实验六：叶绿体的分离与荧光观察
叶绿体的提取与荧光观察
叶绿体的次生 荧光的来由， 橘红色为叶绿 体的荧光效果 黑色部分来自 叶绿体悬液中 混有的细胞核 碎片中的DNA 和RNA，经吖
应，故观察到 斑状分布的火 红色荧光效 果。
啶橙染色荧光 反应呈现绿 色。.
六）注意事项 1、叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠)中进行,以免渗透压的 改变使叶绿体受到损伤。 2、分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和 观察。 3、离心机使用：离心管要平衡 4、凡是荧光染料都有一定毒性，请做好防护 5、在荧光观察时应抓紧时间,有必要时立即拍照。 6、在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。 7、汞灯开启后15min内不要关闭，关闭后3min内不要开启。
叶绿体的分离与荧光观察
一）实验目的： 1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。 二）实验原理：
细胞器分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞和细胞组分的分 离。在等渗溶液中进行组织匀浆、分离，叶绿体的分离采用差速离心或 密度梯度 光（次生/诱发荧光）。离心分离技术是分离细胞组分和生物大分子最 常用的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在 不同离心力不同介质沉降分离。
三）实验用品
材料： 菠菜叶片 试剂：蒸馏水，0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(AO) 仪器：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微镜，镊子， 培养皿，纸，移液管，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管,吸 水纸等 四）实验步骤： 1、叶绿体悬浮液的制备 菠菜叶片(去叶脉)3g → 0.35mol/L氯化钠15ml→研磨→匀浆过滤(6层纱 布)→滤液在1000r/min离心2min→弃沉淀，上清液3000r/min离心5min → 去上清液→沉淀为叶绿体(混有部分细胞核)，用0.35mol/L氯化钠溶液悬 浮 →滴片观察 2、叶绿体的显微与荧光观察 取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用分别用普通光学显微镜 观察叶绿体的形态结构和荧光显微镜观察自发荧光。 将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上,再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染
叶绿体的分离与荧光观察实验报告
叶绿体的分离与荧光观察实验报告【实验目的】1.通过植物细胞叶绿体的分离,了解细胞器分离的一般原理和方法;2. 2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光,并熟悉荧光显微镜的使用方法.【实验原理】将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol／L氯化钠或0.4 mol／L蔗糖溶液)中进行．以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
将匀浆液在1000 r／min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。
然后，在3000 r／min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。
分离过程最好在0～5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。
某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。
若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光．这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。
因此在荧光观察时应抓紧时间．有必要时立即拍照。
另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。
荧光的特性：（1）吸收光必须有激发光源（2）荧光波长大于激发波长（损失热能）（3）荧光强度极小于激发光强度（4）有不同程度衰减，因此在荧光观察时应抓紧时间．有必要时立即拍照。
叶绿体的分离与荧光观察
实验二叶绿体的分离与荧光观察一、实验目的了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。
二、实验原理1、叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行,?以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
利用差速离心法将匀浆液离心，从而使叶绿体得到分离。
分离过程最好在0〜5C的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
2、有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
本实验利用荧光显微镜对叶绿体的荧光进行观察。
三、实验步骤1. 选取新鲜的嫩白菜叶片，洗净擦干后去除叶梗和粗脉，撕成小碎块，称3g放于玻璃研钵中，加入10ml0.35mol/LNaCI溶液，匀浆3〜5min。
2. 匀浆液用2层尼龙布过滤于50ml烧杯中。
3•将滤液平分到2个离心管中，天平配平，1000r/min下离心2min。
弃去沉淀。
4•将上清液在3000r/min下离心5min。
弃去上清，沉淀即为叶绿体。
5. 将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮，做两张临时装片：①取一滴叶绿体悬液滴于载片上，加盖片观察；②取一滴叶绿体悬液滴于载片上，再滴加1-2滴0.01%吖啶橙荧光染料，加盖片观察：①在普通光镜下观察；②在荧光显微镜下观察：先用明视野（白炽光灯下）和用低倍镜头观察，找到适当的标本后，再转高倍镜头，并将白炽光灯转换成以汞灯激发光作光源，用暗视野观察。
6. 撕取白菜叶片下表皮一小片置于滴有清水的载片上，盖上盖玻片，在普通光镜下观察气孔的形状，保卫细胞里面的叶绿体；随后转置荧光显微镜下观察。
四、结果与分析参考文献《细胞生物学实验》李玲李雪峰着湖南科学技术出版社百度文库《叶绿体的分离与荧光观察》。
6 叶绿体的分离与荧光观察
（二）叶绿体的观察 1、用滴管吸取少量叶绿体悬浮液于载玻片上，加盖玻片后， 吸水纸吸去玻片周围多余的溶液，分别置普通光学显微镜 和荧光显微镜下镜检观察。 2、用滴管吸取1滴叶绿体悬浮液于载玻片上，再滴加一滴0.01% 吖啶橙染液，盖好盖玻片后，吸水纸吸去玻片周围多余的溶 液，在荧光显微镜下观察.
Hale Waihona Puke 实验报告】 【实验报告】（一）叶绿体的分离 1、选用生长健壮，最好是连续几个晴天下生长的菠菜叶片 洗净后去除中脉，然后放入 0 ～ 4 ℃冰箱或冰瓶中预冷。 2、取叶片经滤纸吸干水后，称取3g剪成碎片，于45 mL 0.35mol/L氯化钠溶液中，置于研钵中，用手工快速研磨， (注意不要用力过猛，也不必研磨过细)。 3、研磨后将匀浆用6层新纱布过滤，滤液盛于烧杯中。 4、将5 mL滤液装入预冷过的离心管，经天平平衡后，以 1000 rpm ，4 ℃离心 2 min，弃去沉淀。 5、上清液再经3000 rpm ，4 ℃离心 5 min ，倾去上清液， 沉淀即为叶绿体。 6、沉淀用2 mL 0.35mol/L氯化钠溶液悬浮，放入冰箱中备用。
实验七 叶绿体的分离与荧光观察
【实验目的】 实验目的】
1、通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的原 理和方法。 2、掌握荧光显微镜的原理及使用方法。
实验原理】 【实验原理】
细胞或组织经过破碎后制成匀浆，在等渗介质中进行差速 离心，利用细胞各组分质量大小、形状和密度的不同，选择不 同的离心力和离心时间，即可分离得到所需要的细胞器或大分 子组分。分离叶绿体在等渗的缓冲溶液中进行, 最好在0 ～ 4 ℃ 温度下进行, 要迅速分离和观察。 荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测 的一种技术。荧光是某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的 照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极 短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，若停止 供能荧光现象立即停止。直接荧光: 如叶绿素的火红色荧光 间接荧光: 如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光
叶绿体的分离及荧光染色观察
叶绿体的分离及荧光染色观察泮力菁 2011级生物基地 201100140091 同组者:商倩倩【实验目的】1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离与纯化的原理和方法；2、熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光;3、复习巩固制片及染色的基本技术。
【实验原理】1、真核细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成。
细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架,这些结构被称为亚细胞组分。
分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心两种。
2、差速离心和密度梯度离心：差速离心法是在密度均一的介质中由低速到高速的逐级离心用于分离不同大小的物体。
离心速度逐渐提高，样品会按先大后小的顺序沉淀.在差速离心中细胞器沉降的顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体和过氧化物酶体、内质网和高尔基体。
最后为核糖核蛋白复合体。
由于各种细胞器在大小和密度上可能相互重叠。
一般差速离心2—3次，分离效果会好一些。
差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞或细胞器，并且得到的产物纯度较低。
若对产物纯度的要求较高,则需要密度梯度离心来分离纯化。
密度梯度离心法是利用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中。
这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种.速度沉降主要用于分离密度相近而大小不同的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体.叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器。
它是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集,然后用密度梯度离心纯化,便可用于各种研究.3、荧光：光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态进入基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称之为“光致发光”。
紫外辐射,可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光.荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并立即激发在极短的时间内能发射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光.一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失.荧光的性质：A、吸收光，必须有激发光源；B、荧光波长大于激发波长（损失热能）；C、荧光强度小于激发光的强度；D、有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光。
叶绿体的分离、纯化及荧光观察实验报告
叶绿体的分离、纯化及荧光观察实验报告叶绿体的分离、纯化及荧光观察实验⽬的：1、通过植物细胞叶绿体的分离与纯化，了解细胞器分离与纯化的原理和⽅法2、熟悉荧光显微镜的使⽤⽅法，观察叶绿体的⾃发荧光和间接荧光实验原理：差速离⼼法⽤于分离⼤⼩不同的物体。
在差速离⼼中细胞器沉降的顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质⽹与⾼尔基体、醉后为核糖核蛋⽩复合体。
密度梯度离⼼法是⽤⼀定的介质在离⼼管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离⼼⼒的作⽤使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与⾃⾝密度相同的沉降区带中。
叶绿体是⼀种⽐较⼤的细胞器，利⽤差速离⼼即可分离收集，然后⽤密度梯度离⼼纯化，便可⽤于各种研究。
实验⽤品：新鲜菠菜、提取缓冲液、蔗糖溶液、0.01%吖啶橙、离⼼机、电⼦天平、荧光显微镜、剪⼑、研钵、移液管、漏⽃、滴管、10ml离⼼管实验步骤：1、选取新鲜嫩绿菠菜叶，去叶梗及粗脉，洗净擦⼲，称30克放于150ml 0.35M.Nacl溶液中2、将液、叶同装⼊组织捣碎机中，匀浆3-5分钟，转速5000r/min3、将匀浆⽤纱布（6层）过滤于500ml烧杯中4、取滤液4ml在1000r/min下离⼼2min5、取上层清液在3000r/min下离⼼5min（沉淀为叶绿体和细胞核混合物）6、将沉淀⽤2-3mlMnacl液悬浮7、取⼀滴悬液滴⽚，加盖玻⽚后显微镜下观察8、另取⼀滴悬液滴⽚，再滴加⼀滴0.01%吖啶橙染料，混匀，盖上盖玻⽚，在荧光显微镜下观察实验结果：普通显微镜下，叶绿体呈橄榄形，绿⾊，⾼倍镜下可看到基粒（深绿⾊⼩颗粒）。
荧光显微镜下，叶绿体⾃发荧光为“⽕红⾊”，次⽣荧光为“橘红⾊”分析与讨论：1、捣碎叶⽚式时时间不宜过长，否则会破坏叶绿体2、⽤荧光显微镜找到物象后，要先拍照后观察，因为荧光会逐渐变弱。
叶绿体的分离纯化及荧光观察
叶绿体的分离纯化及荧光观察叶绿体是植物细胞中的一种细胞器，它是进行光合作用的主要场所。
叶绿体具有一定的自复制能力，可以独立分离出来，纯化叶绿体样品可以方便地进行进一步的实验研究。
本文将详细介绍叶绿体的分离、纯化以及荧光观察的方法。
一、叶绿体的分离1.实验材料准备为了分离叶绿体，我们需要充足的植物组织样品。
可以选择新鲜的叶片或者细胞培养物作为实验材料。
同时，需要准备好一系列试剂，例如缓冲液、葡萄糖、EDTA、PEG等。
2.组织破碎和提取液的准备首先，将植物组织样品冷冻在液态氮中，然后用超声波处理器将样品破碎。
接下来，将破碎的样品用缓冲液溶解，加入适量的葡萄糖和EDTA。
将溶解后的样品在低温条件下离心，然后取出上清液。
3.叶绿体的沉淀将提取液中的上清液用PEG逐渐沉淀叶绿体。
首先加入PEG溶液，并轻轻搅拌。
然后，将样品在低温条件下离心，离心后会出现一个绿色的沉淀。
这个沉淀就是叶绿体。
4.叶绿体的洗涤和纯化将叶绿体的沉淀用缓冲液洗涤数次，然后用离心将叶绿体沉淀下来。
最后，将沉淀的叶绿体用缓冲液悬浮，即可得到纯化的叶绿体样品。
二、叶绿体的荧光观察1.荧光探针的准备为了观察叶绿体的荧光，我们需要准备好合适的荧光探针。
通常使用的探针有二苯基苯酚（DPBF）和二聚(4-乙基-5-（4-甲基吡啶氧基）-2-溴脱氧葡萄糖（DAB）等。
2.荧光探针的添加将纯化的叶绿体置于含有荧光探针的溶液中，静置一段时间。
荧光探针会与叶绿体中的一些分子发生作用，从而产生荧光。
3.荧光观察使用荧光显微镜观察叶绿体的荧光。
将样品放置于荧光显微镜下，设置合适的激发波长和观察波长。
然后观察荧光显微镜中的图像，即可看到叶绿体的荧光。
4.结果分析通过观察叶绿体的荧光，可以得到关于叶绿体活性和光合作用效率的信息。
例如，如果观察到荧光强度较高，可以推测叶绿体的光合作用效率较低。
总结：叶绿体的分离、纯化及荧光观察是研究植物生物学和光合作用的重要方法之一、通过正确的操作流程和合适的实验材料，可以得到纯化的叶绿体样品，并通过荧光观察了解叶绿体的活性和光合作用效率。
叶绿体的分离与荧光观察实验报告
叶绿体的分离与荧光观察实验报告好嘞，今天咱们聊聊叶绿体的分离与荧光观察实验，这可是个既有趣又有点神秘的过程哦。
叶绿体是植物细胞里一个特别重要的小家伙，简直就是植物的太阳能工厂。
它们把阳光转化为化学能，简直像是大自然的魔法师。
今天的实验就围绕着这些小精灵来展开，让我们一起揭开它们的神秘面纱。
咱们得准备好一些材料。
可以用菠菜叶，没错，就是那种绿色的、看起来特别健康的叶子。
选几片新鲜的，感觉就像是在挑选食材一样。
咱们要把这些菠菜叶用刀剪成小块，动作要轻柔点，别把自己给划了，嘿嘿。
剪好之后，准备一个清水盆，把这些小叶子泡进去，让它们稍微放松放松，感受一下水的滋润。
水是生命之源，没错！然后，咱们得准备一台榨汁机，嗯，没错，就是那种能把东西变成液体的机器。
把泡过水的菠菜叶放进榨汁机，倒点水，加点冰块，嘿，榨汁的时候声音可真像在开派对！随着咕噜咕噜的声音，菠菜叶就变成了一杯绿色的汁液，看看这颜色，真是好看得不得了。
这可不是普通的绿色，里面有丰富的叶绿素，嗯，想想都让人开心。
咱们要把这杯绿色汁液过滤一下，把渣滓都捞出来。
用个细网筛或者纱布都行，慢慢来，别心急，毕竟好东西要慢慢来嘛。
过滤完之后，剩下的就是一杯清澈的绿色液体，咳咳，真想来一口，当然不能喝，实验可不能马虎。
现在到了最激动人心的时刻了！准备好荧光显微镜，哇，听上去就让人心跳加速。
把过滤后的液体滴到显微镜的载玻片上，咱们得轻轻地盖上盖玻片，像是在给小家伙们盖被子一样。
然后，把它放在显微镜下，慢慢转动镜头，哇，果然不负所望！当你看到那些小小的叶绿体在光下闪闪发光，简直就像星星在夜空中一闪而过，太美了，心里那个美呀，简直不敢相信自己的眼睛。
荧光显微镜真是个神奇的玩意儿，能让咱们看到那些肉眼看不见的东西，真是太酷了。
叶绿体在荧光下，仿佛是穿上了闪亮的衣服，优雅地在液体中游动，感觉它们都在跟你打招呼呢。
想想看，平时它们在叶子里默默工作，这次终于被我们发现了，心里别提多得意了。
叶绿体分离和荧光观察
叶绿体的分离及荧光观察XXX,YYY,ZZZ一、实验目的：1通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法2观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法二、实验原理：将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
一个颗粒在离心场中的沉降速度取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
以此增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体分离应在等渗溶液中进行，以免渗透压改变使叶绿体损伤。
将匀浆在1000r/min 的条件下离心2分钟，以除去其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。
然后，在3000r/min 的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体。
分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。
因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照，；另外，在制作荧光显微镜标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和无荧光油。
三、实验用品：1、材料：新鲜菠菜2、试剂：0.35mol/L氯化钠溶液、0.01％吖啶橙。
3、器材：离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜、盖玻片、载玻片、烧杯等四、实验步骤：1、叶绿体的分离与观察：（1）取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗，称30g于150mL0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。
（2）利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆3~5分钟。
（3）将匀浆用六层纱布过滤于500mL烧杯中。
（4）取滤液4ml在1000r/min下离心2分钟。
弃去沉淀。
（5）将上清液在3000r/min下离心5min。
弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。
（6）将沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。
细胞生物学实验课件-叶绿体的分离与荧光观察
【實驗目的】
1、通過植物細胞葉綠體的分離, 瞭解細胞器分離的原 理和方法。
2、掌握螢光顯微鏡的原理及使用方法。
【實驗原理】
細胞或組織經過破碎後製成勻漿，在等滲介質中進行差速 離心，利用細胞各組分品質大小、形狀和密度的不同，選擇不 同的離心力和離心時間，即可分離得到所需要的細胞器或大分 子組分。分離葉綠體在等滲的緩衝溶液中進行, 最好在0 ～ 4 ℃ 溫度下進行, 要迅速分離和觀察。
【實驗用品】
1、 器材 ：普通離心機、組織搗碎機、粗天平、螢光顯微鏡。
研缽、燒杯, 10ml刻度離心管 ，滴管，紗布，載片 和蓋玻片等。
2、 材料： 新鮮菠菜。
3、 試劑： 0.35mol/L氯化鈉溶液，
0.01%吖啶橙(acridine orange)。
【實驗方法】
（一）葉綠體的分離 1、選用生長健壯，最好是連續幾個晴天下生長的菠菜葉片 洗淨後去除中脈，然後放入 0 ～ 4 ℃冰箱或冰瓶中預冷。
2、用滴管吸取1滴葉綠體懸浮液於載玻片上，再滴加一滴0.01% 吖啶橙染液，蓋好蓋玻片後，吸水紙吸去玻片周圍多餘的溶 液，在螢光顯微鏡下觀察.
【實驗報告】
1、繪製普通光學顯微鏡下觀察的葉綠體的形態示意圖。 2、記錄螢光顯微鏡觀察的現象，分析結果。
【思考題】
1、分離葉綠體操作過程中應注意什麼？ 2、普通光學顯微鏡和螢光顯微鏡的原理及結構有何異同點？
2、取葉片經濾紙吸幹水後，稱取3g剪成碎片，於45 mL 0.35mol/L氯化鈉溶液中，置於研缽中，用手工快速研磨， (注意不要用力ห้องสมุดไป่ตู้猛，也不必研磨過細)。
3、研磨後將勻漿用6層新紗布過濾，濾液盛於燒杯中。
4、將5 mL濾液裝入預冷過的離心管，經天平平衡後，以 1000 rpm ，4 ℃離心 2 min，棄去沉澱。
叶绿体分离与荧光染色观察
组织碎片
叶绿体经激发光波照射后，自 叶绿体次生荧光的来由, 结 普通光学显微镜下观察到 发荧光呈现火红色，因叶绿体 橘红色为叶绿体的荧光
果 叶绿体的正常结构。离心 在其悬液中呈现点状均匀分 效果，叶绿体的悬液中混
分 不纯导致混有其他组织碎 布，且悬液其他组分无自发荧 有的细胞核碎片中的核
析片
光反应,故观察到斑状分布的 酸经丫啶橙染色荧光反
火红色荧光效果
应呈现绿色
六．思考与讨论
1.注意事项 (１）要得到完整的、有活性的叶绿体,须在低温下迅速提取,涂片后立即观察,注意离心时的
时间及强度。
(２）利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察室，会收到许多因素的影响,如温度、光、 淬灭剂等。因此在进行荧光观察时应抓紧时间,必要时应立即拍照。
(３）在制作荧光显微标本时最好使用物荧光载玻片、无荧光盖玻片香柏油。 2．思考题 （１)在荧光显微镜下观察叶绿体的自发荧光时，更换滤片系统，叶绿体的颜色是否有变化? 有变化。因为叶绿体的颜色取决于发出荧光能量的高低，更换不同的滤片,激发光会不同， 叶绿体得到和辐射的能量就会不同，颜色也就会不一样 （２)游离的叶绿体和完整细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，颜色和荧光强度有无区别， 为什么? 有区别。因为完整细胞内的叶绿体还要进行光合作用，这会消耗掉一部分所吸收的光,所以 最后释放的荧光能量就会比游离核糖体所释放的小,颜色和荧光强度就会有差别。 (3）根据观察到的实验现象，简述自发荧光和次生荧光的区别？ 自发荧光指不需染色，只需在激发光照射下即可发荧光的现象，而次生荧光需要染色。因为 发光机制不同，所用的滤光片也会不同，最后发出的荧光颜色也会不同。 （4)叶绿体分离的原理是什么?操作过程应注意什么？ 采用的方法是差速离心法，利用不同颗粒大小、形状不同导致沉降速率不同,把叶绿体大小 的颗粒沉降出来。 叶绿体的分离应在等渗溶液（０．３5mol/L 氯化钠或０.4mol/Ｌ 蔗糖溶液）中进行，以免 渗透压的改变使叶绿体受到损伤;分离过程最好在０～4℃的条件下进行;如果在室温下，要 迅速分离和观察。 3.实验小结
实验六 菠菜叶绿体分离与荧光观察 (1)
菠菜叶片叶绿体分离与荧光观察
实验目的
1、了解细胞器分离的一般原理，
掌握基本分离方法。 2、观察叶绿体自发荧光与间接荧
光
实验原理
细胞器的分离：
先匀浆→差速离心。
将组织匀浆后在等渗介质中差速离心， 是分离细胞器的常用方法。
实验原理
用低渗、超声破碎或研磨等匀浆方法可使细胞质 膜破损，形成细胞核、线粒体、叶绿体、内质 网、高尔基体、溶酶体等细胞器和细胞组分组 成的混合匀浆，再通过差速离心，可将各种亚 细胞组分和各种颗粒分开。
实验原理
差速离心：即利用不同的离心速度所产生的不同离心力， 分离各种亚细胞组分和各种颗粒。 在一定的离心场中，同一时间内，密度、大小不同的颗粒 其沉降速度不同，依次增加离心力和离心时间，密度及大 小不同的颗粒会先后分批沉降在离心管底部，分批收集即 可获得各种亚细胞组分。 颗粒在离心场中，其沉降速度取决于其大小、形状和密度，
注意事项：
实验步骤
二、叶绿体的间接荧光观察
取叶绿体悬液１滴于载玻片上， 滴加1滴0.01%吖啶橙，染色10min， 加盖片，荧光显微镜观察叶绿体 的间接荧光。 注意事项：
思考题
P110 第3题：
叶绿体分离实验的原理是什么？ 在分离叶绿体时应注意什么问题？ຫໍສະໝຸດ 也与离心力及介质黏度有关。
Differential centrifugation 沉降顺序：核——线粒体——溶酶 体与过氧化物酶体——内质网与高 尔基体——核蛋白体。
High speed
Low speed
实验原理
自发荧光：细胞内含有的某些天然物质，
经短波光照射后所发出的光。
诱发荧光：物体经荧光染料染色后，再 经短波光照射所发出的荧光。
叶绿体的分离与荧光观察
叶绿体的分离及荧光观察【实验目的】1.学习使用差速离心法获取叶绿体2.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
3.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
【实验原理】1.高等植物中叶绿体象双凸或平凸透镜，长径5—10um，短径2-4um，厚2-3um。
高等植物的叶肉细胞一般含50-200个叶绿体，可占细胞质的40%。
、叶绿体的数目因物种细胞类型，生态坏境，生理状态而有所不同。
在藻类中叶绿体形状多样，有网状，带状，裂片状和星形等等，而且体积巨大，可达100um.叶绿体由叶绿体外被，类囊体和基质3部分组成。
叶绿体含有3种不同的膜：外膜，内膜，类囊体膜和三种彼此分开的腔：膜间隙，基质和类囊体腔。
2.匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒。
收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。
差速离心法：颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部．分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
分离过程最好在0—5℃的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。
3.差速离心法特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心用途：分离大小相差悬殊的细胞核细胞器沉降顺序：核——叶绿体，线粒体——溶酶体与过氧化物体——内质网与高尔基体——核蛋白体可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。
【实验材料】1. 试剂：0.35mol/L氯化钠溶液，0.01％吖啶橙。
2. 器具：粗天平、组织捣碎机、普通离心机、普通光学显微镜、荧光显微镜、500ml 烧杯、量筒、滴管、10ml刻度离心管、纱布若干，试管架、无荧光载玻片和盖玻片。
叶绿体的分离及荧光观察
吖啶橙(acridine orange，AO )
Molecular Formula:
C17H20ClN3
Molecular Weight:
301.82
➢ 吖啶橙是一种芳香杂环阳离子染料可
透过细胞膜，不同浓度与pH的吖啶橙溶液所 呈现的荧光颜色不同，这与其结构不同有关。 吖啶橙与物质的结合一般有两种方式，潜入 到物质结构中或由静电吸引堆积在物质表 面，如DNA和RNA都能与吖啶橙结合的，在紫 外光或蓝光(330～485nm)激发下，DNA可被激 发出530nm的荧光发射峰，RNA可被激发出
什么是 荧光 ?
物质中的电子吸收光的能量 由低能状态转变为高能状态，再 回到低能状态（基态）时释放出 的光。
四、荧光的性质
➢保持固有的荧光特性 ➢荧光波长＞激发波长 ➢荧光强度极小于激发光的强度 ➢有不同程度的衰减 ➢荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、
荧光效率
五、荧光显微术应用
• 用于观察能激发出荧光的结构。免疫荧光 观察、基因定位、疾病诊断等。
方 技术 法
原理
效 成本 举例 果
机 匀浆法 械 研磨法
细胞被搅拌器劈碎或 受剪切力而破碎
细胞被研磨物磨碎
适中 适中
适中 便宜
动植物组织或细胞 植物组织
法 超声波法
用超声波的空穴作用 剧烈 昂贵 使细胞破碎
珠磨破碎法 细胞被玻璃珠或铁珠 剧烈 便宜 捣碎
化 渗透冲击 学 酶消化法
渗透压破坏细胞
细胞壁或细胞膜被消 化，使细胞破碎
为了便于进行转速和相对离心力之间的 换算，人们在此公式的基础上制作了离 心力的列线图。见图2. 先在离心机半径 标尺上取已知的离心半径和在转速标尺 上取已知的转速，然后在这两点间取一 条直线，与中间RCF标尺上的交叉点，
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【实验报告】
1．绘图：菠菜叶肉细胞的形态，示叶绿 体。
2．观察经过加热和未加热这两种叶绿体 在形态上的区别，并绘出草图。
3简述：叶绿体的分离原理和方法；
布；
Differential centrifugation
High speed
Low speed
三、实验用品
1. 器材 离心机、研钵或组织捣碎机、显微镜、天
平、离心管、纱布、烧杯、量筒、滴管、 载玻片、盖玻片。 2. 材料
– 新鲜菠菜叶。
3. 试剂
– 0.35mol/L氯化钠溶液 。
四、实验方法
3．观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，了解 荧光显微镜的原理和使用方法
4 ．了解菠菜叶绿体的形态、分布与数量。
二 实验原理
采用差速离心分离细胞器；
– 沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内 质网与高基体——核蛋白体；
叶绿体具有荧光现象，可利用荧光显微镜观察。 菠菜叶富含叶绿体，可采用徒手切片观察 其形态和分
实验五：叶绿体的分离与荧光观察
【课前预习】 1．分离细胞器的一般原理和方法？ 2．叶绿体的荧光为什么不能用普通光学显微镜
观察到？
一、实验目的
１ 通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器 分离的一般原理与方法；了解差速离心 Differential centrifugation特点与用途
2．通过光镜鉴定叶绿体的纯度及了解叶绿体 形状
在表皮细胞和保卫细胞中的分布；荧光显微镜下演示。
【实验结果】
差速离心获得并பைடு நூலகம்化的叶绿体镜检为绿色橄榄 形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的 绿色小颗粒，即基粒。菠菜叶片徒手切片可以 观察到三种细胞分别是边缘呈锯齿形的鳞片状 的表皮细胞，构成气孔的成对的肾形保卫细胞， 排列成珊栏状的长形和椭圆形叶肉细胞。