第三章 基因克隆的酶学基础-1_PPT幻灯片
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基因的克隆方法ppt课件
1）直接从基因组中扩增过程： （1）提取基因组DNA作模板 （2）根据目的基因序列设计引物 （3）PCR扩增及产物鉴定
31
提取基因组DNA
PCR引物设计
PCR扩增
基因序列分析
此法适合扩增原 核生物基因。
真核生物基因组含有内含子32 ！
2）从mRNA中扩增: RT-PCR
（1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增及序列分析
工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一
段序列，提供的信息较少。
19
优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA的组成。
所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进加标签的基因克隆 方法野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析，24 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因子，实 际上也是DNA片段，它可以在生物的染色 体组中移动，从染色体的一个位点跳到另 一个位点，或从一条染色体跳到另一条染 色体上，引起基因功能的改变。
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
15
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
AATTTTTTTT ACTTTTTTTT AGTTTTTTTT TATTTTTTTT
TCTTTTTTTT TGTTTTTTTT CATTTTTTTT CCTTTTTTTT CGTTTTTTTT GATTTTTTTT
31
提取基因组DNA
PCR引物设计
PCR扩增
基因序列分析
此法适合扩增原 核生物基因。
真核生物基因组含有内含子32 ！
2）从mRNA中扩增: RT-PCR
（1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增及序列分析
工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一
段序列，提供的信息较少。
19
优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA的组成。
所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进加标签的基因克隆 方法野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析，24 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因子，实 际上也是DNA片段，它可以在生物的染色 体组中移动，从染色体的一个位点跳到另 一个位点，或从一条染色体跳到另一条染 色体上，引起基因功能的改变。
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
15
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
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G
3`
AATTTTTTTT ACTTTTTTTT AGTTTTTTTT TATTTTTTTT
TCTTTTTTTT TGTTTTTTTT CATTTTTTTT CCTTTTTTTT CGTTTTTTTT GATTTTTTTT
3-基因工程的酶学基础
如 EcoR I限制性内切酶和EcoR I甲基化酶
前者：5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
后者：5’-GAA*TTC-3’ 3’-CTT*AAG-5
作用的位点也不相同
36
（4） II型限制性内切酶对单链DNA的切割
定义为切割双链DNA，但有一些还可以特 异识别并切割单链DNA的相应位点，只是 切割效率比较低
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
30
Sau 3A
5’-GATC----3’ 3’----CTAG-5’
同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点 一般不能再被原来的酶识别。
BamH I 5’-G 3’-CCTAG
GATCT-3’ A-5’
Bgl Ⅱ
BamH I
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’
产生平齐末端
产生粘性末端
19
[1] 粘性末端（sticky ends，cohensive ends）
含有几个核苷酸单链的末端。 分两种类型：
ⅰ） 5’端凸出（如EcoR I切点）
5’-
GAATTC
-3’
3’-
CTTAAG
-5’
5’-
G
AATTC
3’-
CTTAA
G
-3’ -5’
20
ⅱ） 3’端凸出（如Pst I切点）
识别位点处
切开双链DNA，形成粘性末端（sticky end）或 平齐末端（blunt end）。如：
EcoR I 5’-GAATTC-3’ EcoR V
3’-CTTAAG-5’
5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’
Pst I
5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’
前者：5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
后者：5’-GAA*TTC-3’ 3’-CTT*AAG-5
作用的位点也不相同
36
（4） II型限制性内切酶对单链DNA的切割
定义为切割双链DNA，但有一些还可以特 异识别并切割单链DNA的相应位点，只是 切割效率比较低
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
30
Sau 3A
5’-GATC----3’ 3’----CTAG-5’
同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点 一般不能再被原来的酶识别。
BamH I 5’-G 3’-CCTAG
GATCT-3’ A-5’
Bgl Ⅱ
BamH I
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’
产生平齐末端
产生粘性末端
19
[1] 粘性末端（sticky ends，cohensive ends）
含有几个核苷酸单链的末端。 分两种类型：
ⅰ） 5’端凸出（如EcoR I切点）
5’-
GAATTC
-3’
3’-
CTTAAG
-5’
5’-
G
AATTC
3’-
CTTAA
G
-3’ -5’
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ⅱ） 3’端凸出（如Pst I切点）
识别位点处
切开双链DNA，形成粘性末端（sticky end）或 平齐末端（blunt end）。如：
EcoR I 5’-GAATTC-3’ EcoR V
3’-CTTAAG-5’
5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’
Pst I
5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’
基因克隆的酶学基础
医学课件ppt
9
医学课件ppt
数字表示在 不同寄主中 生长的噬菌 体的成斑率， 表示限制程 度。
10
二．限制和修饰作用的分子机制
1．大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株 ，有各自的限制和修 饰系统。
1） 它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR; hsdM; hsdS.
2） hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定 位点，将双链DNA切断。（DNA分子转化细胞：受 体细胞去掉hsdR基因位点）
医学课件ppt
21
② 对称性 ③ 限制酶切后产生两个末端，末端结
构是5’-P和3’-OH
EcoRI 5’-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’
医学课件ppt
22
（3）末端种类
① 3’-端突起，个数为2或4个核苷酸
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA
医学课件ppt
15
（3）Ⅲ型酶
这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一 顺序的3’端24~26bp处切开DNA，所以它 的切割位点也是没有特异性的。
医学课件ppt
16
二、限制性内切酶的特点 1、定义、命名
（1）定义
广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制酶。
（2）命名
限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae， “d”表示菌系为d型血清型（菌株号）；“Ⅲ”表示分离 到的第三个限制酶。
EcoRI—Escherichia coli RI
医学课件ppt
17
2、限制酶的特点
（1）基本特点 在DNA双链的特异性识别序列部位，切割
基因工程原理第3章基因克隆载体[可修改版ppt]
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ccc-DNA l-DNA oc-DNA
2. 质粒DNA分子大小
3. 质粒的复制
——严紧型质粒：1个寄主内仅含1-3拷贝 ——松弛型质粒：1个寄主内含10-60拷贝
• 质粒DNA复制：单向复制，受宿主细胞和质粒遗传系统 双重控制，不会无限制复制。
Ori
•质粒控制： 序列
拷贝数：细胞内某种质粒的数量与染色体的数量之比。
的成熟有关（占20%）
4.λ噬菌体DNA的包装限制问题
包装能力： λDNA×75%——λDNA ×105%， 即从36kb——51kb
• 野生型λDNA的必要区是28kb，所以能加入的外源DNA长度最大为 51kb-28kb=23kb。实际为15kb。
• 若λ基因组缺失大于25%时，也不能有效包装。
5.ion）：寄主细胞捕获噬菌体DNA 的过程。或 重组噬菌体DNA分子感染并进入大肠杆菌的过程。
• 转导作用（transduction）：以噬菌体颗粒为媒介转移遗传物质的 过程。
• 转化作用（transformation）：将质粒等外源DNA引入细胞的过 程。
2. 就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：（复制 区： 含有复制起点）；（选择标记： 主要是抗性基因）；（克隆位点： 便于外 源DNA的插入）。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。
3. 载体的功能是（ d ）
（a）外源基因进入受体的搭载工具
（b）不能为外源基因提供整合能力
cos位点：cohesive-end site 粘性末端位点
线性双链DNA分子两端各有1条由12个核苷酸组成的完全互补的5'单链突出序列，即粘性末端。 注入到寄主细胞内的线性DNA分子会迅速的通过粘性末端之间的互补作用，形成环状双链DNA分 子。然后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5'—P和3'—OH基团封闭起来，进一步超盘旋化，这种 由粘性末端结合形成的双链DNA区域称为cos位点。
《分子克隆中所用酶》PPT课件
识别序列在DNA分子中出现的频率 :
如果四种碱基按完全随机分布的原则，则某种限制性内切
III型：有专一的识别顺序。它在识别顺序下游约25bp处 几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则
是任意的。
II型：识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内或附近的固 定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的
核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA 片段，并能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合 DNA分子。
精品医学
2
工具酶
常用的工具酶：
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
DNA聚合酶Ⅰ 反转录酶
切割DNA 生成3′- 5′磷酸二酯键 探针标记、补平3′末端
cDNA合成
多聚核苷酸激酶 末端转移酶
5′磷酸化、探针标记 3′末端多聚尾
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
精品医学
3
一把特殊的剪刀 _______限制性内切酶
精品医学
15
E coR I的识别顺序为：
5’……GAA | TTC……3’ 3’……CTT | AAG……5’
垂直虚线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC 或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。
精品医学
16
recognition sequence
5＇ GTT AAC 3＇ 3＇ CAA↓TTG 5＇
5＇ G↓AATTC 3＇ 3＇ CTTAA↑G 5＇
5＇ A↓AGCTT 3＇ 3＇ TTCGA↑A 5＇
5＇ G↓GATCC 3＇ 3＇ CCTAG↑G 5＇
5＇ C↓TGCAG 3＇ 3＇ GACGT↑C 5＇
enzymes Hpa Ⅰ blunt end EcoRⅠ 5’protruding end HindⅢ 5’protruding end BamHⅠ 5’protruding end PstⅠ 3’protruding end
基因的克隆PPT课件
载体的种类
质粒
1.大肠杆菌质粒 2.革兰氏阳性菌的质粒
噬菌体 真核细胞为宿主的克隆载体
1.酵母为宿主的载体 2.植物细胞为宿主的载体 3.DNA病毒载体
反转录病毒载体
大肠杆菌的质粒
pBR322质粒：它是由4361个核苷酸组成，属于松弛型质粒， 可以用抗氨苄西林和抗四环素基因作为标记，具有多种常用 内切酶的切点。
基因表达产物的鉴定
基因表达：指某基因在细胞中转录为mRNA继而翻译 成蛋白质的过程。
DNA
RNA
Protein
转录
翻译
研究基因表达的手段
1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA) 3、Western blot (蛋白质） 4、免疫组化 （蛋白质）
1、RT-PCR
基因的克隆 -----ＤＮＡ重组技术。
克隆：是用无性繁殖的方法产生一组遗传上相同的细 胞或生物群体的过程，而这些细胞或个体均来自无性 繁殖的单一原型细胞。
基因的克隆:用ＤＮＡ重组技术使一个基因或ＤＮＡ片 段产生出很多相同拷贝的过程。
基因克隆的技术路线的大体步骤
得出结论
步骤三： 步骤二： 步骤一：
多 克 隆 位 点
X-gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷
表示 外源 基因 插入 编码 半乳 糖苷 酶的 基因 区段
带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落
不对 能照 是目 培的 养基 基因 变本 色身
使用含Amp+X-Gal的琼脂糖平板筛选克隆，可能出现三种情况。 1 . 载体自身环化，产生蓝色菌落； 2 带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落。 3 未转化的细胞，不能生长。
目的基因插入 到抗四环素基 因的位置，则 导入菌体后的 菌株则不能在 有四环素的培 养基上生长
基因克隆简介ppt课件
3
➢ 1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因 的DNA片段。
➢ 2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自
我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重 组DNA分子。
➢ 3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称 寄主细胞）并与之一起增殖。
➢ 4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组 DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的 目的基因。
IPTG
Isopropyl-beta-Dthiogalactoside
编辑版pppt
异丙基 硫代 -β-D-半乳糖 苷
34
③ Xgal
（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside）
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖糖苷
编辑版pppt
35
b-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解 成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛 蓝。
➢ 5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，
使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人
类所需要的物质。
编辑版pppt
4
编辑版pppt
5
二. 用于基因克隆的工具酶
编辑版pppt
6
1. DNA限制性内切酶
1.1、限制酶概念提出的背景
20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体 不能交叉感染，如E coli K株的噬菌体只能感染E coli K株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“ 限制现象”。
44
编辑版影印到滤膜上，或将菌 种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落，对滤膜 上的菌体进行原位裂解使 DNA 释放出来，并使之 固定在滤膜上并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交 作用。
3、基因克隆的酶学基础-01
基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）以及小牛血清（BSA） 等。
7、完全酶切和部分酶切
3.2 DNA连接酶与DNA 分子的体外连接 3.2.1 DNA连接酶：大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶
动物细胞和噬菌体
缺口（nick)
裂口（gap)
大肠杆菌及其它细菌
3.2.2 粘性末端的连接
用碱性磷酸 酶的脱磷酸 作用阻止线
S1 核酸酶在分子生物学研究中的主要用途是给RNA定位。
3.6.2 Bal 31 核酸酶与限制位点的确定 具有单链特异的核酸内切酶活性和双链特异的核酸外切酶活性。
应用Bal 31 核酸酶诱发 DNA分子的缺失突变
（a）质粒DNA分子，A区段是准 备诱发缺失突变的序列
（b）用Bal 31核酸酶不同时间长 度分别消化线性DNA分子 S1 核酸酶与RNA分子定位 反应条件：低水平Zn2+、最适pH值：4.0~4.3、NaCI浓度：
100mmol/L
S1 核酸酶的主要功能： ① 催化RNA和单链DNA分子降解成5′单核苷酸； ② 作用于双链核酸分子的单链区，并从此处切断核酸分子 （单链区可小到一个碱基对）。
T4 多核苷酸激酶的交换活性
3.4.2 碱性磷酸酶（BAP、CIP)与 DNA脱磷酸作用
3.5 DNA 外切酶
核酸外切酶（exonucleases）：是一类从多核苷酸链的一 头开始按序催化降解核苷酸的酶。按作用特性的差异可分为 单链核酸外切酶（如exo I、 exo VII等 ）和双链核酸外切酶 （如exo III、λ exo等）。
（c）将带有另一种限制性内切酶 识别序列的衔接物连接到这些缺 失分子上并将它们环化起来
（d）新形成的环状质粒分子具有 新的限制性内切酶（Hind III）的 切点，其A区段有缺失
7、完全酶切和部分酶切
3.2 DNA连接酶与DNA 分子的体外连接 3.2.1 DNA连接酶：大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶
动物细胞和噬菌体
缺口（nick)
裂口（gap)
大肠杆菌及其它细菌
3.2.2 粘性末端的连接
用碱性磷酸 酶的脱磷酸 作用阻止线
S1 核酸酶在分子生物学研究中的主要用途是给RNA定位。
3.6.2 Bal 31 核酸酶与限制位点的确定 具有单链特异的核酸内切酶活性和双链特异的核酸外切酶活性。
应用Bal 31 核酸酶诱发 DNA分子的缺失突变
（a）质粒DNA分子，A区段是准 备诱发缺失突变的序列
（b）用Bal 31核酸酶不同时间长 度分别消化线性DNA分子 S1 核酸酶与RNA分子定位 反应条件：低水平Zn2+、最适pH值：4.0~4.3、NaCI浓度：
100mmol/L
S1 核酸酶的主要功能： ① 催化RNA和单链DNA分子降解成5′单核苷酸； ② 作用于双链核酸分子的单链区，并从此处切断核酸分子 （单链区可小到一个碱基对）。
T4 多核苷酸激酶的交换活性
3.4.2 碱性磷酸酶（BAP、CIP)与 DNA脱磷酸作用
3.5 DNA 外切酶
核酸外切酶（exonucleases）：是一类从多核苷酸链的一 头开始按序催化降解核苷酸的酶。按作用特性的差异可分为 单链核酸外切酶（如exo I、 exo VII等 ）和双链核酸外切酶 （如exo III、λ exo等）。
（c）将带有另一种限制性内切酶 识别序列的衔接物连接到这些缺 失分子上并将它们环化起来
（d）新形成的环状质粒分子具有 新的限制性内切酶（Hind III）的 切点，其A区段有缺失
第3章-基因工程的酶学基础(植物基因工程)幻灯片(1)
苷蛋氨酸）。
EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG
在基因工程操作中用途不大。
核酸限制性内切酶的类型及主要特性
特性
限制和修 饰活性
内切酶的 蛋白结构
限制作用 所需要的 辅助因子
寄主特异 性位点识 别序列
I类内切酶 单亚基多功能酶
3种不同的亚基
ATP、 Mg2+和 SAM
II类内切酶 内切酶和甲 基化酶分开 单一成分
DNA易位作用 能
不能
甲基化作用的位 寄主特异性位 寄主特异
点
点
性位点
识别未甲基化的 能
能
序列进行切割
序列特异的切割 不是
是
基因工程中的用 无用 途
十分有用
距寄主特异 性位点3‘端 24—26bp 处
不能 寄主特异性 位点 能
是 无用
三、限制性内切酶的命名
Escherichia coli
菌株 类型 EcoR I
dam甲基化酶（修饰GATC中的A） dcm甲基化酶（修饰CCAGG/CCTGG的C）
基因工程中必须使用甲 基化酶失活突变的菌株。
3. 温度
不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。 大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。
酶
最适温 酶
度oC
最适温 酶 度oC
最适温 度oC
Apa I 30
Bcl I
-OH HO-P-
AMP
AMP -OH O-P-
3.2. 3‘-OH对磷原子作亲核攻击，形 成磷酸二脂键，释放出AMP。
四、连接反应的温度
1. 最佳温度 连接酶反应的最佳温度是37C。
2. 实用温度 但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。 所以一般采用 4~16 C。
EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG
在基因工程操作中用途不大。
核酸限制性内切酶的类型及主要特性
特性
限制和修 饰活性
内切酶的 蛋白结构
限制作用 所需要的 辅助因子
寄主特异 性位点识 别序列
I类内切酶 单亚基多功能酶
3种不同的亚基
ATP、 Mg2+和 SAM
II类内切酶 内切酶和甲 基化酶分开 单一成分
DNA易位作用 能
不能
甲基化作用的位 寄主特异性位 寄主特异
点
点
性位点
识别未甲基化的 能
能
序列进行切割
序列特异的切割 不是
是
基因工程中的用 无用 途
十分有用
距寄主特异 性位点3‘端 24—26bp 处
不能 寄主特异性 位点 能
是 无用
三、限制性内切酶的命名
Escherichia coli
菌株 类型 EcoR I
dam甲基化酶（修饰GATC中的A） dcm甲基化酶（修饰CCAGG/CCTGG的C）
基因工程中必须使用甲 基化酶失活突变的菌株。
3. 温度
不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。 大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。
酶
最适温 酶
度oC
最适温 酶 度oC
最适温 度oC
Apa I 30
Bcl I
-OH HO-P-
AMP
AMP -OH O-P-
3.2. 3‘-OH对磷原子作亲核攻击，形 成磷酸二脂键，释放出AMP。
四、连接反应的温度
1. 最佳温度 连接酶反应的最佳温度是37C。
2. 实用温度 但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。 所以一般采用 4~16 C。
基因克隆的酶学基础
基因工程
第三章 基因工程酶学基础
返回第三章
2，产生克隆位点 两个不同的DNA样品用同一种酶酶切后，能产生相同的粘性末端
两个平末端DNA片段也可以进行相互拼接
HindIII --CTCGAAGCTTGTTC--CAGCTTCGAACAAG--CTCA—p HO—ACAAG混合 退火
DNA编码，对平末端的连接效率比细菌DNA连接酶高的多。
热稳定的DNA连接酶：嗜热高温放线菌中分离，85度有高活性，
94仍有活性。
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基因工程
第三章 基因工程酶学基础
返回第三章
3.2.3 连接酶的连接作用
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基因工程
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返回第三章
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基因工程
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基因工程
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返回第三章
3.1.6 Ⅱ型酶的特点和识别位点
•大多数II型酶结合并且切割回文序列，又称为识别序列或识别位点
•酶切后产生5’磷酸突出或3’羟基突出的末端，它们统称为粘性末端 酶 •有一些在切割两条链时会产生两端平整(平末端)的DNA分子 •酶的识别位点的可以是4个、5个、6个、8个甚至更多的碱基对 •在分子克隆实验中使用最普遍的是识别4个或6个碱基对的酶 •星号活性:非最佳条件下表现出的活性
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基因工程
第三章 基因工程酶学基础
返回第三章
第二节 DNA、RNA连接酶 3.2.1 待 连 接 二 端 之 一 须 有 磷 酸 根 连接酶
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第三章基因克隆的酶学基础
2020/8/12
2020/8/12
数字表示在 不同寄主中 生长的噬菌 体的成斑率， 表示限制程 度。
二．限制和修饰作用的分子机制
1．大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株 ，有各自的限制和修 饰系统。
1） 它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR; hsdM; hsdS.
2） hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定 位点，将双链DNA切断。（DNA分子转化细胞：受 体细胞去掉hsdR基因位点）
G-3’
3’-GACGTC-5’ 3’-G
ACGTC-5’
② 5’-端突起，个数为2或4个核苷酸
• EcoRI 5’-GAATTC-3’ 5’-G AATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ 3’-CTTAA G-5’
2020/8/12
2020/8/12
2020/8/12
第一节 限制性核酸内切酶 第二节 DNA连接酶 第三节 DNA聚合酶 第四节 DNA及RNA的修饰酶
第五节 核酸外切酶 第六节 单链核酸内切酶
2020/8/12
第一节 限制性核酸内切酶 与DNA分子的体外切割
一、寄主控制的限制与修饰 二、Ⅱ型限制酶的特点 三、影响内切酶活力的因素 四、核酸内切酶对DNA的消化作用 五、 限制酶的用途
DNA分子，产生链的断裂。 • 两个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通
常不是彼此直接相对的 • 因此，断裂的结果形成的DNA片断，也往往
具有互补的单链延伸末端。
2020/8/12
（2）识别顺序和酶切位点 ① 识别４-8个相连的核苷酸
Mbo I NGATCN Ava II GG(A/T)CC BamH I GGATCC PpuM I PuGG(A/T)CCPy
2020/8/12
数字表示在 不同寄主中 生长的噬菌 体的成斑率， 表示限制程 度。
二．限制和修饰作用的分子机制
1．大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株 ，有各自的限制和修 饰系统。
1） 它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR; hsdM; hsdS.
2） hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定 位点，将双链DNA切断。（DNA分子转化细胞：受 体细胞去掉hsdR基因位点）
G-3’
3’-GACGTC-5’ 3’-G
ACGTC-5’
② 5’-端突起，个数为2或4个核苷酸
• EcoRI 5’-GAATTC-3’ 5’-G AATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ 3’-CTTAA G-5’
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第一节 限制性核酸内切酶 第二节 DNA连接酶 第三节 DNA聚合酶 第四节 DNA及RNA的修饰酶
第五节 核酸外切酶 第六节 单链核酸内切酶
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第一节 限制性核酸内切酶 与DNA分子的体外切割
一、寄主控制的限制与修饰 二、Ⅱ型限制酶的特点 三、影响内切酶活力的因素 四、核酸内切酶对DNA的消化作用 五、 限制酶的用途
DNA分子，产生链的断裂。 • 两个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通
常不是彼此直接相对的 • 因此，断裂的结果形成的DNA片断，也往往
具有互补的单链延伸末端。
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（2）识别顺序和酶切位点 ① 识别４-8个相连的核苷酸
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主要特性
限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列
切割位点
Ⅰ型
多功能 异源三聚体 ATP Mg2+ SAM 距识别序列1kb处
随机性切割
Ⅱ型
单功能 同源三聚体
Mg2+ 4-6bp回文序列
识别序列内或附近 特异切割
Ⅲ型
双功能 异源二聚体 ATP Mg2+ 距识别序列下游
24-26bp处 随机性切割
4.Ⅱ限制性核酸内切酶的功能
星活性产生的原因如下： ①反应体系中甘油的浓度大于5%。 ②酶用量过大，大于100U/微克DNA。 ③低离子强度，小于25mmol/L。 ④高pH，大于8.0。 ⑤含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙 酰胺等。 ⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价 离子的存在。
常发生星活性的内切酶有：EcoRI、HindⅢ、 KpnI、PstI、SalI、HinfI等。
④当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液， 若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后， 纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。
10.同裂酶与同尾酶、同位酶
同裂酶(isoschizomer):不同来源的限制性核酸内 切酶识别与切割相同的核苷酸靶序列，这类酶称 为同裂酶。
同尾酶(isocaudarner):不同来源的限制性核酸内 切酶识别与切割的核苷酸靶序列也各不相同，但 都产生相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。
8.影响限制性核酸内切酶活性的因素
①DNA样品的纯度 DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、 EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性。
可采用以下方法，提高酶活性： 加大酶的用量，1μg DNA用10U酶 加大反应总体积 延长反应时间
②DNA样品的甲基化程度
大肠杆菌中的dam甲基化酶在5′GATC3′序列中的腺 嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I Mbol 等，但BamHI、BglII、Sau3A I不受影响。
大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5′CCAGG3′或 5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其 影响的酶有EcoRII等，但BglI、KpnI不受影响。
采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA， 可防止DNA的甲基化。
③ 酶切反应的温度
多数标准反应温度是37℃，如SmaI为25℃或 30℃ ，SfiI为50℃ 。
9.Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项
①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次 操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积 应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓 度超过5%时将会抑制酶的活性。
②整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而 且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。
③当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间， 减少酶的用量。
修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别 自身遗传物质和外来遗传物质的目的。
限制性核酸内切酶的命名原则：
属名
种名 株名
Haemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌d株
HindⅡ HindⅢ
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
3.限制性核酸内切酶的分类
据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及 是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三类。
◆大部分II型限制性核酸内切酶需要相似反应条件：
Tris-HCl 50mmol/L pH7.5
MgCl2 NaCl
10mmol/L 0-100mmol/L
DTT
1mmol/L
Volume
20-100μL
Temperature 37℃
Time
1-1.5h
◆1个单位限制性核酸内切酶：在建议使用的冲液 及温度下，在20μL反应液中反应1h，使1μg标准 DNA完全消化所需的酶量。
6.Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途
①在特异位点上切割DNA，产生特异的 限制性酶片段。
②
组。 ⑤改建质粒。
7.Ⅱ限制性核酸内切酶的星活性(star activity)
在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能 切割与特异识别序列相似的序列,降低酶切反应 的特异性,这种改变的特殊性称为限制性核酸内 切酶的星活性。
BamHI(GGATCC))和BglⅡ(AGATCT)。
同位酶：不同来源的限制性核酸内切酶识别相同 的的核苷酸序列，但切割位点不同，这类酶称为 同位酶。
Ⅱ限制性核酸内切酶有严格的识别、切割 顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷 酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′ 端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对， 通常是反转录重复顺序，具有180°的旋转 对称性即迴文结构。Ⅱ限制性核酸内切酶 切割双链DNA产生3种不同的切口。
5.II型限制性核酸内切酶酶切反应操作
一 限制性内切酶
（一）寄主的限制与修饰现象 限制(restriction)：指一定类型的细菌可以
通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体 DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。 限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源 DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。
修饰(modification)：指寄主本身的DNA， 由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基 化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶 的破坏。
在过去20多年里，生物科学取得的许多 革命性进步都直接来源于对基因的进一步认 识和操作。基因操作或遗传工程的主要工具 就是那些可在DNA分子上催化特异性反应的酶。 酶的切割位点可作为DNA物理图的特殊标记， 利用限制性内切酶可产生特定大小的DNA片段 并使纯化这些DNA片段成为可能，获得的限制 性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质。对 DNA进行修饰的工具的出现，为重组DNA的实 现创造了条件
反应温度过度或过低都会影响酶活性，甚至导 致酶失活。
④DNA分子结构
某些酶切割超螺旋质粒DNA时，酶量比切割线 性DNA时高出多倍，可高达20倍。
⑤核酸内切酶的缓冲液
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子 强度、极端pH值等，会使一些核酸内切 酶的识别和切割序列发生低特异性，即所 谓的“星活性”现象。