噬菌体筛选
噬菌体展示技术筛选脑靶向功能肽及其修饰纳米粒的脑内递药研究
噬菌体展示技术筛选脑靶向功能肽及其修饰纳米粒的脑内递药研究一、概述在生物医学领域中，脑靶向递药系统一直是研究的热点和难点。
由于血脑屏障的存在，许多药物难以有效进入大脑，从而限制了其在中枢神经系统疾病治疗中的应用。
开发新型的脑靶向递药技术，对于提高药物在脑部的浓度和疗效，降低副作用具有重要意义。
噬菌体展示技术以其独特的优势在药物研发和生物医学领域得到广泛应用。
该技术通过将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。
利用噬菌体展示技术，我们可以筛选到与特定靶标具有高亲和力的多肽或蛋白，为药物研发和疾病治疗提供新的候选分子。
本研究旨在利用噬菌体展示技术筛选具有脑靶向功能的多肽，并将其修饰到纳米粒表面，构建新型的脑靶向递药系统。
通过优化筛选条件和方式，我们成功获得了多个具有脑靶向功能的多肽序列，并通过实验验证了其脑靶向性。
我们还将这些多肽以共价连接的方式修饰到聚乙二醇聚乳酸羟基乙酸共聚物（PEGPLGA）纳米粒表面，以提高药物的稳定性和脑部递送效率。
本研究不仅为脑靶向递药系统的开发提供了新的思路和方法，还为中枢神经系统疾病的治疗提供了新的候选药物和递送策略。
通过进一步的研究和优化，我们相信这种新型的脑靶向递药系统将在未来为更多的患者带来福音。
1. 介绍脑靶向药物递送的重要性与挑战脑靶向药物递送是神经科学领域的一个关键研究方向，对于治疗脑部疾病具有重要意义。
由于血脑屏障的存在，许多药物难以有效穿透并进入脑组织，这使得脑内疾病的治疗面临着巨大的挑战。
开发高效的脑靶向药物递送系统成为当前研究的热点和难点。
脑靶向药物递送的重要性主要体现在以下几个方面：对于脑部疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、脑肿瘤等，有效的药物递送能够显著提高治疗效果，改善患者的生存质量。
脑靶向递送系统能够实现药物的精准定位，减少对其他组织器官的副作用。
噬菌体抗体淘筛方法
这两个文库来自于单个人的V H和Vκ的基本结构，具有和那些已知结构的抗原结合位点的侧链多样性，并且在成熟的体系中中具有很高的多样性。
由这个框架来编码的标准结构是目前人抗体技术体系中最普通的。
在能够形成抗原结合表面的前提下重链的CDR3设计的尽可能短。
这两个文库都可以在未知筛选的克隆的序列的情况下进行筛选和免疫亲和力成熟。
这两个文库是噬菌粒/单链片段可变区格式的，并且都经过与蛋白A和蛋白L的结合筛选，所以未筛选的克隆的大多数都是具有功能的。
TomlinsonI构建在plT2载体（(HIS myc 标签），多样化的侧链主要是来自于原始体系中多样性的位点（一共18个残基，H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 and L96）此文库经过筛选后与体细胞突变的多样性的共同作用使其成熟。
我们保证上述信息在没有另外通知之前是严格可信的。
使用此文库之前请认真阅读以下材料确认收到以上材料2. 确认收到的文库未溶解，且使用之前-70摄氏度保存。
3. 参照方案G制备KM134. 在使用文库前清仔细阅读这个方案：在含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的TYE平板上将对照划线培养，置于培养箱37℃过夜培养，挑单菌落置于摇床，接种在5ml含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的2倍TY培养基内，37℃过夜培养。
分别制备阳性和阴性的噬菌体对照（第一天到第十天过夜用500微升）。
用阳性对照和阴性对照产生的噬菌体按照1：100的比例混合，进行一轮的筛选，用100 μg/ml的遍在蛋白在PBS中包被。
通过单克隆噬菌体ELISA检验遍在蛋白的富集程度（经过第一轮筛选后应该超过50%）5. 尽可能的用专用的移液管和一次性的手套，由于噬菌体会非特异的吸附到其他的塑料上，建议使用聚丙烯管。
6. 为提高感染效率，大肠杆菌应该在37℃培养至对数生长期（600nm的OD值应该在0.4）(1)、从一个小型的培养板上转移一个细菌克隆至5ml的2倍TY培养基（不加抗生素和葡萄糖），37℃震荡过夜培养(2)、次日稀释100倍至新鲜的2倍TY培养基内，震荡培养至培养至对数生长期600nm的OD值应该在0.4。
噬菌体展示技术的原理和方法
噬菌体展示技术的原理和方法噬菌体展示技术是一种利用噬菌体表面展示特定肽段或蛋白的技术。
这项技术自20世纪80年代问世以来，已在许多领域显示出广阔的应用前景，包括药物研发、疫苗设计、蛋白质相互作用研究等。
本文将详细介绍噬菌体展示技术的原理和方法，并探讨其优缺点和发展趋势。
噬菌体展示技术利用的是噬菌体的特性，噬菌体是一种病毒，专门感染细菌等微生物。
它们由蛋白质外壳和内部遗传物质组成，其中蛋白质外壳又由多个蛋白亚基组成。
噬菌体展示技术利用噬菌体表面展示特定的肽段或蛋白，这些肽段或蛋白可以来自天然蛋白质，也可以是人工合成的。
展示在噬菌体表面的这些肽段或蛋白能够与特异性受体结合，从而实现表面展示的功能。
噬菌体展示技术的关键之一是选择合适的展示载体。
载体通常是一种丝状噬菌体，其基因组可以容纳较小的外源基因片段。
常用的载体包括M filamentous phage等。
这些载体具有一些共同的特性，如对外源蛋白质的容纳能力较强，能在体内和体外环境中稳定存在等。
在噬菌体展示技术中，需要筛选出能感染特定细菌的噬菌体。
这些噬菌体可以是自生的，也可以是通过基因工程改造得到的。
在筛选过程中，可以利用不同细菌的特性，如受体类型、细胞壁结构等，来选择合适的噬菌体。
还需要考虑噬菌体的毒性、繁殖能力等因素。
在噬菌体展示过程中，需要反复感染以积累足够数量的展示肽段或蛋白。
这个过程中，通常需要使用超滤或凝胶过滤等手段对噬菌体进行纯化，以确保得到的展示肽段或蛋白的纯度和浓度。
反复感染的过程不仅可以增加展示肽段或蛋白的数量，还能帮助排除展示过程中可能产生的突变。
克隆选择是噬菌体展示技术的另一个关键步骤。
这个过程中，通过将展示肽段或蛋白与特定配体结合，筛选出能够与配体结合的克隆。
这些克隆可以进一步扩增和纯化，从而获得高亲和力和高特异性的克隆。
噬菌体展示技术的优点在于其能够将蛋白质或多肽特异性与噬菌体的生物学特性相结合，从而实现表面展示的功能。
噬菌体展示文库的筛选技术 2005
噬菌体展示文库的筛选技术李丽芳 张映(山西农业大学动物科技学院,太谷 030801)摘 要: 噬菌体展示技术(Phage Display Techniques ,PD T )是一种用于筛选和改造功能性多肽的生物技术。
该技术作为筛选与多种靶分子(如抗体、酶类、细胞表面受体等)具有特异性亲和力或活性的肽的一个有效方法,自问世以来,已取得了很大的发展,并被广泛地应用于基因治疗、基因疫苗研究、抗原表位研究、药物设计、研究细胞信号传导等领域[1]。
但该技术在两方面仍需进一步完善:(1)寻求更为有效的表达载体;(2)进一步完善筛选方法。
关键词: 噬菌体 肽库 抗体库 筛选The Selection T echniques of Phage Display LibrariesLi Lifang Zhang Y ing(A ni mal S cience and Technolog y Depart ment of S hanx i A g ricult ure Universit y ,S hanx i Tai gu 030801)Abstract : Phage Display Techniques (PD T )is a biotechnique used for screening and reconstructing functingal polypeptide.It ,s a effective method of select the peptide which has high affinities to many given targets (such as an 2tibody ,Enzyme ,surface receptor of cell ).It has been made much progress and are widely used in many fields ,such as genetic treatment ,the study of genetic vaccine ,epitope mapping ,drug discovery after its appearance.But it has to get more perfact in two sides :(1)Seek more effective expression vector ;(2)G et more perfect selection methods.Many selection methods are reviewed in this article.K ey words : Phage Peptide library Antibody library Selection 噬菌体表面展示技术是一种将外源多肽或蛋白质的DNA 序列插入到噬菌体外壳蛋白的一个结构基因的适当位置上,外源基因将随着外壳蛋白的表达而表达,从而使多肽或蛋白以与外壳蛋白融合的形式展示在噬菌体表面。
噬菌体的分离与纯化
噬菌体的分离纯化及一步生长曲线的绘制前言噬菌体是以细菌为寄主的一类非细胞微生物。
目前对于噬菌体的研究大多数集中在人和动物传染性疾病的防治方面，在环境的治理方面的研究报道较少，因此我们试图分离纯化污水中的噬菌体，掌握其生物学性质，应用所得噬菌体处理、净化生活污水，减少生活污水中病原性细菌的危害。
本研究以从小鹅中提取的大肠杆菌为宿主菌，从污水中分离噬菌体并进行纯化，最后绘制一步生长曲线。
1材料与方法1.1材料1.1.1菌种及样品菌种：从小鹅中提取的大肠杆菌，由老师提供。
污水来源：主要来自于农大出水口。
1.1.2试剂1mmol/L CaCl2溶液1.1.3试剂的配制(1) 液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨5g，牛肉膏1.5 g，NaCl 2.5g，加H2O至500mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌。
(2) 3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g，NaCl 1.5g，加H2O 至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌。
(3) 固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌。
(4) 半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌。
1.1.4主要仪器电热恒温培养箱（SHEL·LAB）、电热恒温水温箱（HHW21·Cu600，XMTD）、恒温摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）、通风柜（M·TFG-A）、医用净化工作台（苏净集团安泰公司）、台式离心机（eppendorf）、台式高速冷冻离心机（BECKMAN COULTER）、超低温冰箱（Forma Scientific）、YM50全自动不锈钢立式电热蒸汽消毒器、针头式细菌过滤器、0.22μm微孔滤膜（上海市新亚净化器件厂）、微量移液器（GILSON）、UVette(Eppendorf)。
1.2方法1.2.1噬菌体的分离1.2.1.1摇菌老师提供的大肠杆菌液加入5mL1×牛肉膏液体培养基，混合后，37℃振荡（120rpm）14h，此时大肠杆菌达到了对数生长期，取出4℃保存。
噬菌体抗体库筛选操作流程tomlinsonij
噬菌体抗体库筛选操作流程tomlinsonijtheLibrariesGeneral Introduction toOver the past 10 years Greg Winter’s lab at the MRC Laboratory of Molecular Biology and the MRC Centre for Protein Engineering (Cambridge, UK) has created a number of artificial libraries of antibodies that can be used to derive binders to almost any target molecule using phage display and selection. These binders can be used for all the same applications as conventional monoclonal antibodies (ELISA, Western blotting, FACS, immunohistochemistry etc) but can be isolated in a fraction of the time and without the need for animal immunisation. To date these so called “na?ve” or “single pot” phage-antibody libraries have been used successfully in hundreds of molecular biology labs world-wide to derive highly specific antibody reagents to a wide range of different proteins, peptides or small molecule compounds.The latest libraries (Tomlinson I and J) that are being distributed by the MRC HGMP Resource Centre each comprise over 100 million different scFv fragments cloned in an ampicillin resistant phagemid vector and transformed into TG1 E. Coli cells (scFv fragments comprise a single polypeptide with the VH and VL domains attached to one another by a flexible Glycine-Serine linker). By carefully following the protocol provided, large numbers of phagemids can be produced and used to select specific binders to target molecules that are attached to the surface of a tube or biotinylated and captured by streptavidin coated beads (so called “panning”). After each round of panning, the non-binders are washed away and the phagemids bound to the target molecule/s are eluted and amplified by infection into fresh TG1 cells. After producing new phagemids from the previous round of panning, the process can be repeated. Typically two or three rounds of panning are required to ensure that more than half the different scFvs in the selected population bind to the target molecule. The monoclonal scFvs can then be screened for binding (using a simple ELISA based protocol) and then used for further analysis of the target molecule. Since all the functional scFvs in the Tomlinson I and J libraries bind Proteins A and L, either of these secondary reagents can be used for detection, purification or immobilisation. Alternatively, secondary reagents that bind the attached myc or HIS6 tags can be used, although in our experience it is better to use the Protein A or L reagents.Finally, we would like to emphasise that these libraries represent a valuable resource. Whether you are familiar with phage display or not we recommend that you perform test selections and subsequent ELISA screening using the anti-bovine serum albumin and anti-bovine ubiquitin controls provided. Only when these experiments have been successfully carried out should you defrost the libraries and start preparing library phage.Derivation of librariesBoth libraries are based on a single human framework for V H (V3-23/DP-47 and J H 4b) and V κ (O12/O2/DPK9 and J κ1) with side chain diversity incorporated at positions in the antigen binding site that make contacts to antigen in known structures and are highly diverse in the mature repertoire. The canonical structure (V H : 1-3, V κ: 2-1-1) encoded by this framework is by far the most common in the human antibody repertoire. The CDR3 of the heavy chain was designed to be as short as possible yet still able to form an antigen binding surface. Both libraries can be selected and affinity matured without knowing the sequences of selected clones. Libraries are in phagemid/scFv format and have been pre-screened for binding to Protein A and Protein L so that the majority of clones in the unselected libraries are functional.Constructed in pIT2 (HIS myc tag). Diversified (DVT) side chains based mainly on those positions which are diverse in the primary repertoire (total of 18 residues - H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 and L96). After selection, can be matured by incorporating additional diversity based on somatic mutation. Library size (with insert): 1.47 x 108 Percentage insert: 96%As above but with NNK side chains. Library size (with insert): 1.37 x 108 Percentage insert: 88%1. Check that you have received:a tube of Library I (~500 µl)a tube of Library J (~500 µl)a glycerol stock of a positive control anti-ubiquitin ScFv in bacterial strain TG1 (labeled TG1-antiubi)a glycerol stock of a positive control anti-BSA ScFv in bacterial strain TG1 (labeled 13CG2)a glycerol stock of T-phage resistant E. Coli. TG1 for propagation of phage (labeled TG1Tr)(lac-proAB) supE thi hsdD5/F' traD36 proA+B lacI q lacZM15)(K12a glycerol stock of E. Coli. HB2151 for expression of antibody fragmentsara ?(lac-proAB) thi/F' proA+B lacI q lacZ?M15)(K12KM133 (~100 µl with 107 pfu/ml)Phage2. Check the library is still frozen and make sure you keep it frozen at -70°C until needed.3. Make stock of KM13 according to Protocol G.4. Run through the protocols using the control clones before you use the library: Streak the controlson TYE plates containing 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose. After overnight growth at 37°C in an incubator pick a single colony from each and grow these overnight (shaking at 37°C) in 5 ml 2xTY1 containing 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose. Make phage for the positive and negative controls separately (use 500 µl of overnight in D1-D10). Use a 1:100 mixture of phage produced from the positive and the negative controls and perform one round of selection (C1-C11) using 100 µg/ml of ubiquitin2 in PBS for coating. Check for enrichment of ubiquitin binders (should be over 50% after one round of selection) by monoclonal phage ELISA (E9-E14).5. Wherever possible use devoted pipettes and disposable plastic ware. The use of polypropylenetubes is recommended as phage may adsorb non-specifically to other plastics.6. For efficient infection of phage, E. coli must be grown at 37°C and be in log phase (OD at 600 nmof 0.4). To prepare this:i. Transfer a bacterial colony from a minimal media plate into 5 ml of 2xTY medium (no antibioticsor glucose). Grow shaking overnight at 37°C.ii. Next day dilute overnight 1:100 into fresh 2xTY medium. Grow shaking at 37°C until OD 600 is0.4 (1.5-2 hrs)7. All centrifugations, except those performed in a micro centrifuge, are performed at 4°C.8.Libraries I and J must be used separately and preferably in parallel. This will ensureselecting the most antigen binding clones.In advanceGather all equipment and reagents (product details are given in the notes at the end of all the protocols). Make sure you have all the necessary media and plates for bacterial growth (the large Bio-Assay plates need to be air-dried in a sterile environment for 2 hrs before use).Plan your time - most of the daily procedures can be performed simultaneously, so read through each protocol carefully before starting.StepsProcedureDay 1 (5 hrs) A1-A6 Grow libraries I and J and make phageB1-B3 Make secondary stock of librariesDay 2 (6 hrs) A7-A12 Grow libraries I and J and make phage (cont.)C1 Coat immunotubes for 1st round of selectionDay 3 (6.5 hrs) C2-C11 1st round of selectionDay 4 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 1st round of selectionC1 Coat immunotubes for 2nd round of selectionDay 5 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 1st round of selection (cont.)C2-C11 2nd round of selectionDay 6 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 2nd round of selectionC1 Coat immunotubes for 3nd round of selectionDay 7 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 2nd round of selection (cont.)C2-C11 3rd round of selectionDay 8 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 3rd round of selectionE1 Coat 96 well plate for polyclonal phage ELISADay 9 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 3rd round of selection (cont.)E2-E8 Polyclonal phage ELISAFurther characterisation of individual clones can be performed by monoclonal phage ELISA (protocol E), monoclonal ELISA using soluble scFv fragments (protocol F), PCR screening (to check for insert, protocol H) and sequencing (protocol I).1. Add the library stock to 200 ml pre-warmed 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin and 1 %glucose.2. Grow shaking at 37°C until the OD 600 is 0.4 (1-2 hrs).3. Take 50 ml of this and add 2x1011 KM13 helper phage3. (Use the remaining 150 ml to make asecondary bacterial stock of the library by following protocol B).4. Incubate without shaking in a 37°C water bath for 30 min.5. Spin at 3,000 g for 10 min (3,600 rpm in Centra 8 or equivalent). Resuspend in 100 ml of 2xTYcontaining 100 µg/ml ampicillin, 50 µg/ml kanamycin and 0.1% glucose.6. Incubate shaking at 30°C overnight.7. Spin the overnight culture at 3,300 g for 30 min (4,000 rpm in Centra 8 or equivalent).8. Add 20 ml PEG/NaCl (20 % Polyethylene glycol 6000, 2.5 M NaCl)to 80 ml supernatant. Mix welland leave for 1 hr on ice.9. Spin 3,300 g for 30 min (4,000 rpm in Centra 8 or equivalent). Pour away PEG/NaCl. Respinbriefly and aspirate any remaining dregs of PEG/NaCl.10 Resuspend the pellet in 4 ml PBS and spin at 11,600 g for 10 min in a micro centrifuge to removeany remaining bacterial debris.11. Store the phage at 4°C for short term storage or in PBS with 15 % glycerol for longer termstorage at -70°C.12. To titre the phage stock dilute 1µl phage in 100µl PBS, 1µl of this in 100µl PBS and so on untilthere are 6 dilutions in total. Add 900µl of TG1 at an OD 600 of 0.4 to each tube and incubate at 37°C in a waterbath for 30 mins. Spot 10 µl of each dilution on a TYE5 plate containing 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose and grow overnight at 37°C. Phage stock should be 1012-1013/ml, enough for at least 10 selections.1. Grow the remaining 150 ml from A3 for a further 2 hr shaking at 37°C.2. Spin down the cells at 10,800 g for 10 min. Resuspend in 10 ml of 2xTY containing 15 % glycerol.3. Store this secondary stock in 20x 500 µl aliquots at -70°C. Use one aliquot for each phagepreparation according to protocol A - this will only be necessary if you wish to do more than 10 selections.(Alternatively, phage can be selected using biotinylated antigen in solution or affinity chromatography. For details see Winter et al. (1994) Annu. Rev. Immunol.12, 433)immunotube6 overnight with 4 ml of the required antigen. The efficiency of coating can1. Coatdepend on the antigen concentration, the buffer and the temperature. Usually 10-100 µg/mlantigen in PBS is used.2. Next day wash tube 3 times with PBS (pour into the tube and then pour it immediately out again).3. Fill tube to brim with 2 % MPBS (2 % Marvel milk powder7 in PBS). Incubate at rt. Standing onthe bench for 2 hr to block.4. Wash tube 3 times with PBS.1012 to 1013 phage from A11 in 4 ml of 2 % MPBS. Incubate for 60 min at rt. rotating using 5. Addan under-and-over turntable and then stand for a further 60 min at rt. Throw away supernatant.6. Wash tubes 10 (round 1)-20 (rounds 2 and 3) times with PBS containing 0.1 % Tween 20.7. Shake out the excess PBS and elute phage by adding 500 µl of trypsin-PBS (50 µl of 10mg/mltrypsin stock solution8 added to 450 µl PBS) and rotating for 10 min at rt using an under-and-over turntable.8. Take 1.75 ml of TG1 at an OD 600 of 0.4 and add 250 µl of the eluted phage (the remaining 250µl should be stored at 4°C). Incubate for 30 min at 37°C in a water bath without shaking.µl, 10 µl of a 1:102 dilution and 10 µl of a 1:104 dilution on TYE plates containing 1009. Spot10µg/ml ampicillin and 1 % glucose and grow overnight at 37°C to titre the phage.10. In round 1 if using a complex antigen (eg cells, cell lysates etc): take the remaining TG1 cultureand spin at 11,600 g in a micro centrifuge for 5 min. Resuspend the pelleted bacteria in 1 ml of 2xTY and plate on a large square Bio-Assay dish9 containing TYE, 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose.In round 1 if using a single hapten, carbohydrate or protein antigen and in subsequent rounds for all antigens: take the remaining TG1 culture and spin at 11,600 g in a micro centrifuge for 5 min.Resuspend the pelleted bacteria in 50 µl of 2xTY and plate on a regular TYE plate containing 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose.11. Grow plates at 37°C overnight.The first round of selection is the most important. Any errors made at this point will be amplified in subsequent rounds of selection. After each round you should get back at least 100 infective phage. If you get less than this it is probable that a mistake has occurred. If so, try repeating the infection with a freshly grown TG1 culture (from a new overnight) at an OD 600 of 0.4 using the remaining 250 µl of eluted phage from C7. If this still yields less than 100 phage, repeat the selection starting at C1.1. After overnight growth add 7 ml of 2xTY 15 % glycerol to the large square Bio-Assay dish or 2mlsto the regular plates and loosen the cells with a glass spreader, mixing them thoroughly. After inoculating 50 µl of the scraped bacteria to 50 ml of 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose, store 1 ml of the remaining bacteria at -70°C in 15% glycerol.2. Grow shaking at 37°C until the OD 600 is 0.4 (1-2 hrs).3. Take 10 ml of this culture and add 5x1010 helper phage.4 Incubate without shaking in a 37°C water bath for 30 min.5. Spin at 3,000 g for 10 min. Resuspend in 50 ml of 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin, 50 µg/mlkanamycin and 0.1% glucose.6. Incubate shaking at 30°C overnight.7. Spin the overnight culture at 3,300 g for 15 min.8. Add 10 ml PEG/NaCl (20 % Polyethylene glycol 6000, 2.5 M NaCl)to 40 ml supernatant. Mix welland leave for 1 hr on ice.9. Spin 3,300 g for 30 min. Pour away PEG/NaCl. Respin briefly and aspirate any remaining dregsof PEG/NaCl.10. Resuspend the pellet in 2 ml PBS and spin at 11,600 g for 10 min in a micro centrifuge to removethe remaining bacterial debris.11. Use 1 ml of this phage for the next round of selection (protocols C and D) and store 1 ml at 4°C.12. Repeat selection for another 2 rounds.Populations of phage produced at each round of selection can be screened for binding by ELISA to identify "polyclonal" phage antibodies. Phage from single colonies can then be screened by ELISA to identify "monoclonal" phage antibodies. Alternatively, after a polyclonal phage ELISA you could proceed directly to making monoclonal soluble antibody fragments, see protocol F. In general, we have found that 2% Marvel in PBS is best for blocking during phage ELISA whereas 3% BSA in PBS is best for blocking during scFv ELISA.1. Coat a 96 well flexible assay plate10 overnight with 100 µl per well of antigen in the same bufferand at the same concentration as used for selection.2. Wash wells 3 times with PBS. Plates can be immersed in a shallow bath containing PBS but youshould check that all wells fill with wash solution (if they do not you may create false positivesduring later washes). Discard liquid by flipping plate over and then shaking it. Add 200 µl per well of 2 % MPBS (2 % Marvel in PBS) or 3% BSA-PBS (3% bovine serum albumin in PBS) to block and incubate for 2 hr at rt.3. Wash wells 3 times with PBS. Add 10 µl PEG precipitated phage from the end of each round ofselection in 100 µl 2 % MPBS (or 3 % BSA-PBS).4. Incubate for 1 hr at rt. Discard phage solution and wash 3 times with PBS-0.1 % Tween 20.5. Add 1 in 5000 dilution of HRP-anti-M1311 in 2 % MPBS (or 3 % BSA-PBS). Incubate for 1 hr atrt., wash 3 times with PBS-0.1 % Tween 20.µl of substrate solution (100 µg/ml TMB12 in 100 mM sodium acetate, pH 6.0. with10 µl 1006. Addof 30 % hydrogen peroxide added to 50 ml of this solution directly before use) to each well and leave at rt. for 2-15 min. A blue colour should develop.7. Stop the reaction by adding 50 µl 1 M sulphuric acid. The blue colour should turn yellow.9. Inoculate individual colonies from the titration plates from each round of selection (see C11) into100 µl 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose in 96 cell-well plates13. Growshaking (250 rpm) overnight at 37°C.10. Use a 96 well transfer device14 to transfer a small inoculum (about 2 µl) from this plate to asecond 96 cell-well plate containing 200 µl of 2xTY with 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose per well. Grow shaking (250 rpm) at 37°C for 2 hr. (Make glycerol stocks of the original 96-well plate, by adding glycerol to a final concentration of 15 %, and then storing the plates at -70°C).11. After 2 hr incubation (of the second plate) add 25 µl 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin, 1 %glucose and 109 helper phage.12. Shake (250 rpm) at 37°C for 1 hr. Spin 1,800 g for 10 min, then aspirate off the supernatant.13. Resuspend pellet in 200 µl 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin and 50 µg/ml kanamycin. Growshaking (250 rpm) overnight at 30°C.14. Spin at 1,800 g for 10 min and use 50 µl of the supernatant in phage ELISA as detailed above.Individual colonies picked from the various rounds of selection (as plated on the dilution series) can be induced in TG-1 to produce soluble scFv (F2-F6). This will ensure the expression of all selected clones including those in which the scFvs contain TAG stop codons (TG-1 as able to suppress termination and introduce a glutamate residue at these positions). Unfortunately, since the TAG stop codon between the scFv and the gIII gene is also suppressed this leads to co-expression of the scFv-pIII fusion which tends to lower the overall levels of scFv expression, even in clones where there are no TAG stop codons in the scFv itself. To circumvent this problem, the selected phage can be used to infect HB2151 (a non-suppresor strain) which is then induced to give soluble expression of antibody fragments (scFv genes that do not contain TAG stop codons will now yield higher levels of soluble scFv than in TG-1, but those that contain TAG stop codons will not produce any soluble scFv) (F1-F6). The expressed scFvs can then be used in ELISA. Detection of bound scFv can be performed using either Protein A-HRP15 or Protein L-HRP16 conjugates.1. From each selection take 10 µl of eluted phage and infect 200 µl exponentially growing HB2151bacteria (OD 600 of 0.4) for 30 min at 37°C in a water bath. Plate 50 µl, 50 µl of a 1:102 dilution,50 µl of a 1:104 dilution and 50 µl of a 1:106 dilution on TYE plates containing 100 µg/mlampicillin and 1 % glucose and grow overnight at 37°C.2. Pick individual colonies into 100 µl 2xTY 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose in 96 cell-wellplates and grow shaking (250 rpm) overnight at 37°C./doc/d1ca22bb960590c69ec376eb.html e a 96 well transfer device14 to transfer a small inocula (about 2 µl) from this plate to a second96 cell-well plate containing 200 µl 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin and 0.1 % glucose perwell. Grow shaking (250 rpm) at 37°C until the OD 600 is approximately 0.9 (about 3 hr). (A stock can be made of the first plate, by adding glycerol to a final concentration of 15 % and storing at -70°C).4. Once OD 0.9 is reached (wells look quite cloudy) add 25 µl 2xTY containing 100 µg/ml ampicillinand 9 mM IPTG (isopropyl β-D-thiogalactoside, final concentration 1 mM IPTG). Continueshaking (250 rpm) at 30°C overnight.5. Coat a 96 well flexible assay plate overnight with 100 µl per well of antigen in the same buffer andat the same concentration as used for selection.6. Spin the plate from step F4 at 1,800 g for 10 min and use 50 µl of the supernatant (take care notto transfer any bacteria) for ELISA in 3% BSA-PBS (final concentration) (protocol E) except usinga 1:5000 dilution of Protein A-HRP15 or Protein L-HRP16 to detect binding in step E5.µl TG1 at an OD 600 of 0.4 with 10 µl of 100-fold serial dilutions of KM13 helper 2001. Infectphage3 (in order to get well separated plaques) in a 37°C water bath (without shaking) for 30 min.Add to 3 ml molten H-top agar (42°C) and pour onto warm TYE plates (no antibiotics). Allow to set and incubate overnight at 37°C.2. Pick a small plaque into 5 ml of fresh TG1 at an OD 600 of 0.4. Grow for about 2 hr shaking at37°C.3. Add to 500 ml 2xTY in a 2 litre flask and grow shaking at 37°C for 1 hr. Add kanamycin to a finalconcentration of 50 µg/ml (no glucose). Grow overnight shaking at 30°C.4. Spin overnight culture at 10,800 g for 15 min. Add 100 ml PEG/NaCl (20 % polyethylene glycol6000, 2.5 M NaCl) to 400 ml supernatent and leave for 1 hr on ice.5. Spin 10,800 g for 30 min. Pour away PEG/NaCl.6. Resuspend the pellet in 8 ml PBS and add 2 ml PEG/NaCl. Mix well and leave for 20 minutes onice.7. Spin 3,300 g for 30 min. Respin briefly and aspirate any remaining dregs of PEG/NaCl.8. Resuspend pellet in 5 ml PBS and spin at 11,600 g for 10 min in a micro centrifuge to remove anyremaining bacterial debris.9. Store the helper phage at 4°C for short term storage or in PBS with 15 % glycerol for longer termstorage at -70°C.10. To titre the helper phage take 45µl phage and add 5µl trypsin stock solution. Incubate for 30 minsat 37 °C. Dilute 1µl of trypsin treated phage in 1ml PBS and make five 100 fold serial dilutions of this in 1ml aliquots of PBS. Add 50µl of the six dilutions to six separate tube containing 1ml of TG1 at an OD 600 of 0.4. Mix, add 3 ml molten H-Top and pour evenly onto TYE plates.Perform the same dilution series using 1µl of non-trypsin treated phage. The titre of the trypsin treated phage should be 105-108 lower than for the non-trypsin treated phage. If not, pickanother plaque and repeat helper phage preparation.Once the libraries have been selected you may wish to check individual clones for the presence of full length VH and Vκinsert. All PCRs are at annealing temperature of 55°C. 1 min extension for V H or Vκon their own, 2 min extension for V H and Vκ together.For V H only use LMB3: CAG GAA ACA GCT ATG AClink seq new: CGA CCC GCC ACC GCC GCT Gwith insert = 527 bpwithout insert = 227 bpFor Vκ only use DPK9 FR1 seq: CAT CTG TAG GAG ACA GAG TCpHEN seq: CTA TGC GGC CCC ATT CAwith insert = 368 bpwithout insert = no bandFor V H and Vκ use LMB3: CAG GAA ACA GCT ATG ACpHEN seq: CTA TGC GGC CCC ATT CAwith insert = 935 bpwithout insert = 329 bpFor sequencing of selected clones the following primers are recommended.For V H use link seq new CGA CCC GCC ACC GCC GCT GFor Vκ use pHEN seq CTA TGC GGC CCC ATT CAXhoI NotIRBS CAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCAAATTCTATTTCAAGGAGACAGTCATA ATG AAA TAC CTA ----------------> M K Y L LMB3SfiI __NcoI__TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG TTT L P T A A A G L L L L A A Q P A M A E V F XhoI linkerGAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCG AGC GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGTD Y W G Q G T L V T V S S G G G G S G G GSalI NotI HIS-tag GGC AGC GGC GGT GGC GGG TCG ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG GCG GCC GCA CAT CAT CAT CACG S G G G G S T D I Q M T Q A A A H H H H<------------------------link seq newmyc-tagCAT CAC GGG GCC GCA GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGG GCC GCA TAG ACTH H G A A E Q K L I S E E D L N G A A * T<---------------------pHEN seq1. 2xTY is 16g Tryptone, 10g Yeast Extract and 5g NaCl in 1 litre.2. Bovine ubiquitin (5 mg) is available from Fluka, Chemika-BioChemika, Industriestrasse 25, CH-9470 Buchs, Switzerland, Tel +41 81 755 2511, Fax +41 81 756 5449.3. KM13 is the protease cleavable helper phage described i n Kristensen and Winter, Folding andDesign3, 321-328 (1998).4. PBS is5.84 g NaCl, 4.72 g Na2HPO4 and 2.64 g NaH2PO4.2H20, pH 7.2, in 1 litre.5. TYE is 15g Bacto-Agar, 8g NaCl, 10g Tryptone, 5g Yeast Extract in 1 litre.6. Nunc Maxisorp immuno test tubes (Cat. No. 4-44202) are available from Gibco BRL, LifeTechnologies Ltd., P. O. Box 35, Trident House, Washington Road, Paisley, PA3 4EF, Scotland, U.K, Tel +44 141 814 6100, Fax +44 141 887 1167.7. 'Marvel' is dried skimmed milk powder.8. Trypsin (T-1426 Type XIII from Bovine Pancreas - Sigma Chemical Company Ltd., Fancy Rd.,Dorset, BH17 7NH, U.K, Tel +44 1202 733114; Fax +44 1202 715460) made up in 50mM Tris-HCl pH7.4, 1mM CaCl2 and stored at -20°C9. Nunc Bio-Assay dish is available from Gibco BRL (see note 6).10. Falcon MicroTest III flexible 96 well flat bottomed assay plates are available from BectonDickinson Labware, Becton Dickinson and Co., 2 Bridgewater Lane, Lincoln Park, NJ 07035,USA.11. HRP-anti-M13 is available from Amersham International plc, Amersham Place, Little Chalfont,Buckinghamshire, HP7 9NA, UK. Tel: +44 01494 544000; Fax: +44 01494 542929.12. TMB is 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine and is available from Sigma (see Note 8). A 10 mg/ml stocksolution can be made by dissolving the TMB in DMSO.13. Corning 'Cell Wells' flat-bottomed multiple well tissue culture treated plates are available fromCorning Glass Works, Corning N.Y. 14831. USA.14. The 96 well transfer device is a piece of wood the size of a microtitre plate with a handle on oneside and 96 metal pins (each 7 cm long with a concave end) on the other. This can be sterilised between bacterial transfer by immersion in a bath of ethanol and then by flaming (hold well away from your body and any flamable objects). If you haven't got one of these (or something similar) you will have to make one yourself or alternatively use a multichannel pipette for bacterialtransfer.15. Horse Radish Peroxidase conjugated Protein A is available from Amersham International plc (seenote 11)14. Horse Radish Peroxidase conjugated Protein L is available from Actigen Ltd, 5 Signet Court,Swanns Road, Cambridge, CB5 8LA, UK. Tel: +44 01223 319101; Fax: +44 01233 316443.。
aFGF特异性结合噬菌体的筛选与鉴定
ＨＵＡＮＧ Ｘｉ ａ， Ｘ Ｊ Ｅ Ｒｕ ｉ ｍｉ ｎ，ＹＡＮ Ｆ ｅ ｎ ｇ （ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆＯ ｃ ｅ ａ ｎ ， Ｈ ａ ｉ ｎ ａ ｎ【 ， Ｈ ａ ｉ ｋ ｏ ｕ ５ ７ ０ ２ ２ ８ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
第２ ６ 卷第 ２ 期 ２ ０ １ ３ 年６ 月
海南 师 范大学 学 报 （ 自然科 学版 ）
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｈ ａ ｉ ｎ ａ ｎ Ｎ ｏ ｒ ｍ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ （ Ｎ ａ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ）
Ｖｏ １ ． ２ ６ Ｎｏ ． ２
Ｊ ｕ ｎ ． ２ ０ １ ３
ａ Ｆ Ｇ Ｆ 特异性结合噬菌体的筛选与鉴定
黄 霞 ， 谢 瑞敏 ， 严 峰’
（ 海南大学 海洋学院， 海南 海 口 ５ ７ ０ ２ ２ ８ ） 摘 要： 利用噬菌体 ７ 肽库 筛选 出ａ Ｆ Ｇ Ｆ 特异性结合 噬茵体 并鉴定其 活性． 经过 四轮淘选 ， Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ检 测结合 活性 ， 然后挑取 单克隆测序． 竞争抑 制试验验证 阳性克隆与 ａ Ｆ Ｇ Ｆ的结合 活性．
ＭＴ Ｔ法检 测 阳性 噬 茵体对 ａ Ｆ Ｇ Ｆ诱 导的 Ｂ ａ ｌ ｂ ／ ｃ ３ Ｔ ３细胞 增殖 的影 响． 一 系列 实验 结 果显 示 ， 筛选 出 的Ｐ ８ 号 阳性 噬 菌 体 与 ａ Ｆ Ｇ Ｆ结合 的特 异 性 很 高 ， 对ａ Ｆ Ｇ Ｆ诱 导 的 Ｂ ａ ｌ ｂ ／ ｃ ３ Ｔ ３细胞 增 殖 具有 抑 制 作
噬菌体筛选过程
噬菌体筛选过程
噬菌体筛选过程是指通过一系列实验方法和结果的分析，找出具有高效寄生能力和选择性的噬菌体。
该过程通常包括以下几个步骤： 1. 菌株的选择：首先需要选择一个目标菌株，并确定其生长条件和培养基。
这些条件应该能够满足噬菌体的生长和寄生需求。
2. 噬菌体的初步筛选：在满足菌株生长条件的基础上，使用不同的噬菌体悬液进行初步筛选。
评价指标通常包括噬菌效率、寄生速度和选择性等。
3. 噬菌体的进一步筛选：根据初步筛选结果，选择效果较好的噬菌体进行进一步筛选。
该阶段通常包括寄生速度、选择性、感染范围等指标的评估。
4. 噬菌体的鉴定和纯化：在得到优良噬菌体后，需要进行鉴定和纯化工作，以保证筛选得到的噬菌体纯度和有效性。
5. 噬菌体的应用：最后，筛选得到的噬菌体可以应用在医疗、农业等领域，例如治疗细菌感染、控制农业有害菌等。
- 1 -。
噬菌体筛选
噬菌斑分析1、将合适的宿主菌接种到M9TB培养基上，37℃摇至0D600=1.0；2、使用前，可将宿主菌保存在4℃，保存超过48h的菌不可使用；3、熔化足够量的顶层培养基，每个平板需5ml，将熔化后的培养基放在45-55℃的水浴锅中；4、使用无菌LB培养基制备一系列稀释度的样品。
通常选择103-106的重组噬菌体稀释度。
空白对照则选择107；10-210-310-710μL样品100μL …………990μL 900μL5、准备4mL的无菌管，加入250μL的宿主菌。
从最高稀释度开始加起，每管加入100μL噬菌体稀释液。
注意换枪头；6、在每管中加入3mL的顶层培养基，混合后倒在无抗LB/LB carb+/LB carb+amp+平板上，轻摇使其迅速铺平；7、平板静置几分钟后，翻转，37℃培养3-4h或室温过夜；8、数噬菌斑数并计算噬菌体滴度。
如：稀释度为10-6的平板上有200个噬菌斑，则滴度为200×106×10=2×109pfu/mL样品中噬菌体总数由滴度×样品总量决定。
如：1μg的载体DNA被包装，最终的包装反应体积为0.3mL（25μL包装提取物+5μL连接物+270μL无菌培养基）。
在包装反应中pfu总数为2×109pfu/mL×0，3mL=6×108pfu。
另外，因为使用了1μg的载体，效率是6×108pfu。
文库扩增当原始重组体总数少于5×106，选择平板裂解法；当需要大量扩增时，选择液体裂解法。
平板裂解扩增1、接种1mL过夜培养的宿主菌到50mL TB培养基，37℃摇至OD600=0.6-1.0，如果使用5615菌，当OD600=0.5时，添加IPTG至终浓度1mM，然后继续摇30min；2、如果包装反应保存在氯仿里，轻微离心分离出氯仿，将噬菌体吸出；3、计算需要的细胞和噬菌体量。
每10mL细胞含1×106，将噬菌体和细胞混合，加入50mL培养基，这些混合物需在20min内倒入平板。
抗噬菌体菌株筛选
抗噬菌体菌株筛选噬菌体的分离取疑似噬菌体感染的生产菌株斜面或平板，用无菌蒸馏水将菌苔洗下，无菌过滤或离心，收集滤液或上清液。
在摇瓶培养基中接种1%生产菌株的孢子或细胞悬浮液，适温下培养24 h，加入1%的上述滤液或56离心上清液，继续培养24 h，无菌离心或过滤，收集上清液或滤液。
取上述上清液或滤液和生产菌株的孢子或细胞悬浮液各0.25ml，混匀后加在生产菌株的平板培养基上，用刮棒涂布均匀，适温下培养48~96h，确认是否生成噬菌斑。
噬菌体的纯化与增殖将上述平板上长出的噬菌斑用接种针移入生产菌株培养12~24 h的摇瓶培养液中，继续培养24 h左右，无菌过滤或离心收集滤液或上清液。
取上述滤液或上清液和生产菌株的孢子或细胞悬浮液各0.25 ml ，混匀后加在生产菌株的平57 板培养基上，用刮棒涂布均匀，适温下培养48~96h，确认是否生成噬菌斑。
重复以上两个步骤，使噬菌体达到纯化和增殖的目的。
最终所得滤液或上清液作为纯化噬菌体原液置冰箱保存。
噬菌体效价的测定取6支灭菌并烘干的小试管，分别标注 1 0-1、1 0-2、1 0-3、1 0 -4、1 0-5和10-6，各加入0.9 ml 无菌蒸馏水。
在10-1小试管中加入纯化噬菌体原液0.1ml，混匀后取出0.1ml移入10-2小试管中，如此类推，分别获得 6 个稀释度的噬菌体稀释液。
在 5 支灭菌并烘干且分别标注10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的小试管中，分别加入0.1 ml 上述10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的噬菌体稀释液和0.9 ml生产菌株的孢子或细胞悬浮液，摇匀后再加入50C的生产菌株琼脂培养基，迅速摇匀后分别倾入标注10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的灭菌培养皿中，凝固后置适温下培养48~96 h，对所形成的噬菌斑计数。
抗噬菌体菌株选育步骤斜面範子悬浮液T不同様释度平板分离培养.苗落计数/诱变处理J6O80C下处理5*：L5min t抗性捡测*/不同稀释度平板分离培养、菌落计懿单菌落J 屮只选取抗性检测具冇最大抗性的舒面恐浮液进入卜」步敢菌落分离+ K/扌富瓶发酵余全部j Ai^i fa销毁*如耒能获彳&抗效价测定性，则反复遊行上述步•骤。
利用噬菌体展示技术筛选靶向癌细胞表面的新型肽
利用噬菌体展示技术筛选靶向癌细胞表面的新型肽肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病，虽然现在有很多治疗肿瘤的方法，但是很多方法仍然存在缺点，比如副作用大、难以选择性靶向肿瘤细胞等。
而目前，利用噬菌体展示技术筛选靶向癌细胞表面的新型肽已经成为一个新的研究方向，可以帮助我们更好地治疗肿瘤，减少副作用。
本文将从以下几个方面进行讨论：一、噬菌体展示技术的原理噬菌体是一种寄生在细菌体内的病毒，其基因组较小，只有几千个碱基对。
噬菌体展示技术指的是将目标多肽或蛋白质与噬菌体表面融合，然后通过筛选找到与目标靶点高度亲和力的新型肽或蛋白质，并利用筛选的结果进行药物研发。
二、利用噬菌体展示技术筛选靶向癌细胞表面的新型肽的优点由于肿瘤细胞表面的分子与正常细胞不同，靶向癌细胞表面的新型肽研究成为了治疗肿瘤的一个重要方向。
利用噬菌体展示技术可以快速筛选出与癌细胞表面高度亲和的新型肽，这些新型肽可以被用于制备药物。
与传统的药物研发方法相比，噬菌体展示技术筛选出的肽具有选择性和特异性，能够减少对正常细胞的影响，从而降低治疗过程中的副作用。
三、噬菌体展示技术在靶向癌细胞表面菌素的研究中的应用通过噬菌体展示技术筛选到的肽可以被用来靶向癌细胞表面的多个分子靶点。
比如，一项研究利用噬菌体展示技术筛选出针对HER2靶向肽，将其与载药纳米粒子结合，可以明显提高抗肿瘤效果。
另一项研究发现一个靶向乳腺癌细胞表面的新型肽，可以用来诊断早期乳腺癌。
更有研究者通过噬菌体展示技术筛选出膀胱癌细胞表面的新型肽，并成功应用于临床，证明了噬菌体展示技术在肿瘤治疗中的应用前景。
四、总结随着研究的深入，噬菌体展示技术在肿瘤治疗中发挥越来越重要的作用。
利用噬菌体展示技术筛选靶向癌细胞表面的新型肽，不仅可以提高治疗效果，还可以降低副作用。
噬菌体展示技术在肿瘤治疗中的应用前景十分广阔，我们有理由相信，未来会有更多的新型肽在研究中发现，并成功应用于临床。
噬菌体肽文库的筛选方法
以及某些碳水 化合 物等 。噬菌 体 展示 随 机肽 库 的库 容 非常 大， 多肽 之所 以能够 准确无误 地 、 效地结 合于 靶蛋 白， 有 主要
原因 ｌ 为 ： Ｉ 两个蛋 白间相互作 用 的重要 部 分仅仅 是 ３ ０个 Ｊ ～１ 氨基酸残基 ， 因此肽 足 以与 蛋 白质 的 主要 位点 结 合 ； 可 以 肽 噩换 目的蛋 白中隐蔽的 位点 ， 而这些位 点在 其活性 或结 合位 点 中起 重要作用 ； 亲和筛选迫 使噬菌体 与 目的蛋 白间 的结合 力相 当强 ， 以克服强烈的洗 脱作用 。因 此肽 可以特 异性 地 足
１ 常 规 筛 选 方 法 １９ ９ ３年 ， ｍｉ 等 设 计 了 一 种 称 之 为 “ 物 淘 洗 ” Ｓ ｔ ｈ 生
（ ｉ ａ ｎｎ ） ｂ ｐｎ ｉ 的方 法 ， 功 地解 决 了筛 选 难 题 ｌ 。生 物 淘 洗 ｏ ｇ 成 ２ 的过程大 致如下 ： 首先将 随机肽 库与 包被 （ 固相化 ） 的抗 体或 受体吸 附 ， 继之 以竞 争性 受 体或 酸 洗脱 下 吸附 的 噬菌 体 ， 经 繁殖扩增 后 ， 进行下 一 轮淘 洗 ， 样 经过 ３ 再 这 ～５轮 的 “ 吸附
一
洗脱 一扩增 ” ， 后 递呈 特异 多肽的 噬菌 体得到 了 高度富集 。
为了解 决抗体 固相 化时 的空间位阻 现象 ， 先将链 亲合 素 固 可 相化 ， 再包 被生物 素化 的抗体 。现在生 物淘 洗 已成 为肽 库筛
选 中行之有效 的常规方 法 。 ２ 竞 争 洗 脱 法
Ｓ Ｐ与 噬 菌 体 表 面 呈 现 技 术 相 比具 有 三 个 突 出 的 优 Ｉ 势ｌ： ４ 噬菌 体的特异 性 筛选 与 噬菌 体 的扩 增 同时进 行 ； 选 』 筛 蛋 白或配基无须 表达和纯化 ， 筛选 系统 中只要 Ｄ ＮＡ存 在 ， 只 需少量 的功能产 物表 达 ， 即可 达到 筛选 目的 ； 原则 上 ， Ｉ ＳＰ的 在 体筛选也适 合 于“ 库 与文 库 ” 的筛 检 。但 是 目前 ＳＰ 文 间 Ｉ 筛选而且 噬菌体 与配基 间的识 别仍存 在一些实 际问题 。
噬菌体展示技术体内筛选小鼠肾脏特异性多肽
中 图分 类 号 ： Ｑ７ ８ 文 献标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ： １ ７ —７ Ｘ（ ０ ８ ０ — ２ ８ ０ ６ ２ ２ １ ２ ０ ） ４ ０ ４ —４
噬菌体库固相-液相筛选的标准操作规程
噬菌体库固相-液相筛选的标准操作规程（编号：063）
1、目的及适用范围
为了避免筛选到非特异性结合的噬菌体克隆，采用轮换淘选法，主要用于噬菌体展示库的初步筛选。
2、主要仪器
酶联条、微量移液器、摇床、垂直混匀仪、三角烧瓶、37℃摇床
3、试剂及配制方法
3.1 1×TBS配方：
Tris-HCI缓冲液（0.5M pH7.6）100mL
NaCl 8.5-9g
双蒸水加至1000mL
先以少量双蒸水溶解NaCl，再加入Tris-HCl缓冲液，最后加双蒸水至1000mL，充分摇匀。
3.2 1×TBST（含0.05%Tween20）：
1000mL1×TBS中加入0.5mL Tween20
3.3 包被液：（pH 9.6 0.05 M碳酸盐缓冲液）
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
加蒸馏水至 1000mL
溶解后每瓶50mL分装，高压灭菌备用。
3.4 5%[W/V]BSA：100mL1×TBS中加入5g BSA。
3.5 2 M Tris·Cl（pH8.0）：242g Tris置于800mL超纯水中，溶解后，HCl调pH值至8.0，再用超纯水定容至1000mL。
3.6 0.2 M Gly-HCl（pH2.2）：15g glycine 置于800mL超纯水中，溶解后，HCl调pH值至2.2，再用超纯水定容至1000mL。
3.7 2×YT：
胰蛋白胨16g/L
酵母提取物10g/L
氯化钠5g/L
根据经验值用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4(该pH适合目前使用最广的原核表达
128。
噬菌体库的筛选原理
噬菌体库的筛选原理
噬菌体库（phage library）是一种用于筛选特定目标的噬菌体（phage）的方法。
其筛选原理如下：
1. 构建噬菌体库：从已知的DNA或RNA样品中，随机将目标序列片段插入噬菌体的基因组中，并将这些基因组片段包裹在噬菌体的外壳中。
构建好的噬菌体库含有许多噬菌体，每个噬菌体携带着不同的目标序列片段。
2. 筛选目标：将噬菌体库与特定靶点进行反应，例如与靶蛋白质结合。
未结合的噬菌体可以被洗去，而与靶点结合的噬菌体则保留下来。
3. 提取目标噬菌体：将与靶点结合的噬菌体进行扩增，使其数量增加。
通常使用大肠杆菌等宿主细胞进行扩增。
4. 再次筛选：将扩增后的目标噬菌体再次与靶点进行反应和洗脱，以进一步筛选出特异性更高的噬菌体。
5. 验证筛选结果：对所得的单个目标噬菌体进行验证，确认其与靶点的结合能力和特异性。
噬菌体库筛选原理的核心是利用噬菌体随机插入外源基因的特点，通过与目标分子结合的能力将其筛选出来。
这种方法被广泛应用于蛋白质相互作用、抗体产生
和蛋白质工程等领域。
作用于大肠杆菌噬菌体的筛选
健康养殖·诊疗84畜牧业环境 2020.06摘 要：大肠埃希氏菌（E.coli），属称大肠杆菌。
在特定条件下大肠杆菌可致病。
近年来，由于兽医临床耐药大肠杆菌的不断出现，新抗生素的研制困难重重，而噬菌体（bacteriophage 或phage）是一类细菌依赖性的病毒，能在菌体内快速增殖并最终裂解细菌从而达到抗菌效果。
因此研究大肠杆菌噬菌体用于防治大肠杆菌感染受重视。
为了筛选出作用于大肠杆菌的噬菌体，通过水样法、双层平板法和点滴法从污水中筛选出噬菌体并进行分离纯化。
结果发现，滴了噬菌体的部位出现了明显的噬菌斑，说明噬菌体对大肠杆菌发挥裂解作用。
为进一步研究噬菌体与大肠杆菌相互作用提供理论基础。
关键词：大肠杆菌；噬菌体；筛选；水样法；双层平板法；点滴法1 研究目的和意义本研究通过试验筛选出作用于大肠杆菌的噬菌，研究大肠杆菌噬菌体的形态并对其进行分离纯化。
为进一步的噬菌体与大肠杆菌相互作用研究提供理论基础。
2 材料与方法2.1 材料（1）污水：来自长江大学河滨公寓旁水沟的不同位置。
（2）标准大肠杆菌：长江大学实验室保存。
2.2 试验主要仪器及器材培养皿、恒温箱、离心机、高压蒸汽锅、酒精灯、滴管、接种环、0.22 μm滤膜，注射器、锥形瓶、移液器等长江大学相关实验室提供。
2.3 试验方法污水采集：在长江大学河滨公寓旁水沟中的不同位置采集3瓶（555ml）污水，分别编号1、2、3，将样品放入泡沫箱中保存。
LB培养基制备：分别称取NaCl 4.5 g、蛋白胨9g、酵母提取物4.5 g放入500 ml锥形瓶中，加入300 ml蒸馏水，充分摇匀加热至沸腾，待冷却后分别倒入3个锥形瓶（250 ml）中，每瓶50 ml，放入高压立式蒸汽灭菌器内灭菌。
SM缓冲液配制：Nacl 5.8 g，MgSO 4·7H 2O 2 g，1M Tris·CL（pH 7.5）50 ml，2%明胶5 ml，加双蒸水至1 000 ml，121℃高压灭菌20 min，4℃保存，该试剂用于噬菌体的保存及稀释。
噬菌体显示系统筛选原理
噬菌体显示系统筛选原理
噬菌体展示技术（phage display）是将外源编码多肽或蛋白质的基因通过基因工程技术插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框能正确表达，使外源多肽或蛋白在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，随子代噬菌体的重新组装呈现在噬菌体表面，可以保持相对的空间结构和生物活性。
然后利用靶分子，采用合适的淘洗方法，洗去未特异性结合的噬菌体。
再用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过3-5轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白。
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噬菌斑分析
1、将合适的宿主菌接种到M9TB培养基上，37℃摇至0D600=1.0；
2、使用前，可将宿主菌保存在4℃，保存超过48h的菌不可使用；
3、熔化足够量的顶层培养基，每个平板需5ml，将熔化后的培养基放在45-55℃的
水浴锅中；
4、使用无菌LB培养基制备一系列稀释度的样品。
通常选择103-106的重组噬菌体
稀释度。
空白对照则选择107；
10-210-310-7
10μL样品
100μL …………
990μL 900μL
5、准备4mL的无菌管，加入250μL的宿主菌。
从最高稀释度开始加起，每管加
入100μL噬菌体稀释液。
注意换枪头；
6、在每管中加入3mL的顶层培养基，混合后倒在无抗LB/LB carb+/LB carb+amp+平
板上，轻摇使其迅速铺平；
7、平板静置几分钟后，翻转，37℃培养3-4h或室温过夜；
8、数噬菌斑数并计算噬菌体滴度。
如：稀释度为10-6的平板上有200个噬菌斑，则滴度为
200×106×10=2×109pfu/mL
样品中噬菌体总数由滴度×样品总量决定。
如：1μg的载体DNA被包装，最终的包装反应体积为0.3mL（25μL包装提取物+5μL连接物+270μL无菌培养基）。
在包装反应中pfu总数为2×109pfu/mL×0，3mL=6×108pfu。
另外，因为使用了1μg的载体，效率是6×108pfu。
文库扩增
当原始重组体总数少于5×106，选择平板裂解法；当需要大量扩增时，选择液体裂解法。
平板裂解扩增
1、接种1mL过夜培养的宿主菌到50mL TB培养基，37℃摇至OD600=0.6-1.0，如果
使用5615菌，当OD600=0.5时，添加IPTG至终浓度1mM，然后继续摇30min；
2、如果包装反应保存在氯仿里，轻微离心分离出氯仿，将噬菌体吸出；
3、计算需要的细胞和噬菌体量。
每10mL细胞含1×106，将噬菌体和细胞混合，
加入50mL培养基，这些混合物需在20min内倒入平板。
4、转接1mL的噬菌体/细胞混合物到无菌的15mL管子内；
5、每个管子内加入10mL熔化的45-55℃的顶层培养基。
混匀后直接倒到150mm
的无抗LB/LB carb+/LB carb+amp+平板上，轻轻平摇使琼脂糖培养基铺平；
6、平板静置几分钟，待顶层培养基凝固，翻转，培养至噬菌斑几乎融合（37℃培
养3-4h或室温过夜）；
7、每个平板上加入10mL噬菌体提取Buffer（20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl,
6 mM MgSO
4
），置于4℃水平面2h-过夜；
8、平板稍微倾斜，吸取上层液体至无菌管内。
将所有提取Buffer集中
到一个管子内。
加入0.5mL氯仿，轻轻混匀。
3000×g，5min，澄清裂解物，将上清吸到无菌管子内。
经噬菌斑分析决定扩增文库的滴度。
扩增文库的裂解物可在4℃保存滴度不降低。
若要长期保存，加入0.1倍体积的80%无菌甘油，-704℃保存。
液体裂解法
1、从划线的平板上挑取单菌落接种到50mL相应抗性LB培养基中，37℃
摇过夜。
宿主菌可在4℃保存两天；
2、将5mL过夜培养物加入500mL无抗LB/LB carb+/LB carb+amp+培养基中，
37℃摇至OD
600
=0.6-1.0，如果使用5615菌，当OD
600
=0.5时，添加IPTG 至终浓度1mM，然后继续摇30min；培养物种细胞数计算公式：
cells
OD
mL
OD11
600
8
600
10
5.1
volume
culture
5.0
/
cell
10
2
⨯
=
⨯
⨯
⨯
3、在MOI为0.001-0.01时，用噬菌体感染培养物（每个pfu1，00-1000
个细胞）。
比如，500mL宿主菌培养物OD
600
=0.75，则细胞总数为：
cells
mL
OD
mL
OD11
600
8
600
10
5.1
500
5.0
/
cell
10
2
⨯
=
⨯
⨯
⨯
这一培养物可被1.5 × 108到1.5 × 109pfu感染。
4、37℃摇1-3h至可观察到裂解。
裂解会使OD值下降，培养集中细长残片
会增加。
一旦观察到裂解就停止培养，过分培养会导致滴度降低； 5、8000g ，10min 澄清裂解物。
将上清吸到无菌管子内。
经噬菌斑分析决定扩增文库的滴度。
6、扩增文库的裂解物可在4℃保存滴度不降低。
若要长期保存，加入0.1倍体积的80%无菌甘油，-70℃保存。
文库筛选
目标蛋白包被ELISA 板
1、 用去离子水洗板子数次，轻拍去除水分；
2、 稀释目标蛋白至1-10μg/mL ；
3、 每孔加100μL 稀释蛋白，室温3-4h 或4℃过夜；
4、 每孔用300μL 1×TBS 或水洗3次，洗去未结合的蛋白；
5、 准备5%的阻断剂（用水稀释），每孔加200μL;
6、 室温孵育60min 或4℃过夜；
7、 去离子水洗板子5次，每孔加200μL 水。
盖住板子保存在4℃，待用。
板子可保存数周。
筛选
1、 接种相应的宿主菌至抗性LB 培养基中，37℃摇至0D 600=0.5-0.6；
2、 根据扩增文库的滴度和期望筛到噬菌体数，计算第一轮筛选所需的噬菌体裂解物的量。
比如，一个多肽文库包含1×109原始重组体，期望筛库100次，扩增文库的滴度为3×1011pfu/mL ，则第一轮所需裂解物的量计算如下
required volume er
librarytit amplified ty multiplici ts recombinan primary =⨯）
（
mL mL
33.0/pfu 103100
pfu 101119=⨯⨯⨯
3、 配制100mL 的1×TBST （10mL 10×TBST + 90mL 去离子水）；
4、 每孔加100μL 噬菌体裂解物, 室温孵育30min ；
5、 用1×TBS 洗板子5次。
也可用真空洗板机或每孔加入多于200μL 的
Buffer ，短暂孵育，倒出buffer ，拍干；
6、 加入200μL T7抽提液，抽提结合的噬菌体，室温孵育10-20min ；
7、 将噬菌体抽提液收集在15mL 无菌管中；
8、 将250μL 抽屉的噬菌体添加到50mL 宿主菌培养液中（第一步中制备
的），37℃摇至裂解（1-3h ）；
9、 将裂解培养物收集在50mL 离心管中，8000g ，10min 。
收集上清，4℃
保存备用（下次筛库用）。