凝胶层析柱特性测试
凝胶层析实验报告结论
一、实验目的本次实验旨在通过凝胶层析技术，对混合溶液中的不同组分进行分离，验证凝胶层析法的原理，并探讨影响分离效果的因素。
二、实验原理凝胶层析是一种基于分子筛效应的分离技术。
凝胶作为一种具有多孔结构的材料，其孔径大小可以调节，从而实现对不同分子量物质的分离。
实验中，混合溶液中的组分通过凝胶层析柱时，分子量较大的物质由于无法进入凝胶孔道，只能沿着凝胶颗粒之间的缝隙流出，而分子量较小的物质则可以进入凝胶孔道内部，从而在凝胶层析柱中停留更长时间，最终实现分离。
三、实验结果与分析1. 实验现象（1）观察实验过程中，不同组分在凝胶层析柱中的洗脱顺序。
根据实验结果，分子量较大的组分先流出，而分子量较小的组分后流出。
（2）观察凝胶层析柱中凝胶颗粒的吸附情况。
实验过程中，凝胶颗粒对分子量较大的组分吸附作用较弱，而对分子量较小的组分吸附作用较强。
2. 实验数据分析（1）通过计算不同组分的洗脱时间，可以得出其分子量大小。
实验结果表明，分子量较大的组分先流出，而分子量较小的组分后流出，与理论预期相符。
（2）分析凝胶层析柱中凝胶颗粒的吸附情况，可以发现分子量较小的组分在凝胶层析柱中停留时间较长，说明凝胶颗粒对其吸附作用较强。
四、实验结论1. 凝胶层析法可以有效地对混合溶液中的不同组分进行分离，实现不同分子量物质的分离。
2. 凝胶层析法的分离效果受分子量大小、凝胶孔径、洗脱液等因素的影响。
在本实验中，分子量较大的组分先流出，而分子量较小的组分后流出，与理论预期相符。
3. 凝胶层析柱中凝胶颗粒对分子量较小的组分吸附作用较强，导致其在凝胶层析柱中停留时间较长。
4. 实验过程中，凝胶层析柱的装填、洗脱液的选择、流速的控制等操作对实验结果有较大影响。
在实际操作中，应严格控制实验条件，以提高分离效果。
五、实验展望1. 在今后的实验中，可以尝试改变凝胶孔径、洗脱液等因素，进一步优化实验条件，提高分离效果。
2. 探索凝胶层析技术在生物、医药、化工等领域的应用，为相关领域的研究提供技术支持。
凝胶层析_实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理和操作方法。
2. 掌握凝胶层析分离混合物中不同组分的基本技能。
3. 分析实验结果，验证实验原理。
二、实验原理凝胶层析是一种基于分子筛效应的分离技术。
该技术利用凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛，分子量不同的物质通过凝胶柱的速度也不同。
在凝胶层析实验中，样品被注入凝胶柱，随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱，从而实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：混合样品、葡聚糖凝胶、洗脱液（如蒸馏水、乙醇等）。
2. 实验仪器：凝胶层析柱、注射器、恒流泵、收集器、滤纸、烧杯等。
四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱，轻轻敲打柱底，使凝胶均匀分布。
2. 洗脱液平衡：将凝胶层析柱放入盛有洗脱液的烧杯中，使凝胶充分浸泡。
3. 样品制备：将混合样品与洗脱液按一定比例混合，制成样品溶液。
4. 注射样品：将样品溶液注入凝胶层析柱。
5. 收集分离组分：随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱。
将收集器放置在凝胶柱下方，收集分离组分。
6. 分析实验结果：观察收集到的组分，分析实验结果。
五、实验结果与分析1. 分离效果：通过凝胶层析实验，成功分离出混合样品中的不同组分。
2. 分组情况：根据收集到的组分，分析其分子量大小，确定分离效果。
3. 实验原理验证：实验结果表明，凝胶层析能够有效分离混合物中的不同组分，验证了实验原理。
六、实验讨论1. 凝胶层析的原理：凝胶层析的原理是基于分子筛效应，通过凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
2. 影响分离效果的因素：实验过程中，洗脱液的种类、流速、凝胶的孔径等因素会影响分离效果。
在实验中，应严格控制这些因素，以确保分离效果。
3. 实验结果分析：通过分析实验结果，可以了解不同组分在混合样品中的含量和分子量大小，为后续研究提供数据支持。
凝胶层析试验报告
凝胶层析试验报告凝胶层析试验报告一、实验目的凝胶层析（Gel Permeation Chromatography，GPC）是一种用于分析高分子化合物的重要方法，本实验的主要目的是：1.学习并掌握凝胶层析的基本原理和操作方法。
2.通过实验测定高分子样品分子量及其分布。
二、实验原理凝胶层析是基于分子大小不同的一种分离技术。
凝胶颗粒具有三维网络结构，其内部具有大量的孔隙。
当样品溶液通过凝胶床时，分子量较小的物质可以自由地进出这些孔隙，而分子量较大的物质则受到较大的阻力，因此它们在凝胶床中的移动速度不同，从而实现了不同分子量的物质分离。
三、实验步骤1.样品准备：取适量待测样品，用适当的溶剂溶解，保证样品浓度适宜。
2.凝胶色谱柱的安装：将凝胶色谱柱垂直固定，确保密封良好。
3.流动相的洗脱：用流动相（如水或其他适宜的溶剂）洗脱凝胶色谱柱，以排除气泡并稳定基线。
4.样品的上样：将准备好的样品溶液注入凝胶色谱柱，并用流动相定容。
5.洗脱与检测：在一定的流速下，用流动相连续洗脱样品，并通过近红外光谱仪或示差折光仪实时检测洗脱液的光学特性。
6.数据处理与分析：收集并记录洗脱液的光学特性数据，利用凝胶层析软件进行处理和分析。
四、实验结果及数据分析1.数据记录：记录每个时间点流经检测器的洗脱液的光学特性数据，如吸光度或折光率等。
这些数据可以转化为凝胶层析图谱。
2.数据处理：利用凝胶层析软件将收集到的光学特性数据转换为分子量数据。
该软件基于标准样品的分子量和其对应的光学特性数据建立标准曲线，然后根据样品的洗脱体积和其对应的光学特性数据计算分子量。
3.结果分析：根据实验数据，我们可以得出样品的分子量及其分布情况。
这些数据可以用于进一步的分析和理解高分子化合物的结构和性质。
五、结论本实验通过凝胶层析法成功测定了高分子样品的分子量及其分布。
实验结果表明，该样品的分子量分布较宽，表明该高分子化合物具有多分散性。
通过本实验，我们不仅学习并掌握了凝胶层析的基本原理和操作方法，而且得到了样品的分子量信息，这有助于我们进一步理解高分子化合物的结构和性质。
凝胶过滤层析实验报告
凝胶过滤层析实验报告凝胶过滤层析实验报告引言：凝胶过滤层析是一种常用的生化分离技术，广泛应用于蛋白质纯化、分析和富集等领域。
本实验旨在通过凝胶过滤层析的方法，对混合蛋白样品进行分离和纯化，探究其原理和应用。
材料与方法：1. 凝胶过滤层析柱：选择合适的分子量截留范围，如10 kDa。
2. 混合蛋白样品：包含多种蛋白质，分子量范围从10 kDa到100 kDa。
3. 缓冲液：选择适当的缓冲液，如PBS。
4. 装载样品：将混合蛋白样品与缓冲液按比例混合，使其浓度适当。
实验步骤：1. 准备凝胶过滤层析柱：将柱子连接到系统中，并进行预洗，以去除残留物和杂质。
2. 样品装载：将装载样品注入凝胶过滤层析柱中，注意不要过载。
3. 层析过程：使用缓冲液进行层析，使样品在柱子中通过，并收集出流液。
4. 收集样品：根据需要，可以分别收集不同分子量范围的样品。
结果与讨论：通过凝胶过滤层析实验，我们成功分离并纯化了混合蛋白样品。
在层析过程中，不同分子量的蛋白质通过凝胶过滤层析柱时，会受到凝胶孔径的限制，从而分离出不同大小的蛋白质。
较大分子量的蛋白质无法通过凝胶孔径，会在柱中滞留，而较小分子量的蛋白质则能够通过凝胶孔径，从柱中流出。
通过收集不同分子量范围的样品，我们可以得到纯化后的蛋白质。
这些蛋白质可以进一步进行质谱分析、酶活性检测等实验，以获取更多关于蛋白质的信息。
凝胶过滤层析方法具有许多优点。
首先，它是一种快速、简单且高效的分离技术。
其次，凝胶过滤层析柱具有较高的容量和稳定性，可以处理大量样品。
此外，凝胶过滤层析适用于多种样品类型，包括细胞裂解液、培养基和体液等。
然而，凝胶过滤层析也存在一些局限性。
首先，凝胶孔径的选择需要根据样品的分子量范围来确定，如果样品中存在分子量相近的蛋白质，则可能无法完全分离。
其次，凝胶过滤层析无法去除溶液中的小分子物质，如盐离子和小分子有机物，这些物质可能对后续实验产生影响。
结论：凝胶过滤层析是一种常用的生化分离技术，通过分子量选择性分离和纯化蛋白质。
层析柱效测定方法
层析柱效测定方法层析柱效测定方法（chromatographic column efficiency determination）是一种常用的分析方法，用于评估层析柱的分离效果和分离能力。
它是基于层析柱内物质的扩散和传质过程进行分析的。
层析柱是一种分离技术装置，由一系列填充物组成。
填充物通常是固体颗粒，具有特定的化学性质，用于分离混合物中的组分。
在层析柱内，混合物通过与填充物的相互作用，使组分分离出来。
层析柱效测定方法通过评估层析柱中物质的传质速率和峰形状，来判断层析柱的性能。
这种方法可以用于评估柱的分离效果、分离能力、分离度等指标，为柱的选择和优化提供依据。
层析柱效测定方法通常基于柱内物质的扩散和传质过程进行分析。
在柱内，混合物在填充物表面发生吸附，不同组分的吸附速率不同，导致分离。
通过测定柱内物质的扩散速率，可以评估层析柱的分离效果。
层析柱效测定方法可以通过测定柱内物质的保留时间、峰宽、峰高等参数进行分析。
保留时间是指物质从进样口进入柱内到出柱的时间，峰宽是指峰的宽度，峰高是指峰的高度。
这些参数可以通过实验测定，然后根据相关理论模型进行计算和分析。
层析柱效测定方法有多种实验方法和理论模型可供选择。
常用的方法包括质量平衡法、色谱法、逆向色谱法等。
这些方法在实验操作上有所差异，但都可以用于评估层析柱的分离效果和分离能力。
层析柱效测定方法在化学、生物、医药等领域都有广泛应用。
它可以用于分析混合物中的组分，研究物质的分离和纯化，以及评估柱的性能。
同时，层析柱效测定方法还可以用于优化柱的选择和操作条件，提高分离效果和分离能力。
层析柱效测定方法是一种常用的分析方法，用于评估层析柱的分离效果和分离能力。
它基于柱内物质的扩散和传质过程进行分析，通过测定保留时间、峰宽、峰高等参数来评估柱的性能。
层析柱效测定方法在化学、生物、医药等领域都有广泛应用，为分析、研究和优化提供了重要手段。
凝胶层析试验报告
摘要凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。
凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。
根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。
GFC一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。
本实验用凝胶色谱法对食用油中的甘油三酯进行了分离提取。
关键词：凝胶色谱甘油三酯食用油第一章简介凝胶层析法凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。
它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果。
一、凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。
如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用Sephadex G-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。
如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。
一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。
二、柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。
长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。
三、凝胶柱的制备凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。
自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。
凝胶层析实验
（6）上样：将柱中的5mmol/L pH6.0缓冲液逐渐放出，当液面接近柱床表 面时，用长吸管沿柱壁绕环小心加入E3，上样量控制在柱体积的2%-5% （千万不要冲坏柱床表面）；打开凝胶柱出口处的阀门，使样品缓慢、均匀 地进入柱床，然后用少量缓冲液清洗柱的内壁，并将清洗液也流入凝胶柱， 关闭凝胶柱出口处的阀门。 （7）洗脱：在凝胶上面缓慢加入缓冲液，连接恒压洗脱瓶，开始洗脱
实验操作
凝胶层析实验（老师完成）实来自操作1、教师汇总收集到E3的峰尖浓缩后进行凝胶层析实验 2、凝胶层析制E4
（1）装柱：将玻璃柱固定垂直，装入脱气的蒸馏水（约为柱体积的 1/3），以避免胶粒直接冲击柱底支持物；
（2）固定玻璃柱，调整垂直；
（3）装凝胶：边搅拌凝胶，边向柱内缓慢、连续、均匀地装入凝胶 (打开柱底端的螺旋夹）不要中断，使胶粒均匀沉降，以免胶面倾斜 和发生断层；
（8）收集：根据记录仪上的蛋白峰手工收集（或者用部分收集器收集）， 收集峰尖处的酶样品，用PEG6000浓缩后，用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。
有时间刷洗试管和血糖管及配制响应面的缓冲液（稀释不同浓度和pH的
缓冲液）
凝胶过滤层析实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶过滤层析的原理及操作步骤。
2. 掌握利用凝胶过滤层析法分离混合物中不同分子量蛋白质的方法。
3. 通过实验验证凝胶过滤层析法在蛋白质分离中的应用。
二、实验原理凝胶过滤层析法，又称分子筛层析法或凝胶过滤法，是一种根据分子大小进行分离的层析技术。
该技术利用凝胶的分子筛特性，将混合物中的不同分子量的物质分离。
凝胶是一种具有多孔结构的物质，孔径大小不一，当混合物通过凝胶层析柱时，大分子物质由于无法进入凝胶孔径，将直接通过层析柱；而小分子物质则可以进入凝胶孔径，从而在层析柱中停留较长时间，实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质混合物（含有已知分子量的标准蛋白质和未知分子量的蛋白质）- 凝胶层析柱（Sephadex G-75）- 洗脱液（磷酸盐缓冲液，pH 7.4）- 标准蛋白质（如牛血清白蛋白、卵清蛋白等）- 未知蛋白质样品2. 实验仪器：- 凝胶层析柱架- 凝胶层析柱- 量筒- 离心机- 分光光度计四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：将凝胶层析柱垂直放置于凝胶层析柱架上，用洗脱液平衡凝胶层析柱，直至洗脱液颜色清澈。
2. 加样：取一定量的蛋白质混合物，加入凝胶层析柱的顶部，用洗脱液冲洗，直至混合物完全进入层析柱。
3. 洗脱：用洗脱液缓慢冲洗层析柱，收集各部分洗脱液，分别测定其蛋白质含量。
4. 分离：根据洗脱液的蛋白质含量，绘制洗脱曲线，分析不同分子量蛋白质的分离情况。
5. 结果分析：根据标准蛋白质的分子量和洗脱曲线，推测未知蛋白质样品的分子量。
五、实验结果与分析1. 凝胶过滤层析柱平衡后，洗脱液颜色清澈，说明凝胶层析柱已准备就绪。
2. 洗脱过程中，标准蛋白质和未知蛋白质样品的洗脱曲线如下：- 标准蛋白质洗脱曲线：在洗脱曲线中，标准蛋白质的洗脱峰呈对称状，峰面积较大，说明分离效果较好。
- 未知蛋白质样品洗脱曲线：在洗脱曲线中，未知蛋白质样品的洗脱峰位置与标准蛋白质的洗脱峰位置不同，峰面积较小，说明分离效果较差。
凝胶层析实验报告
一、实验目的1. 理解凝胶层析的原理及其应用。
2. 掌握凝胶层析的基本操作技术。
3. 通过实验，分离并鉴定不同分子量的蛋白质。
二、实验原理凝胶层析，又称分子筛层析或凝胶过滤，是一种利用凝胶的分子筛效应进行分离纯化的技术。
凝胶具有多孔的网状结构，其孔径大小可通过交联度来调节。
当混合物通过凝胶层析柱时，不同分子量的物质在凝胶柱中受到的阻滞作用不同，从而实现分离。
分子量较大的物质无法进入凝胶颗粒的内部，只能沿着颗粒间的缝隙流出，因此流出柱子的速度较快；而分子量较小的物质可以进入凝胶颗粒的内部，受到的阻滞作用较大，流出速度较慢。
通过调节凝胶的孔径和洗脱液的流速，可以实现对混合物中不同分子量物质的分离。
三、实验材料1. 凝胶层析柱（1.5cm×30cm）2. 葡聚糖凝胶（Sephadex G-75）3. 蛋白质混合物（含有已知分子量的蛋白质和未知分子量的蛋白质）4. 标准蛋白质分子量对照品5. 洗脱液（0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 7.4）6. 紫外分光光度计7. 移液器8. 试管9. 烧杯10. 滤纸四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱，将葡聚糖凝胶用洗脱液浸泡过夜，使其充分膨胀。
2. 将浸泡好的凝胶层析柱垂直固定在支架上，用移液器将凝胶层析柱中的空气排尽。
3. 用移液器将蛋白质混合物加入凝胶层析柱中，使其刚好流过凝胶层析柱的顶部。
4. 将洗脱液缓慢加入凝胶层析柱中，使洗脱液流速保持恒定（约0.5ml/min）。
5. 收集洗脱液，每5ml收集一次，收集至蛋白质混合物完全流出。
6. 使用紫外分光光度计检测洗脱液中的蛋白质浓度，绘制蛋白质洗脱曲线。
7. 将收集到的洗脱液分别进行SDS-PAGE电泳，鉴定不同分子量的蛋白质。
五、实验结果与分析1. 蛋白质洗脱曲线通过蛋白质洗脱曲线，可以观察到不同分子量的蛋白质在凝胶层析过程中的洗脱时间。
分子量较大的蛋白质先流出柱子，而分子量较小的蛋白质后流出。
层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识
层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识一、实验目的和内容目的：1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法；2. 熟悉凝胶层析的一般过程；3. 了解凝胶介质的选择原则和应用领域。
内容：1. Sephadex G-50凝胶柱的装填；2. 凝胶柱柱效测定；3．凝胶再生的方法。
二、实验仪器和试剂1. 实验仪器层析柱（1×40 cm），砝码天平，玻璃棒，分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，滴头吸管2. 实验材料和试剂Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂）三、实验步骤清洗层析柱测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积根据Sephadex G-50的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量称取相应质量的干凝胶，加入其总吸液量10倍的0.02 mol/L PBS在100℃水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液（重复使用的填料，从此步开始）边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉积待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.5～1 mL/min)始终保护凝胶上端有一段液体准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切沿管壁将5%丙酮溶液0.6 mL小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起（参考完成时间11：30）打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子按加样操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次加入3－4 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽将层析柱进水口连通恒流泵，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连，用两根导线将检测仪与记录仪连接起来，设置好基线的位置洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.02mol/LpH8.0的PBS，以0.5～1 mL/min 流速洗脱，记录tr(记录仪纸速设为12cm/h，电压200mv；核酸蛋白监测仪检测波长254nm，灵敏度为0.1A)，计算单位高度的柱效（参考完成时间16：00）柱效计算公式：N = 5.54?［θr/( W 1/2)］2其中，θr为平均洗脱时间，W 1/2为半峰宽。
凝胶层析试验报告
凝胶层析试验报告首先，我们制备了一定浓度的SDS-凝胶。
制备过程中，我们按照实验要求将甘油胺修饰的蛋白样品加入到SDS-样品缓冲液中，然后将混合物加载到凝胶槽中。
同时，我们还将分子量标准品加载到凝胶的一侧，作为分子量标尺。
之后，我们通过电泳的方式让样品在凝胶中迁移。
首先我们设定电泳系统的电压和时间，并保持电流稳定运行。
期间，我们注意观察凝胶是否存在异常现象，如温度升高、电解液溢出等。
电泳结束后，我们将凝胶从电泳槽中取出，并放置在染色盒中。
接下来，我们进行染色和显影步骤。
首先，我们将染色剂溶液倒入染色盒中，然后将凝胶小心地放入盒中，确保凝胶完全浸泡在染色剂中。
染色时间一般为30分钟至1小时，根据染色剂的要求进行调整。
染色结束后，我们将染色剂排出，并用去离子水反复洗涤凝胶，使染色剂完全被洗去。
最后，我们在凝胶上观察和记录蛋白质的迁移和染色情况。
根据实验结果，我们发现样品中蛋白质分子量分布范围较广，主要集中在50kDa至200kDa之间。
具体来说，我们观察到了几个特定的蛋白质带。
首先，我们观察到了一个明显的带位于分子量标尺上的150kDa位置，这表明样品中存在一个分子量为150kDa的蛋白质。
其次，我们还观察到了一些较暗的带，它们位于分子量标尺上的100kDa左右和200kDa左右位置，分别代表样品中分子量约为100kDa和200kDa的蛋白质。
此外，我们还对样品中特定蛋白质的含量进行了定量分析。
通过将实验结果与标准曲线比对，我们可以计算出样品中该蛋白质的含量。
例如，我们发现样品中的蛋白质在凝胶上表现为一个较浓的带位于分子量标尺上的75kDa位置。
通过对标准曲线的分析，我们确定该带所代表的蛋白质浓度为200μg/mL。
综上所述，凝胶层析试验是一种简单有效的蛋白质分析方法。
通过该方法，我们可以确定蛋白质的分子量范围以及特定蛋白质的含量。
然而，需要注意的是，凝胶层析试验在蛋白质的分离和检测中存在一定的局限性，例如对于超大分子量的蛋白质会出现迁移受限的情况。
凝胶测试方法
当利用半透膜把两种不同浓度的溶液隔开时，浓度较低的溶液中的溶剂(如水)自动地透过半透膜流向浓度较高的溶液，直到化学位平衡为止的现象。
让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径有粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。
当聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子被排除在粒子的小孔之外，只能从粒子间的间隙通过，速率较快；而较小的分子可以进入粒子中的小孔，通过的速率要慢得多。
经过一定长度的色谱柱，分子根据相对分子质量被分开，相对分子质量大的在前面（即淋洗时间短），相对分子质量小的在后面（即淋洗时间长）。
自试样进柱到被淋洗出来，所接受到的淋出液总体积称为该试样的淋出体积。
当仪器和实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分子量有关，分子量愈大，其淋出体积愈小。
凝胶渗透层析就是按照溶质分子的大小不同而进行分离的一种层析技术。
当溶质分子大小不同的样品溶液通过凝胶柱时，由于凝胶颗粒内部的网络结构具有分子筛效应，分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。
分子量大的因不易渗入网络，被排阻在颗粒之外，因而所受到的阻滞作用小，1.凝胶颗粒2.中分子3.小分子4.大分子先流出层析床，分子量小的因能渗透到网络图1、凝胶渗透层析原理示意图内部洗脱流程长，因而所受到的阻滞作用大，后流出层析床，这样就可以达到分离的目的。
凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。
也叫做分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography）。
一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。
一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
凝胶柱层析实验报告
1. 理解凝胶柱层析的基本原理和操作步骤。
2. 掌握凝胶柱层析在分离和纯化生物大分子中的应用。
3. 分析实验结果，验证实验原理。
二、实验原理凝胶柱层析是一种常用的分离技术，主要用于分离分子量不同的生物大分子。
其原理是利用凝胶的分子筛效应，将混合物中的大分子、中分子和小分子进行分离。
凝胶是一种具有三维网状结构的物质，其孔径大小不同，大分子无法进入孔径较小的凝胶颗粒，而小分子则可以自由进出。
在实验中，样品溶液通过凝胶柱，不同分子量的物质将在凝胶柱中形成不同的洗脱峰，从而实现分离。
三、实验材料与仪器1. 材料：蛋白质样品、标准分子量蛋白质、凝胶柱、洗脱液、缓冲液等。
2. 仪器：凝胶柱层析仪、离心管、移液器、微量注射器、凝胶柱等。
四、实验步骤1. 准备凝胶柱：将凝胶柱垂直固定在凝胶柱层析仪上，用缓冲液平衡凝胶柱，使其达到稳定的操作状态。
2. 样品制备：将蛋白质样品与缓冲液混合，用移液器取适量样品加入凝胶柱。
3. 洗脱：用洗脱液缓慢洗脱凝胶柱，收集不同洗脱峰的样品。
4. 样品分析：将收集到的洗脱峰样品进行SDS-PAGE电泳分析，观察蛋白质分子量的变化。
五、实验结果与分析1. 凝胶柱层析分离结果：通过凝胶柱层析实验，成功地将蛋白质样品中的大分子、中分子和小分子分离。
洗脱峰1主要包含大分子蛋白质，洗脱峰2主要包含中分子蛋白质，洗脱峰3主要包含小分子蛋白质。
2. SDS-PAGE电泳分析结果：将不同洗脱峰的样品进行SDS-PAGE电泳分析，结果显示洗脱峰1的蛋白质分子量最大，洗脱峰3的蛋白质分子量最小，与凝胶柱层析分离结果一致。
1. 凝胶柱层析是一种有效的分离技术，可以用于分离分子量不同的生物大分子。
2. 通过凝胶柱层析实验，成功地将蛋白质样品中的大分子、中分子和小分子分离，并验证了实验原理。
3. 实验结果表明，凝胶柱层析与SDS-PAGE电泳分析相结合，可以实现对蛋白质分子量的准确测定。
七、实验注意事项1. 在进行凝胶柱层析实验时，应注意凝胶柱的平衡和操作状态，以保证实验结果的准确性。
凝胶色谱柱的柱效测定
凝胶色谱柱的柱效测定凝胶色谱法是一种基于分子大小分离的色谱技术，通过使用具有不同孔径的凝胶色谱柱，可以分离分子大小不同的物质。
凝胶色谱柱的柱效是衡量其分离效果的重要参数，下面将介绍凝胶色谱柱的柱效测定方法。
分离度分离度是衡量凝胶色谱柱分离效果的重要指标，它表示相邻两个峰之间的分离程度。
分离度通常用两个峰之间的分离距离来表示，分离距离越大，说明凝胶色谱柱的分离效果越好。
峰对称性峰对称性是指每个峰的形状是否对称，对称性越好，说明凝胶色谱柱的分离效果越好。
通过观察峰的形状，可以判断凝胶色谱柱的峰对称性。
峰高和峰面积峰高和峰面积是衡量凝胶色谱柱分离效果的指标之一。
峰高表示每个峰的高度，峰面积表示每个峰所占的面积。
通过测量峰高和峰面积，可以评估凝胶色谱柱的分离效果。
理论塔板数理论塔板数是衡量凝胶色谱柱分离效果的重要指标之一。
它表示凝胶色谱柱对于特定物质的分离能力，理论塔板数越大，说明凝胶色谱柱的分离效果越好。
分离时间分离时间是衡量凝胶色谱柱分离效果的指标之一。
它表示每个峰通过凝胶色谱柱所需的时间，分离时间越短，说明凝胶色谱柱的分离效果越好。
洗脱体积洗脱体积是衡量凝胶色谱柱分离效果的指标之一。
它表示将样品中各组分完全洗脱所需的洗脱液体积，洗脱体积越小，说明凝胶色谱柱的分离效果越好。
分辨率分辨率是衡量凝胶色谱柱分离效果的重要指标之一。
它表示相邻两个峰之间的分离程度与峰宽之比，分辨率越大，说明凝胶色谱柱的分离效果越好。
柱容量柱容量是衡量凝胶色谱柱能够承受的最大样品量的指标之一。
它表示凝胶色谱柱在达到饱和状态前能够承受的最大样品量，柱容量越大，说明凝胶色谱柱的处理能力越强。
葡聚糖凝胶层析试验报告
葡聚糖凝胶层析实验报告一、实验目的1、学习凝胶（Gel）层析法的基本原理;2、掌握葡聚糖凝胶（SephadeX）柱层析的操作技术。
二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）;而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。
一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂1、仪器：内直径为1cm，外直径为的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤 1 、装柱将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将 1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层 析柱中加入3-4ml 的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管 插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始 洗脱收集。
4、样品的检测酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在 测检测。
五、实验结果及分析 1、实验结果:2、蛋白质样品洗脱曲线:收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200 a I 到280nm 下收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为, 则计算：流速二每管体积/每管时间=3二min。
凝胶层析柱特性测试
凝胶层析柱特性分析（实验报告）实验日期：2015年4月21日实验温度：室温实验地点：生物化学与遗传学实验室指导老师：******班级：2013级生物技术1班姓名：***** 学号：******I. 实验目的1.掌握凝胶层析柱的基本原理；2.学习凝胶层析柱的操作技术；3.了解凝胶层析柱的应用。
II. 实验原理凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。
把含有不同大小分子的混合液，铺加在胶面上，让它流过凝胶柱。
由于凝胶具有网络结构，当混合液通过凝胶颗粒缝隙中时，溶液中的溶质凡是比网孔小的分子，都能自由进入颗粒内部，而比网孔大的分子则不能进入。
因此，在洗脱过程中，大分子物质必然先于小分子物质向下移行，先流出的是大分子物质，小分子物质后流出，从而达到分离的目的。
在凝胶层析中，凝胶粒子间隙的外水相当于移动相，粒子内水相当于固定相。
当溶质随洗脱液自上向下移动时，溶质在内水之间连续不断达成分配平衡。
相对分子质量大的因不易渗入凝胶孔内，分配系数较小，用较少的洗脱液就能从柱中洗脱出来；反之，相对分子质量小的因渗入凝胶孔内，分配系数较大，需较多的洗脱液才能从柱中洗脱出来。
为了精确地衡量混合物中某一被分离成分在一定的凝胶柱内的洗脱行为，常采用分配系数K d来衡量，K d的定义为：i oe d V VV K -=式中V e ——某一成分的洗脱体积，即从加入样品算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；V o ——层析柱内凝胶凝胶颗粒之间空隙的总体积，又称凝胶外水体积；V i——层析柱内部微孔的总体积，亦称为内水体积。
洗脱体积V e与V o及V i之间的关系可表示为：V e=V o+K d V i当某种成分的K d值为0时，意味着这种成分完全被排阻于凝胶建立的微孔之外而最先洗脱出来，即V e=V o。
可以用一个已知相对分子质量远远超过凝胶排阻极限的有色分子如常用蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床，可测出柱床的外水体积V o。
凝胶层析法测定.
蛋白质相对分子质量实验目的掌握凝胶层析的基本原理。
学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。
实验原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。
当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。
该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。
当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。
大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。
若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。
总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。
如果假定蛋白质分子近于球形，同时没有显著的水合作用，则不同大小分子量的蛋白质，在洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量的关系。
在一根凝胶柱中，凝胶颗粒间空隙所含水相体积为外水体积VＯ，不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为时VＯ，出现洗脱峰。
凝胶颗粒内部孔穴的总体积为内水体积Vi，能全部渗入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为VＯ+Vi时，出现洗脱峰。
利用Andrews的实验经验式：lgMr = a/b—Ve/bVo式中，Ve为洗脱体积。
它是自加样品开始到该组分的洗脱峰（峰顶）出现时所流出的体积。
Vo为外水体积，Mr为相对分子质量，a和b为常数。
葡聚糖凝胶有不同的型号，用于分离不同相对分子质量大小的物质。
凝胶层析实验报告
凝胶层析实验报告凝胶层析实验报告引言：凝胶层析是一种常用的生物分离技术，通过凝胶基质的孔隙大小和分子间作用力，对混合物中的生物大分子进行分离纯化。
本实验旨在通过凝胶层析技术，对不同分子量的蛋白质进行分离，并观察其迁移行为。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 凝胶层析柱：根据实验需要选择合适的凝胶材料，如聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。
- 样品：待分离的蛋白质混合物。
- 缓冲液：根据实验需要选择合适的缓冲液，如Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液等。
- 蛋白质标记物：用于确定凝胶层析柱的分离范围。
2. 实验方法：- 准备凝胶层析柱：根据实验需要选择合适的凝胶层析柱，并按照厂家提供的说明书进行柱床填充和预处理。
- 样品预处理：将待分离的蛋白质混合物进行预处理，如去除杂质、浓缩等。
- 样品加载：将经过预处理的样品加载到凝胶层析柱上，并使用缓冲液进行洗脱。
- 凝胶层析分离：根据分子量的大小，不同蛋白质将在凝胶层析柱中以不同的速率迁移。
- 分析与检测：收集分离后的样品，使用合适的检测方法进行分析，如SDS-PAGE、Western blot等。
实验结果与讨论：本实验选择了聚丙烯酰胺凝胶层析柱进行分离，样品为不同分子量的蛋白质混合物。
通过实验观察，发现较大分子量的蛋白质在凝胶层析柱中迁移速度较慢，而较小分子量的蛋白质则迁移速度较快。
这是由于凝胶基质的孔隙大小限制了蛋白质的迁移，较大分子量的蛋白质难以通过较小的孔隙，因此迁移速度较慢。
此外，我们还使用了蛋白质标记物来确定凝胶层析柱的分离范围。
通过观察标记物的迁移位置，可以确定凝胶层析柱的分离效果和分离范围。
实验结果显示，标记物在凝胶层析柱中呈现出明显的分离带，证明了凝胶层析的有效性和准确性。
凝胶层析技术在生物分离纯化领域具有广泛的应用。
通过选择不同的凝胶材料和缓冲液，可以实现对不同生物大分子的分离纯化。
同时，凝胶层析技术还可以与其他分析方法相结合，如质谱分析、免疫学检测等，进一步提高分析的准确性和灵敏度。
葡聚糖凝胶柱层析
4.2、凝胶的几种主要类型：
1、天然凝胶： 马铃薯淀粉凝胶、琼脂及琼脂糖凝胶 。
2、人工合成凝胶： 聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖凝胶 。
葡聚糖凝胶 的型号：
目前，凝胶层析法中使用最广泛的一类层析凝胶， 商品名称：Sephadex。其基本骨架是葡聚糖，它是 由右旋葡萄糖残基通过α－1，6糖苷键连接而成， 葡聚糖分子之间通过醚桥（甘油基）交联形成三维 空间网状结构。
Fine SephadexG-25
Superfine SephadexG-50 Coarse SephadexG-50
Medium SephadexG-50
Fine SephadexG-50
Superfine SephadexG-75 SephadexG-75
Superfine SephadexG-100 SephadexG-100 Superfine SephadexG-150 SephadexG-150 Superfine SephadexG-200 SephadexG-200 Superfine
凝胶过滤介质 名称
SephadexG-10 SephadexG-15 SephadexG-25
Coarse SephadexG-25
Medium SephadexG-25
Fine SephadexG-25
Superfine SephadexG-50 Coarse SephadexG-50
Medium SephadexG-50
6
2
2~5
2~10 9~11
6
2
2~5
2~10 9~11
6
2
2~5
2~10 12~15
24 3
72
2~10 12~15
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凝胶层析柱特性分析
（实验报告）
实验日期：2015年4月21日实验温度：室温
实验地点：生物化学与遗传学实验室指导老师：******
班级：2013级生物技术1班姓名：***** 学号：******
I. 实验目的
1.掌握凝胶层析柱的基本原理；
2.学习凝胶层析柱的操作技术；
3.了解凝胶层析柱的应用。
II. 实验原理
凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。
把含有不同大小分子的混合液，铺加在胶面上，让它流过凝胶柱。
由于凝胶具有网络结构，当混合液通过凝胶颗粒缝隙中时，溶液中的溶质凡是比网孔小的分子，都能自由进入颗粒内部，而比网孔大的分子则不能进入。
因此，在洗脱过程中，大分子物质必然先于小分子物质向下移行，先流出的是大分子物质，小分子物质后流出，从而达到分离的目的。
在凝胶层析中，凝胶粒子间隙的外水相当于移动相，粒子内水相当于固定相。
当溶质随洗脱液自上向下移动时，溶质在内水之间连续不断达成分配平衡。
相对分子质量大的因不易渗入凝胶孔内，分配系数较小，用较少的洗脱液就能从
柱中洗脱出来；反之，相对分子质量小的因渗入凝胶孔内，分配系数较大，需较多的洗脱液才能从柱中洗脱出来。
为了精确地衡量混合物中某一被分离成分在一定的凝胶柱内的洗脱行为，常采用分配系数K d来衡量，K d的定义为：
i o
e d V V
V K -
=
式中V e ——某一成分的洗脱体积，即从加入样品算起，
到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；
V o ——层析柱内凝胶凝胶颗粒之间空隙的总体积，
又称凝胶外水体积；
V i——层析柱内部微孔的总体积，亦称为内水体积。
洗脱体积V e与V o及V i之间的关系可表示为：
V e=V o+K d V i
当某种成分的K d值为0时，意味着这种成分完全被排阻于凝胶建立的微孔之外而最先洗脱出来，即V e=V o。
可以用一个已知相对分子质量远远超过凝胶排阻极限的有色分
子如常用蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床，可测出柱床的外水体积V o。
当另一种成分的K d=1时，意味着这一成分完全不被排阻，它可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，在洗脱过程中它将最后流出柱外，V e=V o+V i。
处于上述极端情况（即分子最大与最小）之间的那些分
子，它们K d 值在大于0小于1的范围内。
由此可见，K d 值得大小序列决定了被分离物质流出层析柱的顺序。
K d 只与被分离物质分子的大小和凝胶孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关。
将凝胶装柱后，柱床总体积V t 是三种体积的总和，即凝胶颗粒外水体积V o 、凝胶颗粒内部的体积V i 和干凝胶颗粒体积V g 之和：V t =V o +V i +V g 。
V t 可从柱的直径d 和高度h 计算：1/4πd 2h 。
用有效分配系数（K av ）代替K d ，其定义为：
o t o e av V V V V K --=
本实验使用蓝色葡聚糖凝胶Sephadex G-50，其适用的相对分子质量范围在500～10000葡聚糖（线性分子）和1500～30000之间的多肽与蛋白质的分离。
已含蓝色葡聚糖2000（相对分子质量在200万以上，呈蓝色）、细胞色素C （相对分子质量12400，呈红色）、铁氰化钾[K 3Fe(CN)6，相对分子质量329.26，呈黄色]的混合液做样品。
当混合液流经G-50色谱柱时，三种有色物质因K d 不同，分级分离明显可见。
通过作洗脱曲线可以计算出凝胶层析的特性参数。
III. 实验试剂与仪器
1.实验试剂
Sephadex G-50，蓝色葡聚糖-2000，细胞色素C ，铁氰化钾K 3[Fe(CN)6]，洗脱液Tris-HCl （0.05mol/L pH 7.5）。
2.实验器材
层析玻璃管（1cm×20cm），试管，烧杯，注射器，滴管、微量移液器，玻璃棒等。
IV.实验操作步骤
1. 凝胶溶胀称取3gSephadex G-50加入到50mL 蒸馏水中，沸水溶胀2h。
用倾斜法除去凝胶上层水及细颗粒，以蒸馏水反复倾洗3～4次（此时无细小颗粒），再用0.05mol/L Tris-HCl（pH 7.5）洗脱洗涤后，将凝胶保存在洗脱液内。
2. 装柱将层析柱垂直地安装好，柱内装入洗脱液（dH2O），排除层析柱板下的空气泡，关闭底部出口，柱内留下约柱体积四分之一的洗脱液。
加入搅拌均匀的Sephadex G-50的浆液，浆液不可太稀或太粘稠。
装填时用一根玻璃棒，让浆液沿玻棒流入柱内（注射器灌柱，控制高度），同时打开柱底部出口，调流速0.3mL/min（10～12滴/min）。
凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部，不断补入均匀的浆液直到凝胶床高15cm为止，关闭出口。
操作过程中注意决不能让凝胶床表面露出液面，装填时尽量一次装完，防止凝胶床出现“纹路”和气泡。
（注：凝胶装填完毕后，剪一张滤纸片置于凝胶上端）
3. 加样用洗脱液分别配成6mg/mL的蓝色葡聚糖
-2000、8mg/mL的细胞色素C、5mg/mL的铁氰化钾三种溶液，然后三种溶液等体积混匀，取0.18mL混合液上样。
先
用滴管吸去凝胶床上面大部分液体，打开出口使洗脱液恰好流到床表面为止，关闭出口（打开开关将多余液体放至滤纸，关闭开关加入洗脱液，洗柱调节流速10～12滴/min），（将柱内洗脱液放至滤纸，不得残余液体，取混合样品加入柱内）用滴管（滴管使用原则：尽量接近凝胶面或液面，垂直悬空靠近）小心地将上述样品加于柱床上成一薄层，切勿搅动床表面（一次加入柱内，将样品全部加入柱内至滤纸，关闭开关加入适量洗脱液，开始收集）。
打开出口使样品溶液渗入凝胶内，并开始收集并计量流出液体积。
当样品溶液流至与凝胶界面相平时，立即用滴管取极少量洗脱液轻轻冲洗管壁两次，使残余样液全部渗入凝胶床内，当液面降至床表面时，再加入洗脱液进行连续洗脱。
4. 洗脱与收集调节洗脱液流速为0.3mL/min（10～12滴/min）（已完成），仔细观察记录样品在层析柱内的分离现象，收集并量取洗脱液体积，当收集达6.0mL时，换小试管每隔0.3mL收集一管，用肉眼观察颜色深浅，以“-、+、++、+++”符号记录三种物质洗脱液的颜色变化。
（注：先出液收集：只记滴数。
蓝色色带接近凝胶底部开始收集。
每管20滴）
V. 实验结果分析
1.绘制洗脱曲线：
以洗脱体积为横坐标，洗脱液的颜色强度为纵坐标作洗
脱曲线。
洗脱液颜色强度变化表
管号
1 2 3 4 5 6 7 8 9
蓝色葡聚糖- + +++ + - - - - - 细胞色素C - - - + +++ ++ ++ ++ ++ 铁氰化钾- - - - - - - - -
管号10 11 12 13 14 15 16
蓝色葡聚糖- - - - - - -
细胞色素C + + - - - - -
铁氰化钾+ + +++ ++ + + -
2.计算凝胶柱Vt、V o及各成分的Ve和Kav
①每滴0.05mL每管20滴未收集部分的体积98滴98×0.05mL=4.9mL
②外水体积V o=4.9+0.05×20+0.05×20=6.9mL
柱体积V t=4.9+0.05×4×20+0.05×2×20/2=9.9mL
③K蓝色葡聚糖-2000=V e－V o/V t－V o=0（V e=V o）
K铁氰化钾=V e－V o/V t－V o=1（V e=V t）
VI. 注意事项
1.平时放置冰箱，取出放室温；
2.架柱垂直防漏放一半dH2O；
3.凝胶使用完毕回收。