二）分离纯化大肠杆菌
• 接种措施有：
• 划种未接 种旳培养基放入37℃恒温箱中培养12h 和24h后，观察并统计
三、课题延伸：菌种旳保藏
• 1、斜面保藏 • （临时保存） • 2、甘油保藏
（长久保 存）
试验1：大肠杆菌旳培养和分离
角烧瓶旳液体培养基中，三角烧瓶在37℃摇床振荡培养 12h。 • (4) 划线分离：将摇床上培养12h旳菌液在固体培养基旳 平板上连续划线，然后将盖好旳培养皿倒置，放在37℃ 恒温培养箱中进行培养。 • (5)单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环取 出，再用划线法接种在空白斜面上，在37℃下培养24h, 4℃冰箱保存。
设备及用具：
灭菌锅或高压锅、250ml旳三角瓶、封口膜和橡皮圈、 直径90mm旳培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培 养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有 酒精棉球旳广口瓶、镊子、有棉塞旳试管 （15mm×120mm）5支
《大肠杆菌的培养和分离》实验设计
《大肠杆菌的培养和分离》实验设计实验目的：1. 掌握大肠杆菌的培养方法和分离技巧。
3. 培养和分离大肠杆菌是许多生物技术实验的基础，通过本实验的学习，同学们可以更好地开展相关生物技术实验工作。
实验原理：大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，在微生物学及相关学科的研究中具有重要意义。
为了能够更好地开展生物技术实验，需要掌握大肠杆菌的培养方法和分离技巧。
在培养大肠杆菌时，我们一般选用LB培养基（Luria-Bertani培养基），它是一种营养丰富的培养基，可以满足大肠杆菌的营养需求。
在制备LB培养基时，需将适量的蛋白胨、酵母提取液和纯化水混合均匀后加热至沸腾约1分钟，然后加入适量琼脂糖，搅拌均匀后装入烧瓶中。
分离纯化大肠杆菌时，需要将样品（如肠道内容物、污水等）进行稀释，使其细菌浓度达到一定范围，然后在LB培养基上进行平板培养。
在培养过程中，需要控制培养温度、时间和氧气浓度等因素，以促进大肠杆菌的生长和繁殖。
随着时间的推移，大肠杆菌会在平板上生长成大量的细菌菌落，此时，我们可以将单个细菌菌落挑选出来进行分离纯化，以得到单一纯化的大肠杆菌。
实验材料与仪器：材料：LB培养基、螺旋细胞均一器、平板培养基、霉菌试验纸、吸管、医用酒精、胶体金离子分离剂等仪器：高压灭菌器、移液管、显微镜、细胞计数板实验步骤：1. 制备LB培养基。
2. 取样和稀释。
取样品（如肠道内容物、污水等），取适量于吸管中，并将其进行稀释，使其细菌浓度达到一定范围。
3. 平板培养。
将LB培养基倒入平板中，恰好覆盖平板的整个表面。
待培养基凝固后，使用螺旋细胞均一器将取样液均匀滴在培养基表面上。
将平板置于37℃恒温箱中，控制温度和氧气浓度等因素，待大肠杆菌细菌菌落生长到足够数量时，进入下一步。
4. 分离纯化。
将平板上的大肠杆菌细菌菌落挑选出来，使用吸管将细菌菌落转移到新的平板中进行分离纯化。
一般建议选择较小的细菌菌落进行挑选，这样可以减少细菌间的竞争，提高挑选单一菌株的成功率。
大肠杆菌培养和分离
大肠杆菌培养和分离超净台实验准备工作2灭菌和消毒无菌操作目的：为了避免被杂菌污染。
1对实验操作空间：超净台：紫外线灭菌，过滤风桌面：酒精擦拭，酒精灯外焰附近操作2.操作者衣服和手进行：清洁和消毒，70%酒精3.避免已灭菌处理的材料用具和周围物品的接触消毒的方法1、100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、用70%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒4、氯气、高锰酸钾消毒……（1）消毒：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。
消毒与灭菌的区别（2）灭菌：灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。
以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌的过程。
实验1大肠杆菌的培养和分离超净台上紫外灯和过滤风实验过程：准备阶段：1培养基的配制，2灭菌和消毒操作阶段：1倒平板：分装固体培养基倒平板：将已灭菌的固体培养基倒入培养皿的过程。
分装培养基：1倒平板：将灭菌后的固体培养基倒入培养皿培养基冷却到60度时倒入2培养基的分装（试管，三角瓶，培养皿）倒入三角瓶和试管（漏斗法）1.培养基灭菌后，需要冷却到60℃左右时，才能用来倒平板。
你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
朊病毒就是蛋白质病毒，是只有蛋白质而没有核酸的病毒。
1997年诺贝尔医学/生理学奖的获得者美国生物学家斯垣利·普鲁辛纳(S.B.Prusiner)就是由于研究朊病毒作出卓越贡献而获此殊荣的。
细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，它使得这层壁坚韧并富有弹性。
一旦失去细胞壁，所有的细菌都将变成球形。
细菌细胞壁的主要功能是保护细胞、维持细胞形状、协助鞭毛运动等，而且还与细菌的抗原性、致病性和对噬菌体的敏感性有关。
实验1：大肠杆菌的培养和分离
天然培养基
(根据用途)：
全营养培养基：含有微生物生长所需各种营养，
用于微生物生长和增殖
选择培养基：添加或减少某种成分，从多种微
生物中分离出所需的微生物
鉴别培养基：加入某种指示剂或化学药品，鉴
定是否含有所要测定的微生物
一、基础知识
（二）培养基： 2、培养基的营养成分：
种 类 查氏培养基 成 分 NaNO3 0.3g 、 KCl 0.05g 、 K2HPO4 0.1g 、 FeSO4 0.001g 、MgSO4•7H2O 0.05g、蔗糖 3g 、 H2O 100g
麦芽汁培养基
干麦芽粉加四倍水
一、基础知识
（二）培养基： 供微生物等生长繁殖所需的人工配制的营养
液体培养基 1、分类(按物理状态)： 半固体培养基 固体培养基
60~80℃烘 箱中烘干
•操作步骤： 加塞封口、包扎 —— 灭菌 ——烘干
•通常试管用棉塞(2/3在试管 内)，三角瓶用封口膜或纱布。 •作用：既通气又阻止杂菌进 入 •不能用脱脂棉(易吸水引起污 染)。 用牛 皮纸 或报 纸包 扎 •放入高压蒸汽灭菌锅, 在121℃(1Kg/cm2压 力)下灭菌15min。 •培养基中若有葡萄糖, 用500g/cm2压力(90 ℃以上)灭菌30min。 防止葡萄糖分解碳化 •不能加热灭菌的化合 物(如尿素)，只能用 G6玻璃砂漏斗过滤。 细菌不能滤过G6
灼烧灭菌 干热灭菌 高压蒸汽灭菌
灼烧灭菌
用于接种工具(接 种环、接种针)或 其他金属用具。
干热灭菌
160－170℃；1－2h 用于能耐高温的需要保持干燥 的物品(如玻璃器皿)。
高压蒸汽灭菌
121℃(1Kg/cm2压力)；15min 最常用。通常用于培养基及各种 器具的灭菌。
大肠杆菌的培养和分离
培养基种类
物理状态
• 液体培养基 • 固体培养基 • 半固体培养基
工业生产、 工业生产、连续培养 菌种分离、鉴定、计数 菌种分离、鉴定、 菌种保存
培养基种类
化学成分
• 合成培养基 • 天然培养基
菌种分类、鉴定 菌种分类、 工业生产降低成本
培养基种类
添加某种指示剂后化学药剂用于菌种的鉴别
目的用途
•鉴别培养基 鉴别培养基 • 选择培养基
伊红—美蓝鉴别大肠杆菌 伊红 美蓝鉴别大肠杆菌
添加或缺少某种化学成分用于菌种的分离
1：加抗生素，用于分离真核生物和原核生物 ：加抗生素， 2：加高浓度的食盐获取金黄色葡萄球菌 ： 3：缺N源，分离固氮微生物 ： 源 4：缺少有机C源，分离自养型微生物 ：缺少有机 源
消毒方法
2、对一些不耐高温的液体，使用巴氏消毒法（80℃中15min 、对一些不耐高温的液体，使用巴氏消毒法（ ℃ 或70 ℃中30min，实际生产中常用于鲜奶的消毒） ，实际生产中常用于鲜奶的消毒） 3、对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒碳酸和煤酚皂等 、对接种室、 溶液以增强消毒效果， 溶液以增强消毒效果，然后用紫外线进行物理消毒 4、双手使用酒精进行消毒 、
划线分离法
由接种环以无菌操作沾 取少许待分离的材料， 取少许待分离的材料， 在无菌平板表面进行平 行划线或其他形式的连 续划线， 续划线，微生物细胞数 量将随着划线次数的增 加而减少， 加而减少，并逐步分散 开来， 开来，如果划线适宜的 话，微生物能一一分散 经培养后， ，经培养后，可在平板 表面得到单菌落。 表面得到单菌落。 连续划线法 交叉划线法
包器材
包器材
灭菌
条件： 条件： 121℃、 121℃、100kPa 2020-30min
微生物的利用-大肠杆菌的培养与分离
实验原理
① 培养基 ② 大肠杆菌 ③ LB液体培养基和LB固体培养 基 ④ 划线分离法 ⑤ 菌种的低温保存 ⑥ 无菌技术
一、培养基定义及营养成分
1、定义 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长 繁殖的营养基质，称为培养基。 2、营养成分 培养基中的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源、生长 因子等
• 主要方法：无菌室 无菌柜 超净工作台
• ② 无菌实验器材： 凡是实验中使用的器材，能灭菌处理的必须 灭菌。 • 如玻璃器皿 （包括注射器、吸管、滴管、三角瓶、试管等）、培 养基、无菌衣 、口罩等，无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处 理，例如无菌室内的凳、试管架、天平等，这些虽然无法灭菌， 但是可以消毒，可用化学药品熏蒸、喷洒或擦拭。
• 2、营养成分 • ① 碳源 • 为微生物提供碳元素的物质，可分为有机碳源和无机碳源 • 。如 CO2、NaHCO3 等无机碳源； • 糖类、石油、花生粉饼等有机碳源，异养微生物只能利用有机碳 源；单质碳不能作为碳源。 • 注意：碳源&能源的辨析
• 2、营养成分 • ② 氮源 • 为微生物提供氮元素的物质，可分为有机氮源和无机氮源 • 。有机氮源包括牛肉膏，蛋白胨等， • 无机氮源包括 N2、NH3、NH4+、NO3-等，只有固氮微生物才能利 用 N2。
微生物的利用
1大肠杆菌的培养和分离 2分离以尿素为氮源的微生物
大肠杆菌的培养和分离
• 实验目的 • 实验原理 • 实验器具与材料 • 实验步骤 • 实验结果和结论 • 知识拓展
实验目的
• 利用LB液体培养基进行大肠杆菌的扩增培养的操作 • 利用LB固体平面培养基划线培养进行大肠杆菌的分离 • 说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理
实验1大肠杆菌的培养和分离ppt课件
2、成分
水、碳源、氮源、 无机盐、生长因子
(生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的 化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)
不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方
调节pH
真菌：5～6 细菌：6.5 ～ 7.5
有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压
四、无菌操作
1.无菌操作的概念
无菌操作杂泛菌指在培养微生物的操作中，所有防止________污染的方法。
每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下 一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的 增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。
2、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？ 为什么？
划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和 感染操作者。
大肠杆菌在人体的_____中一肠般道对人体无害，但任何 大大肠肠杆杆菌菌如是_果_进__入_____工__程__中_被__广_泌都泛尿会采系对用统人的体工产具生。危害。
基因
质粒、 EcoRⅠ限制酶、
E.coli-DNA连接酶、
受体细胞
菌落的概念
菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量生长 繁殖时，所形成的肉眼可见的具有一定形态结构 的子细胞群体。
天然培养基：
天然培养基有血清、 血浆、和组织提取液 （如鸡胚和牛胚浸 液）。 优点：营养成分丰富， 培养效果好 缺点：来源受限;成分 复杂，影响对某些实 验产物的提取和实验 结果的分析;易发生支 原体污染;
人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和 繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。
主要包括：
_各__种__器__具__必须无菌、 __培__养__基___也必须要无菌、 ___________时不能带入其他杂菌
大肠杆菌的培养和分离
1
2.请你判断以下材料或用具是否需要 消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的 方法。
（1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
二、大肠杆菌的培养和分离实验操作
（一）培养基的配置与灭菌
取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养 基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上 封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。
划线分离法注意事项:
1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不 同位置连续划线多次.
2.划线首尾不能相接
3.划线后,培养皿倒置培养12~24h
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时， 才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的 温度？
答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶， 感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可 以进行倒平板了。
一、大肠杆菌（E. coli）
兼性厌氧的肠道内的共生菌群
合成维生素B和维生素K，供机体利用； 产生大肠杆菌素，抑制肠道致病菌和 腐生菌滋生。
革兰氏阴性菌
作为一种工程菌， 在基因工程技术中被广泛采用。 例：大规模生产治疗糖尿病的药物——胰岛素
培养基（culture media）
按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的 供其生长繁殖的营养基质。
b. 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h
能耐高温的需要保持干 燥的物品( 玻璃器皿)
c.高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
通常用于培养基的灭菌
高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌法为湿热灭菌法，其优点有三： 1、湿热灭菌时菌体蛋白容易变性； 2、湿热穿透力强； 3、水蒸汽变成水时可放出大量热增强杀菌效 果，因此，2）灭菌：
试验1大肠杆菌的培养与分离
.实验1：大肠杆菌的培养和分离一、教学要求二、基本内容1．培养基的种类和化学成份培养基的种类有很多划分标准，按物理性质分：固体培养基和液体培养基（加入琼脂多少）。
液体培养基用于扩大培养和工业生产，固体培养基用于菌种分离，鉴定，计数（菌落数量）。
培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。
按照微生物的同化作用类型是自养还是异养，碳源不同，自养微生物为无机碳源，如硝化细菌是二氧化碳或碳酸盐，异养微生物为有机碳源，如大肠杆菌是葡萄糖等有机物。
2．常见微生物类群原核生物（如细菌大肠杆菌――二分裂、革兰氏阴性、异养兼性厌氧性肠道杆菌、蓝藻、支原体、衣原体、放线菌等）、原生生物（草履虫、变形虫等）、真菌（酵母菌――出芽生殖.异养兼性厌氧性微生物、霉菌、食用菌）、病毒等。
细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核，只有一环状DNA分子（拟核）。
以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。
用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌（革兰氏染液染色后，再脱色处理，细菌仍保留染色液的颜色）和革兰氏阴性菌两大类，区别在细胞壁的成分不同。
大肠杆菌是革兰氏阴性（细胞壁薄，有荚膜）、兼性厌氧的肠道杆菌。
3．无菌技术对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。
灭菌方法：。
灼烧灭菌法①接种环、接种针、试管口等使用..②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱。
③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。
④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。
4．培养基的配制原则目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。
营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。
pH要适宜：细菌培养基pH中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。
实验1：大肠杆菌的培养和分离
04 实验结果与分析
大肠杆菌的培养结果
培养基上生长情况
大肠杆菌在培养基上生长良好，菌落 形态呈圆形、湿润、表面光滑，颜色 为乳白色。
生化反应
大肠杆菌能够发酵乳糖产酸，在生化 反应中表现出特定的特征性变化。
菌落计数
通过菌落计数，我们得到了大肠杆菌 的菌落数量，菌落数量在适宜的条件 下随着培养时间的延长而增加。
详细描述
将接种后的培养皿放置在恒温培养箱中，保持适宜的温度和湿度。在培养过程中，要定期观察大肠杆 菌的生长情况，记录生长曲线，以便后续分析。培养过程中要保持培养皿的清洁，防止杂菌污染。
大肠杆菌的分离
总结词
分离是通过一定的技术手段将目标微生物从混合菌群中单独 获取的过程。
详细描述
在大肠杆菌培养完成后，采用涂布法或划线法将菌落分离， 获得单菌落。分离过程中要保证无菌操作，避免交叉污染。 分离得到的单菌落可用于后续的鉴定和实验研究。
了解大肠杆菌的生物学特性
了解大肠杆菌的形态、染色、生化反 应等生物学特性，能够通过实验结果 判断所分离的菌株是否为大肠杆菌。
了解大肠杆菌的致病性，包括其产生 的毒素、侵袭力、抵抗力等方面的特 性，为后续实验和研究提供基础。
掌握微生物实验的基本操作
掌握微生物实验的基本操作，包括无菌操作、显微镜使用、细菌计数、菌种保存 等，能够独立完成微生物实验。
条件致病菌
在特定条件下，大肠杆菌可引 起肠道外感染，如败血症、新
生儿脑膜炎等。
抗原结构
大肠杆菌具有O抗原、H抗原 和K抗原，可用于血清学分型
。
大肠杆菌的培养基
01
02
03
基础培养基
如肉汤培养基、营养琼脂 培养基等，提供大肠杆菌 生长所需的基本营养成分。
实验1大肠杆菌的培养和分离
实验1大肠杆菌的培养和分离篇一：实验1大肠杆菌的培养和分离实验教学提纲实验1大肠杆菌的培养和分离教学提纲实验目的1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。
2.进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的划线培养。
3.说明大肠杆菌的培养条件和操作要求的原理。
实验材料1.配制LB液体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，加水50mL溶解。
2.配制LB固体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，琼脂1g，加水50mL溶解（配制LB固体培养基是用来倒平板和倒试管斜面）。
实验步骤1.培养基灭菌。
在两个150mL的三角瓶中分别装入50mLLB液体培养基和50mLLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜(一种塑料薄膜，中间有小孔的滤膜。
既可以通气，又不使细菌进入。
)。
将培养皿用牛皮纸包好，放入高压灭菌锅中，1kg压力灭菌15min（有压力时开始计时）。
同时将需要灭菌使用的培养皿、试管、三角瓶等和所用器械（接种环、镊子等）等一块灭菌。
2.倒平板，倒斜面。
灭菌后。
待高压锅压力与大气压相同时，打开锅盖，将有培养基的三角瓶、试管、培养皿等放在灭菌后的超净工作台上。
超净工作台操作：打超净工作台的紫外灯（注意：打开紫外灯后人必须离开），持续30min，关闭紫外灯，打开过滤风和白炽灯。
将有培养基的三角瓶和培养皿放在灭菌后的超净工作台上后，点燃酒精灯，用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面，并用酒精棉球擦手。
待固体培养基冷却到60℃时（手放上还有些热的时候），在酒精灯火焰旁，以右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的封口膜，右手其他三个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖的一边，将三角瓶的培养基约10～20mL倒入1个培养皿中。
倒入后立即置于水平位置上，轻轻摇晃，使培养基铺满培养皿底，待凝，使之形成平面。
倒斜面（试管内空白斜面），用玻璃漏斗倒入试管内，每试管2mL。
大肠杆菌的培养和分离
4．用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾 以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上 排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。 当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力 至所需时间。因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀 压，所以，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于 饱和蒸汽的温度。 5．灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌 锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开 排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如 果压力 未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力 突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡 而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发 生污染。 6．将取出的灭菌培养基放入 37℃温箱培养24小时， 经检查若无杂菌生长，即可待用。
2、无菌操作 打开滤风机，点燃酒精灯
用酒精棉球擦拭双手。打开培养皿、试管外包纸， 平放。 转接过程中，瓶塞和封口膜只能夹持手上，不许 落台面；操作过程在酒精灯火焰旁操作；接种环 接种前，环头烧红，环柄火焰上穿梭1~2次，放 入试管和培养皿中稍冷却后接触菌落或菌液，使 用完毕后，重复使用前操作，避免菌外泄；使用 玻璃刮刀和镊子时，从酒精中取出后燃尽其上酒 精即可。 胆大心细，动作快捷
平板培养基倒好冷却凝固后，不论接种还 是恒温培养，都需倒放，如正方，水蒸气 在盖上凝成水滴，滴到接种后的培养基表 面会冲散菌落，失去分离菌株的效果。
灭菌与消毒
杀死或除去一切微生物的方法——灭菌 杀死病原菌的方法——消毒
灭菌方法分类 （1）干热灭菌法 （2）湿热灭菌法 （3）过滤灭菌法 （4）紫外光灭菌法 （5）化学药剂灭菌法
多数细菌、酵母菌不形成菌丝，其菌落仅 生长在固体培养基表面，可用接种工具将 其全部挑起，即与培养基结合不紧密 。菌 落表面光滑而湿润，有黏稠性。
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问题2：在培养过程中如何进行维持无菌状态？ 消毒VS灭菌
较为温和的方法，如酒精
强烈，完全无菌
芽孢为细菌的休眠体， 对不良环境有很强耐受性
灭菌消毒技术是微生物有关工作中 最普通也是最重要的技术。
灭菌消毒技术大汇总 1、高压蒸汽灭菌法
1kg/cm2、121 ℃下维持15min. 0.5kg/cm2、90 ℃下维持30min.
大肠杆菌的培养和分离 微生物简单介绍 病毒 细菌 放线菌 真菌 原生生物
放线菌
• 单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖 时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定 形态结构的子细胞群体（种群） • 菌落是鉴定菌种的重要依据
• 结构 • 异养型，兼性厌氧型，革兰氏阴性(红色)(G-) • 应用
问题1：用什么培养大肠杆菌？（稀释）涂布分离法1、玻璃刮刀放在酒精溶液中待用 2、取出时要经过灼烧 稀释10-5—10-7倍， 3、一般要稀释菌液进行培养 取0.1ml不同浓度的稀释液
4、大肠杆菌的培养和分离的过程
一 配制LB培养基,并灭菌 计算称量 溶解 调pH 分装 加塞，包扎 灭菌
二 倒平板、制斜面 三 大肠杆菌的培养 四 大肠杆菌的分离 使所需细菌大量繁殖 获得单菌落，纯化菌株
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4· 7H2O 葡萄糖 尿素
1.4 g 2.1 g 0.2 g 10 g 1 g
琼脂
15 g
将上述物质溶解后，用 蒸馏水定容到100 mL
（ （ 1 ）此培养基能否用于植物组织培养？ ）下列材料或用具：①培养细菌用的培养基与培养皿， 4 ）转为固体培养基时，常采用 的 65 ）实验结束后，使用过的培养基应该进行 , （ ②玻棒、试管、锥形瓶和吸管，③实验操作者的双手。 2）培养基中加入尿素的目的是 处理后，才能倒掉。 其中需要灭菌的是： 筛选 ，这种培养基属于 ；需要消毒的是： 。 （3）“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中 的 和 ，实验需要振荡培养，原因是
防止温度过高，葡萄糖分解碳化 。
2、灼烧灭菌法
接种环、接种针
玻璃刮刀
3、干热灭菌法
160-170 ℃下加热1-2h。
4、G6玻璃纱漏斗过滤法
5、其他 三角瓶用封口膜、超净台操作（含紫外灯、过滤风） 在接种时要速度快
3、如何分离大肠杆菌 划线分离法 （平板划线分离法） ①培养皿倒置 ②划线的末端 出现不连续的 单菌落
划线分离法（或涂布分离法） 五 斜面接种培养
目的菌株的纯培养和菌种保存
接种环（针） 接种 菌种管 接种在 固体培养基中
三角瓶（液体培养基）
实验2：分离以尿素为氮源的微生物
1.如何设计对照？ 2.如何把液体培养基配置成固体培养基？
3.如何完成菌液稀释？ 用什么液体来稀释菌液？ 4.用什么方法来分离这种微生物？ 5.该实验简单的设计思路是什么？
培养基。
• 按照微生物对营养物质的不同需求，配制出 供其生长繁殖的营养基质。
液体培养基
凝固剂 琼脂
扩大培养，工业生产
固体培养基
分离纯化，鉴定菌种，计数，保藏
选择培养基 鉴定培养基 天然培养基 合成培养基
成分 碳源 氮源 无机盐
作用
主要作能源物质 合成含N类化合物 调节渗透压等
主要来源
无机碳(CO2) 或有机碳(糖类) N2，NH3，铵，硝酸盐 尿素，牛肉膏，蛋白胨
水
生长因子
调节促生长 维生素，Aa，碱基等
细菌中性偏碱，霉菌中性偏酸。
如鉴定分解尿素的细菌，在培养基中添加酚红， 产生红色反应。 LB液体培养基与LB固体培养基。
加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物
例1、某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而 进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、 （1）培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养 提供了 和 。除此之外， 培养基还必须含有的基本成分是 和 （2）对培养基进行灭菌，应该采用的方法是 。 （4 20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同 3）培养 ）为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了 的菌落，这说明湖水样品中有 种细菌。一般说 湖水样品的平板置于 中培养，培养的温度设定 来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越 在37℃。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另 （ 5）如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐 一平板上接种 细菌，这种培养基被称为 。